Summary
תסיסנית שניידר (S2) הם תאים מערכת פופולרי יותר ויותר על גילוי וניתוח פונקציונלי של גנים. המטרה שלנו היא לתאר כמה טכניקות להפוך תאים מיקרוסקופיים S2 כגון מערכת ניסיונית חשוב יותר ויותר.
Abstract
מערכת הניסוי האידיאלי יהיה זול וקל לתחזוקה, מקובל מגוון רחב של טכניקות, יהיה נתמך על ידי ספרות ענפה רצף הגנום באתר. בתרבית תאים תסיסנית S2, תוצר של 20-24 עוברים משויך 1 שעה הישן, בעל כל התכונות האלה. כתוצאה מכך, התאים S2 הם מאוד מתאימים לניתוח של תהליכים תאיים, כולל גילוי הגנים המקודדים את המרכיבים המולקולריים של תהליך או מנגנון של עניין. התכונות של תאים S2 שאחראים ביותר עבור השירות שלהם הקלות שבה הם נשמרים, רגישות מופלאה שלהם להפרעות פעמיים תקועים RNA בתיווך (DS) (RNAi), ו נהילות שלהם מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמו גם לחיות או קבוע תאים.
תאים S2 ניתן לגדל מגוון רחב של כלי התקשורת, כולל מספר זול, זמין מסחרית, מלא מוגדרים, סרום ללא התקשורת 2. בנוסף, הם גדלים בצורה אופטימלית ובמהירות על 21-24 מעלות צלזיוס, יכול להיות מתורבת במגוון רחב של מיכלים. שלא כמו בתאי יונקים, תאים S2 אינם דורשים אווירה מוסדר, אך במקום לעשות היטב עם אוויר רגיל יכול אפילו להיות נשמר צלוחיות אטום.
משלימים את הקלות של RNAi בתאים S2 היא היכולת לנתח בקלות פנוטיפים בניסוי המושרה על ידי שלב או מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים קבוע או לחיות. תאים S2 לגדול בתרבות כמו בשכבה יחידה, אבל לא להציג עיכוב קשר. במקום זאת, תאים נוטים לגדול במושבות בתרבויות צפופה. באותה צפיפות נמוכה, תרבויות S2 גדל על זכוכית או תרבות שטופלו פלסטיק רקמות עגולות רופף המצורפת. עם זאת, ציטולוגיה של תאים S2 ניתן לשפר במידה ניכרת בכך שפיתה אותם לשטח נרחב על ידי culturing בקצרה אותם על משטח מצופה לקטינים, concanavalin (ConA) 3. תאים S2 יכול להיות גם transfected ביציבות עם סמנים fluorescently-tagged למבנים תווית או אברונים עניין בתאים חיים או קבוע. לכן, התרחיש הרגיל עבור ניתוח מיקרוסקופי של תאים היא זו: הראשונה, תאים S2 (אשר יכול להחזיק transgenes להביע סמנים מתויג) מטופלים על ידי RNAi לחסל את חלבון המטרה (ים). זמן RNAi הטיפול יכול להיות מותאם כדי לאפשר הבדלים חלבון להתהפך קינטיקה כדי למזער טראומה תא / מוות אם חלבון המטרה חשובה הכדאיות. בשלב הבא, בתאים שטופלו מועברים מאכל המכיל coverslip מראש מצופה conA לגרום לתאים להתפשט בחוזקה לדבוק הזכוכית. לבסוף, התאים הם צילמו עם הבחירה של החוקר מצבי במיקרוסקופ. תאים S2 טובים במיוחד ללימודי הדורשים ראיה מורחבת של תאים חיים מאז תאים אלה להישאר בריאים בטמפרטורת החדר ואת האווירה נורמלי.
Protocol
1. הכנת התאים S2 עבור מיקרוסקופיה
תאים שניידר S2 הופקו מעוברים מאוחר trypsinized אורגון R תסיסנית. התרבות המקורית של שניידר מורכב מתערובת של סוגי תאים, אך הפכה הומוגנית יותר עם חלוף המשיכו 1. הם תוארו כמי macrophage דמויי (הם phagocytic) בהבעת hemocyte כמו גן. תאים S2 ניתן לקבל ATCC, DGRC, או Invitrogen.
א מבחר בינוני צמיחה
מספר כלי התקשורת שימשו תאים תרבות S2. איש התקשורת שהוזכרו להלן דורשים 5% CO 2 באטמוספירה.
- שניידר במקור השתמשו מוגדר בינוני שלה (תסיסנית שניידר בינוני) בתוספת סרום חום מומת 10% שור העובר (FBS). בעוד FBS עושה המדיום הזה יקר יותר בסרום ללא התקשורת שהוזכרו להלן, יש autofluorescence נמוכה יחסית ולכן היא בחירה טובה עבור מיקרוסקופיה epifluorescence של תאים חיים. עם זאת, הוא אינו מכיל מספיק ברזל כדי לעורר רמה נמוכה של ביטוי transgenes אלה תחת שליטה של האמרגן ועין מתנהלת metallothionein (למשל, גנים subcloned לתוך וקטור של Invitrogen PMT), גרימת הביטוי "דולפים" של הגן, לפני הגיוס.
- מספר סרום ללא מדיה זמינים מסחרית (לדוגמה, Sf900 השנייה, HyClone SFX, חרקים, חרקים ו-Xpress). התקשורת אלו הם זולים יחסית, אבל בדרך כלל לעורר רמות גבוהות יותר של ביטוי בעת שימוש metallothionein האמרגן-מוסדר transgenes לעומת בינוני של שניידר. יתר על כן, אלה התקשורת לייצר autofluorescence משמעותי לעומת בינוני "שניידר האמידה / FBS (שיקול חשוב בעת ביצוע מיקרוסקופ פלואורסצנטי תא חי).
- לחלופין, אנטיביוטיקה ניתן להוסיף המדיום, אלה הם בדרך כלל פניצילין G ו סולפט סטרפטומיצין (5-10 יחידות / מ"ל ו - 50-100 מיקרוגרם / מ"ל בריכוז הסופי, בהתאמה). כמו כן, מגיב אנטי פטרייתי, amphotericin B, ניתן להוסיף 250 נ"ג / מ"ל (ריכוז סופי).
ב תנאים תרבות
תאים S2 נשמרות בקלות תחת טמפרטורה מעבדה רגילים ותנאי האווירה. כאשר הדמיה בתאים חיים S2 עבור פעמים המורחבת, הגורמים העיקריים של מוות של תאים הן התייבשות צילום רעילות. התייבשות היא למנוע בקלות על ידי שמירה על מדיום מספיק בצלחת על המיקרוסקופ. Photo-רעילות היא בעיה מסובך שדורש צמצום החשיפה המצטברת של התאים בעוצמה גבוהה, עתירי אנרגיה אור בעוד הדמיה מספיק קרובות כדי ללכוד אירועים מעניינים עם רזולוציה במרחב ובזמן הולם.
- תאים S2 גוברת על פלסטיק בתרבית רקמה מעוגלים בדרך כלל חסיד רופף. תאים ומחוברות לגדול ככל monolayer צפוף ואחר כך, יותר ויותר, יותר תאים יהיה להמריא ולגדול ההשעיה. עבור מיקרוסקופיה של שני תאים קבוע לחיות, הדמיה הוא השתפר מאוד אם התאים הם המושרה לשטח על גבי פתק את המכסה. טריק זה המתואר להלן (2. 2 א.).
2. מיקרוסקופית של תאים S2
א מיקרוסקופיה תא חי
אנו משתמשים מיקרוסקופים הפוכה לדמיין תאים S2 לחיות מצופה זכוכית על תחתית הכלים. הזכוכית התחתונה הכלים המתוארים להלן ימשיכו התאים במצב דומה מאוד למצב culturing הרגילה שלהם, וגם מאפשר תאים חיים כדי להיבחן מבעד לזכוכית מיקרוסקופ כיתה.
- הכנת זכוכית התחתונה מנות
רכיבים:- Sylgard 184 אלסטומר סיליקון ערכת
זהו דבק לצרף את תלושי לכסות את הכלים. בערכה יש שני חלקים, בסיס שרף רכיב סוכן ריפוי, כי הם מעורבים ב (שרף: סוכן ריפוי) 10:01 יחס משקל רק לפני השימוש.
כדי להכין את התערובת שרף / ריפוי הסוכן:- לשקול לצאת בערך 5 גרם של שרף לתוך פלסטיק לשקול סירה. שים לב למשקל של שרף.
- לחשב כמה סוכן ריפוי נדרש על ידי הכפלת משקל שרף על ידי 0.1. הוסף סכום של סוכן ריפוי לסירה לשקול אותו באמצעות העברת pipet חדש.
- מערבבים היטב כדי לערבב את המרכיבים. אל תדאג את הבועות שמופיעות, הם לאט לאט נעלמים.
- דבק מוכן עכשיו. יש לו עקביות כמו דבש יהיה שמיש במשך שעה לפחות. 5.5 גרם של דבק מספיק כדי לגרום בערך 75 מנות, אבל זה תלוי איך אתה קמצן כאשר תחיל את הדבק.
- פלסטיק 35mm פטרי מנות
אנחנו לא משתמשים תרבית תאים מנות בכיתה משום שאנו מעוניינים רק תאים שיש לצרף אל תחתית זכוכית (ולא פלסטיק) - אז במקום שאנחנו משתמשים יותר זול, צלחות פטרי סטנדרטי. כמה שלבים יש מיקרוסקופ מלחציים מעגלי להחזיק 35מנות מ"מ; אם יש לך את זה, להיות בטוח כי המנות שלך יתאים מהדק. באופן מפתיע, לא כל המנות 35mm יש הקוטר החיצוני זהה. - כיסוי זכוכית
בחר תלושי כיסוי הולם מיקרוסקופ שלך ואת הצרכים. כל דבר מן הכוס המומחיות יקר עם צילום חרוט רשתות (לדוגמה, מדעי מיקרוסקופית אלקטרונים, 23x23 מ"מ עגול, gridded, לא. 2, חתול. לא. 72264-23) כדי זכוכית הרבה יותר זול בתפזורת לכסות (לדוגמה, VWR, 22x22 מ"מ זכוכית מרובע , לא. 1.5, חתול. לא. 48366-227) יכול לשמש. זהירות: זכוכית חייב להיות מעט גדול יותר (לפחות כ - 1 מ"מ) מאשר החור שאתה תעשה בצלחת פטרי, והוא חייב גם להיות קטן יותר מאשר קוטר של המנה. אם אתם מתכוונים לקנות זכוכית מרובע, להיות בטוח כי הזכוכית יהיה לכסות לחלוטין (וגם להרחיב קצת מעבר) את החור העגול, אך לא יגיעו הצדדים של המנה. אם אתה מעדיף לנקות זכוכית לכסות שלך, לעשות זאת לפני הדבקה להם את הכלים. - מקדח חשמלי
אנו משתמשים מקדח יד עם מהירות משתנה כפתור נעילה לשימוש מתמשך. מנות קידוחים הרבה יותר קל עם העיתונות תרגיל, אבל ייצור בקנה מידה קטן של זכוכית התחתונה מנות אינו מצדיק רכישה של העיתונות תרגיל. - מקדחה קצת
השתמש בשמו ¾ אינץ' לקדוח קצת (קצת בשמו הוא בתמונה בדף אינטרנט זה: http://en.wikipedia.org/wiki/Drill_bit). כמובן, בקוטר של קצת קובע את הקוטר של החור התחתון של המנה. - חרוטי לקדוח קצת טחינה
השתמש קצת conically בצורת טחינה עם חצץ גס בקוטר בערך כמו קצת את האת. אחרי כל החורים כבר קדחו, להשתמש קצת ספחת משם שברי פלסטיק בקצה של החור כי הפרויקט מהחלק התחתון של המנה. שברי פלסטיק על הפנים החיצוני של המנה תמנע זכוכית לכסות מישיבה הסומק נגד המנה. אל תדאג חתיכות פלסטיק קטן מזדקר לתוך הפנים של המנה: הם לא ישפיעו על זכוכית או לכסות את התאים. - תיבת קלקר עם קירות עבים
זה משמש משטח הקידוח. כיסוי צד אחד החיצוני של התיבה קלקר עם רצועות של נייר דבק איטום (אנו משתמשים 1.5 אינץ' הקלטת איטום סקוטש); את הקלטת איטום ממזער את הבריחה של פיסות קלקר בעוד קידוח.
הרכבה- מניחים את החצי התחתון של צלחת פטרי 35mm על פני השטח מודבק התיבה של קלקר, במקום את המנה כך של הצד התחתון שלה הוא נגד בתיבת הקלקר. בעוד מחזיק את הצדדים של המנה בתקיפות, לקדוח חור דרך המנה. זהירות: האצבעות שלך מחזיק את המנה יהיה שבריר של סנטימטר של קצת מקדח מסתובב. באופן טבעי, זה מסוכן. עצור אם קידוח צלחת מתחיל להסתחרר. אם יש לך מקדחה ו / או דרך חכמה כדי להחזיק את המנה בתקיפות, להשתמש בהם. אנחנו אף פעם לא היתה תאונה, אלא לעשות כל מה שאתה צריך לעשות הליך זה בטוח.
- לאחר קידוח כל הכלים שלכם, להחליק את שפת מחוץ חורים באמצעות מקדח קצת טחינה. אנחנו במקום מקדחה על צידו, עם קצת מקרין החוצה מעבר לקצה הדלפק. התרגיל נערך במקום על ידי הצבת משהו כבד וגמיש אבל על זה (אנחנו משתמשים הכבדות שקית פלסטיק ובה 10kg של חול). השתמשו בכפתור נעילה לשמור על התרגיל ברציפות, ולאחר מכן חלק שולי כל הכלים שלך על ידי לחיצה כל צלחת ומרגש זה קצת נגד שחיקה כדי להחליק את הקצה המחוספס של החור החדש.
- מכניסים את כל תחתית צלחת בכוס גדולה לשטוף אותם מספר פעמים עם מים מזוקקים כדי להסיר את קטן, חלקים רופפים של פלסטיק או קלקר (אשר יצופו). לאחר מכן, להניח את תחתית צלחת לייבוש.
- כאשר המנות יבש, להכין 184 דבק Sylgard שלך. החל עיגול קטן של דבק סביב החור קדח על פני השטח החיצוני של כל מנה. הדבק לא הרבה נדרש, למעשה, דבק יותר מדי יעשה בלגן. מניחים מכסה זכוכית מעל החור, במגע עם הדבק. הזכוכית המכסה צריך לשבת מול צלחת חלקה באופן שווה. אם הדבק לא הופץ בצורה מושלמת סביב החור, אז אולי יש פערים קטנים שבהם דבק חסר בין הזכוכית המכסה לתחתית צלחת. בתחילה לא לדאוג פערים אלה; בדרך כלל דבק יהיה להתגנב פערים אלה כדי למלא אותם.
- אחרי הדבקה על כל זכוכית את הכיסוי, לחזור ולבדוק את הכלים על הפערים לא נסגרו על ידי דבק. באותו פער כלשהו, להחיל טיפה קטנה של דבק לקצה זכוכית המכסה ליד הפער; דבק יהיה הפתיל לתוך הפער.
- הגדר את הכלים הצידה, הצד התחתון כלפי מעלה, לייבוש. זה יכול לקחת יום או יותר בטמפרטורת החדר, אבל אתה יכול להגביר את קצב ריפוי על ידי לשים את הכלים חממה חם.
- אם אתה צריך כלים סטריליים, שמים את תחתית צלחת ומכסים במכסה המנוע תרבות רקמות ופרש אותם. אל תשים את המכסים על תחתית צלחת. במקום זאת, להפוך את החלקים כך משטחים הפנימי שלהם הם חמורותctly מול נורת UV. כבה את האור UV לחיטוי דקות לפחות 45. אם אתם מתכננים מעיל ConA את הכלים (ראה להלן), לא לעקר את הכלים עד לאחר שהם מצופים.
- המנות כעת מוכן לשימוש.
- Sylgard 184 אלסטומר סיליקון ערכת
- שימוש concanavalin
לקטינים, concanavalin (ConA), נמצאה לעורר תאים S2 לשטח על משטח מצופה ConA 3. כאשר תאים S2 הם זורעים על גבי תלושי לכסות מצופה ConA, הם מתפשטים והופכים דגימות מצוין במיקרוסקופ.- כדי ConA תלושי מעיל רגיל לכסות, להפיץ את תלושי לכסות ניקה על גבי פיסת Parafilm מודבק למטה למעלה ספסל. מקום 10 μLs פתרון מ"ג / מ"ל של 0.5 ConA (במים סטריליים) על פני השטח של כל תלוש לכסות, ואז להפיץ את החומר מעל כל להחליק את המכסה. לאחר ייבוש, לאחסן את תלושי לכסות במיכל, נקי ויבש. זכוכית מצופה ניתן לעקר עם אור UV במנדף בתרבית רקמה.
- כדי ConA זכוכית התחתונה מנות מעיל, בדומה להפיץ 10 μLs הפתרון ConA על הצד העליון (כלומר, המכסה בצד הפונה) של הזכוכית. לאחר ייבוש, המנות ניתן לעקר כמתואר לעיל. ConA מצופה כלים או coverslips מאוחסנות בטמפרטורת החדר וניתן להשתמש חודשים לאחר הכנה.
- הדמיה
- בעדינות resuspend RNAi שטופלו בתאים S2 ולהעבירם צלחת ConA מצופה זכוכית התחתונה, המכיל 2 MLS של המדיום. תאים בריאים כי פנה להחליק ConA מצופה לכסות תדבק בחוזקה זה ומתחילים להתפשט. תהליך זה צריך להתברר על ידי כ -15 דקות, וצריך להשלים על ידי דקות 45-1 שעות. שים לב כי תאים המצורפת לא יכול לבצע cytokinesis בשל הקשר הדוק שלהם אל פני השטח ConA מצופה ויהפוך polyploid לאורך זמן. זורעים תאים לתוך ConA מצופה מנות יישארו בריאים במשך תקופות ממושכות, אך לא להתרבות במאכלים אלו.
- אחרי התאים המצורפת, המדיום יכול להיות אם החליפו את המדיום הישן autofluorescent. זה לא ייתכן שיהיה צורך ללימודי באמצעות מיקרוסקופים confocal או deconvolution או רחב בתחום מיקרוסקופים עם עומק השדה של מטרות קטנות.
- מאז תאים בריאים S2 בטמפרטורת החדר / אווירה נורמלי, אז אין תנאים מיוחדים או ציוד נדרשים כאשר התאים על המיקרוסקופ. לעתים קרובות אנו לוקחים זמן זמן לשגות סרטים S2 של תאים חיים. בפועל, זמן הריצה של ניסויים אלה היא מוגבלת על ידי הבעיות הרגילות של photobleaching ו phototoxicity.
ב במיקרוסקופ תאים קבוע
- זכוכית התחתונה מנות לעומת תלושי לכסות פשוטה: כל אחד מהם יכול לשמש כאשר תיקון התאים. בעת שימוש תלושי מכסה רגיל, במקום להחליק יחיד ConA מצופה לכסות לתוך צלחת 35mm בודדים (אשר לא צריך להיות תרבות כיתה רקמות), להוסיף 2 MLS של התקשורת, ולאחר מכן להעביר את RNAi בתאים שטופלו לתוך המנה. אחרי התאים המחוברים להחליק את המכסה, הסר את המדיום, בקצרה לשטוף את התאים עם חיץ מתאים (PBS עובד היטב), ומוסיפים את מקבע (ראה להלן) המנה. לאחר מכן, להחליק את הכיסוי ניתן להסיר את המנה ואת עיבוד נוסף, למשל, על ידי immunostaining.
- קיבוע: מגוון שיטות שימשו כדי לתקן תאים S2. השיטה הטובה ביותר קיבעון ייקבע על ידי כמה טוב מקבע שומרת תכונות של עניין, מבלי להרוס או לאבד epitopes או החלבונים המתויגים. הליכים מסוימים דורשים צעד לפני מיצוי קיבעון על מנת לחשוף את epitopes של כמה חלבונים הממוקם מבנים צפופים או קומפקטית. מאז הספרות תא S2 הוא נרחב למדי, זה בדרך כלל ניתן למצוא שיטה שפורסם באופן אופטימלי לתקן את מבנה התא S2 העניין שלך.
- מתנול הוא מקבע משותף. מתנול צריך להיות קר (לפחות -20 ° C) anhydrous (מסננות מולקולריות [3A סוג] ניתן להוסיף מתנול למים מופשט). אנו צמרמורת על 300 MLS של מתנול נטול מים בכוס מכוסה זכוכית 1 ליטר ב במקפיא פיצוץ הוכחה 20 מעלות צלזיוס. כאשר מתנול קר, להסיר אותו מהמקפיא, להסיר במהירות את המדיום מתוך צלחת זכוכית התחתון (או מאכל המכיל להחליק לכסות), ולאחר מכן לצלול במהירות את המנה לתוך מתנול ולהשאיר אותו שם. כוס של מתנול בדרך כלל מחזיקה כתריסר מנות. עבודה במהירות ולהחזיר את הגביע (המכיל את הכלים) למקפיא בהקדם האפשרי. קיבוע תושלם בתוך 10-15 דקות. לאחר מכן, להסיר את הכלים מן הקנקן, לשפוך את כל מתנול שנותרו להם, רעננותם אותם על ידי הוספת PBS טריטון / 0.1% X-100. עכשיו הם מוכנים נהלים מכתים סטנדרטי.
- פורמלדהיד הוא עוד מקבע משותף. אנו משתמשים פורמלדהיד 10% חיץ (PBS מקובל, אבל להשתמש חיץ המתאים ביותר לצרכים שלך). אנו משתמשים ריכוז גבוה יחסית של פורמלדהיד, כי התאים S2חוסר חוטים ביניים cytoplasmic שאחרת לעזור לשמור על מורפולוגיה של תאים הארגון במהלך תהליך קיבוע.
- יוצקים את מקבע לתוך כוס בזבוז לשטוף את התאים קבוע עם שלושה שוטף קצרה של PBST (PBS + 0.1% TritonX-100).
- לאחר מכן, להוסיף 1ml של חסימת פתרון התאים במשך 15 דקות. אנו משתמשים באופן שגרתי 5% נסיוב עז נורמלי PBST.
- יוצקים את פתרון חסימת להוסיף נוגדן ראשוני (בדילול מלא חסימת פתרון) ישירות על גבי התאים. 100 μl של פתרון נוגדן צריך לכסות לחלוטין את התאים. מניחים את המכסה בחזרה על צלחת פטרי כדי למנוע אידוי של הפתרון נוגדן. תן דגירה נוגדן עם התאים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר את הפתרון ואת הנוגדנים לבצע שלוש שוטף PBST. השתמש pipet העברת להוסיף 2 מ"ל של PBST על המנה. המתן 5 דקות בין כל לשטוף (אין צורך לערבל את המנה).
- יוצקים מעל לשטוף האחרון ולהוסיף 100 μl של נוגדנים משני (בדילול מלא חסימת פתרון) ישירות על גבי התאים. מניחים את המכסה בחזרה על צלחת פטרי כדי למנוע אידוי של הפתרון נוגדן. תן דגירה נוגדן עם התאים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר את הנוגדן משני לבצע שלוש 5 דקות שוטף עם PBST. לאחר השלכת הכביסה האחרון, להוסיף כמה טיפות של התקשורת הרכבה של הבחירה שלך ישירות על גבי התאים. אנו משתמשים ב 0.1 M gallate propyl מומס לתוך תמיסה של גליצרול: PBS (09:01) ומאוחסנים בטמפרטורה של 20 ° C. החלף את המכסה ולאחסן את פטרי צלחת בסביבה כהה.
3. מגבלות / בעיות
כמו כל מערכת ניסיונית, קיימות מגבלות על השימוש בתאי S2. ראשית, תאים בתרבית S2 בדרך כלל התערוכה מדד mitotic נמוך (כ 1% סרום ללא מדיה), ואילו מדדי mitotic עבור טרנספורמציה שורות רבות תא יונקים הם ככל גבוה פי 10. לכן, עבור מחקרים של פנוטיפים mitotic, תרביות תאים S2 דורשים החיפוש יותר למצוא תאים כראוי, מבוים. שנית, מחקרים מחזור התא, טיפולים תרופתיים יעילים מאוד לעצור תאים S2 במהלך שלבי מחזור התא הספציפי. עם זאת, תרכובות בעלות הפיך תא מחזור תופעות מעצר בתאי יונקים בתרבית לא בקלות כשלון בתאים S2. לפיכך, פרוטוקולים לסינכרון התאים מתרבים S2 לא הוקמו. שלישית, תאים S2 אינן נודדות ואינם להציג מאפיינים אפיתל.
4. תוצאות צפויות
נקודת המכירה הגדולה ביותר של תאים S2 הוא השירות שלהם כמערכת מודל. הם שימושיים במיוחד להערכת תפקודים תאיים של חלבון העניין שלך: תאים S2 מטופלים על ידי dsRNA RNAi באמצעות זה בקלות (יחסית בזול) מסונתז במעבדה, והם משמשים גם לניתוח תא חי ועל immunofluorescence של תאים קבוע . בנוסף, היתרון העיקרי לתאי S2 היא הקלות שבה הם יכולים להישמר במעבדה, תוך שימוש זול יחסית בסרום ללא בינוני ולא בתרבית רקמה חממה.
ניסוי טיפוסי יהיה כרוך ציפוי תאים S2 ב מיכל רקמות מתאים לתרבות (למשל, צלחת עם 6 או 96 טוב), והוסיף תוצרת בית dsRNA את בארות, ולאחר מכן שמירה על תרבויות כמו חלבונים ממוקד מתרוקנים בהדרגה RNAi. בהתאם חלבונים היעד מתרוקן, התאים עשויים לחול שינויים מורפולוגיים ו / או התנהגותיות כתוצאה חלבון המטרה להפיל למטה. פרק הזמן הדרוש כדי להפחית את ביטוי חלבון מטרה למינימום ספציפי החלבון צריך להיקבע על ידי המערב סופג.
בדרך כלל תאים S2 לא להיצמד בחוזקה פלסטיק או זכוכית, זה יהווה בעיה עבור ניסויים הדורשים בדיקה מיקרוסקופית של תאים שטופלו. עם זאת, תאים S2 יכול להיגרם לשטח נרחב פשוט על ידי ציפוי אותם על משטח מצופה לקטינים, concanavalin (ConA). תוך שעה של ציפוי על ConA, רוב התאים איבדו את המראה המעוגל שלהם כתוצאה של התפשטות נרחבת על פני השטח ConA (איור 1). התאים מוכנים כעת לעיבוד נוסף (למשל, על ידי קיבוע ו immunostaining) או תצפית מיקרוסקופית של תאים חיים.
תאים S2 יכול להיות גם transfected (באמצעות מגוון של חומרים כימיים או electroporation) או כדי להביע transiently גן אקסוגניים או ביציבות לשלב את הגן לתוך הגנום (ובכך ליצור קו התא שומר על הגן אקסוגני באמצעות חטיבות חוזרות ונשנות). Transfections יכול לשרת מטרות רבות, כמו הביטוי של החלבונים המתויגים fluorescently כי מבנים סימן של עניין תאים קבוע או לחיות (איור 2), או משמשים כפיתיון ב בניסויים vivo הנפתח או immunoprecipitation וכו '
שיטת הניתוח תלויה, של couRSE, בשאלת ביולוגי שפונים ידי הניסוי. השיטה הנפוצה של ניתוח של RNAi שטופלו בתאים S2 הוא immunofluorescence של תאים קבוע (איור 3). לדוגמה, immunofluorescence משמש בדרך כלל עם הגנום כולו המסכים של ספריות תסיסנית גן במהירות כדי לזהות חלבונים עם פעילויות מעניינות in vivo. הניתוח יכול להתבצע משוכלל יותר בו זמנית על ידי depleting חלבונים היעד מספר תאים S2 כדי לבחון את יחסי הגומלין בין הפוטנציאל פונקציונלי חלבונים היעד. ניתוח ניתן להאריך לחיות תאים, כדי לבחון את ההשפעה של RNAi על תהליכים דינמיים. שוב, התאים S2 הם בעיקר היטב מתאים לסוג זה של ניתוח, כי הם יכולים מצופה על ConA מצופה זכוכית התחתונה מנות דמיינו במשך שעות רבות על מיקרוסקופ הפוכה, ללא צורך של החדר סביבתי.
באיור 1. בניגוד שלב תמונות (20x הגדלה) של תאים S2 לאחר ציפוי על צלחת מצופה זכוכית התחתונה concanavalin. המספרים מצביעים על דקות לאחר ציפוי. שים לב כי התאים להיות שלב כהה כפי שהם להשתטח על להחליק את מכסה מצופה. תא משטחת ניכר על ידי 15 דקות (חיצים), והוא מלא למעשה על ידי 60 דקות. פאנל ימין: תמונה מוגדלת של תאים המצורפת; שולי המורחבת שטוח שלהם גלויים לעין (ראש חץ). בר סולם (במשך ארבע פאנלים משמאל), 20 מיקרומטר.
איור 2. תאים S2 transfected transiently עם היתוך מבנה המורכב nucleophosmin (סמן גרעין) התמזגו fluorophore, eGFP (ירוק). תאים אלה היו מצופה על צלחת זכוכית עם תחתית ConA מצופה, וצילמו אז עם DIC ו epifluorescence. סרגל קנה מידה, 15 מיקרומטר.
. איור 3 תאים S2 קבוע immunostained עבור PLP (ירוק; סמן centriole), microtubules (אדום), ואת Hoechst מוכתם (כחול) על הכרומוזומים. לפני קיבוע ו immunostaining, התאים היו נתונים לטיפול 4 ימים עם או RNAi שליטה או RNAi לדפוק למטה NCD, חלבון kinesin כמו שמקדם מוט ציר "התמקדות" 4. שים לב פשוקות הקטבים ציר ו spindles מאורגן בתאים שטופלו NCD RNAi. סרגל קנה מידה, 2.5 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עבור שדה ביולוגיה של התא, מערכת האידיאלי יהיה זול לתחזוקה, קל לתפעל, ו מקובל מגוון רחב של טכניקות. תאים תסיסנית S2 לספק את הדרישות הללו, ולכן יש להפוך במהירות את המערכת של בחירה עבור מספר הולך וגדל של התא מעבדות הביולוגיה.
הצגנו סקירה קצרה של השיטות להכנת תאים S2 עבור מיקרוסקופיה. בתוקף בולט של תאים S2 היא העובדה כי הם גדלים היטב באווירה נורמלית בטמפרטורת החדר, ולכן הם יכולים שמאל על המיקרוסקופ במשך תקופות ממושכות ללא כל דרישות תחזוקה מיוחדות. למרות שהם בדרך כלל מעוגל במקצת חסיד רופף culturing בתנאים נורמליים, תאים S2 יכול להיגרם לשטח נרחב עבור הדמיה. תאים בתרבית S2 על זכוכית התחתונה מנות כי כבר מראש מצופה concanavalin יצרף ומרוחים בשכבה דקה על להחליק את המכסה, מה שהופך אותם דגימות במיקרוסקופ מעולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכון הלאומי לסרטן P30 CA23074, האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן מחקר מוסדיים גרנט 74-001-31, ואת Univ. אריזונה GI נבג (NCI / CA9506O NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S2 cells | ATCC | CRL-1963 | http://www.atcc.org/ |
| S2 cells | DGRC | stock number 6 | https://dgrc.cgb.indiana.edu/ |
| S2 cells | Invitrogen | R690-07 | |
| Sf900 II | Invitrogen | 10902-096 | serum-free medium |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30278 | serum-free medium |
| Insect-Xpress | BioWhittaker | 12-730 | serum-free medium |
| Schneider’s S2 medium | Invitrogen | 11720-034 | Add 10% (final) heat-inactivated FBS to make complete medium. |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438026 | heat inactivated |
| 100x antibiotic solution | MP Biomedicals | 91674049 | contains penicillin (10000 U/mL), streptomycin (10000 μg/mL), and amphotericin B (25 μg/mL) |
| Concanavalin A | MP Biomedicals | 195283 | |
| Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | 32% solution |
| Methanol | Mallinckrodt Baker Inc. | 9049 | anhydrous, ACS grade |
| Molecular sieves | Acros Organics | 19724 | type 3A |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).
- Goshima, G. Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells. Science. 316, 417-421 (2007).
