Summary
Drosophila 슈나이더 (S2) 세포가 유전자의 발견과 기능 분석을위한 점점 인기있는 시스템입니다. 우리의 목표는 점점 더 중요한 실험 시스템 S2 세포를 만드는 미세한 기법 중 일부를 설명하는 것입니다.
Abstract
이상적인 실험 시스템은 기술의 다양한 의무 유지하기 위해 저렴하고 쉽게 될, 그리고 광범위한 문학 게놈 시퀀스 데이터베이스에 의해 지원됩니다. 교양 Drosophila S2 세포, 정신을 20-24시간 오래된 태아 1의 제품은 이러한 모든 속성을 보유하고 있습니다. 따라서, S2 세포는 매우 분자 과정의 구성 요소 또는 관심 메커니즘을 인코딩 유전자의 발견을 포함하여 세포 프로세스의 분석에 적합합니다. 그들의 유틸리티에 대한 대부분의 책임이 S2 세포의 기능은 라이브 또는 고정 형식으로 그들이 유지하고있는 용이성을 두 번 좌초 (DS) RNA - 중재 간섭 (RNAi)들의 아름다운 감성과 형광 현미경 자신 tractability 아르 세포.
S2 세포는 저렴한, 상용 - 가능, 완벽한 정의, 혈청 프리 미디어 2의 숫자를 포함하여, 다양한 미디어로 성장하실 수 있습니다. 또한, 그들은 21-24 ° C에서 최적으로 빠르게 성장하고 컨테이너의 다양한 교양 수 있습니다. 포유 동물 세포와는 달리, S2 전지는 규제 분위기를 필요로하지 않지만, 대신에 일반 공기와 잘 심지어 밀폐 flasks 유지하실 수 있습니다.
S2 세포에서 RNAi의 용이성을 보완하는 것은 쉽게 위상 또는 고정 또는 라이브 세포의 형광 현미경에 의해 실험적으로 유도된 phenotypes을 분석하는 능력입니다. S2 세포는 단일 monolayer로 문화의 성장하지만, 연락처 억제를 표시하지 않습니다. 대신, 세포는 짙은 문화의 식민지에서 성장하는 경향이있다. 저밀도에서 S2 문화 원형과 느슨하게 연결된 아르 유리 또는 조직 문화 처리 플라스틱에서 성장. 그러나, S2 세포의 세포학은 크게 렉틴, concanavalin A (코나) 3 코팅 표면에 간단히 culturing 그들에 의해 광범위하게 버리고 그들을 유도하여 향상시킬 수 있습니다. S2 세포도 안정 레이블 구조 또는 거주 또는 고정 세포에 대한 관심의 organelles에 찬란 - 태그 마커와 transfected 수 있습니다. 따라서, 세포의 미세한 분석을위한 일반적인 시나리오는 이것입니다 : 우선, S2 전지 (태그 마커를 표현하는 transgenes을 가지고 수) 대상 단백질 (들)를 제거하는 RNAi에 의해 처리됩니다. RNAi 치료 시간은 단백질의 차이 수 있도록 조정할 수 있습니다 대상 단백질은 생존에 중요한 경우 속도론을 넘겨주 및 세포 외상 / 죽음을 최소화하기 위해. 다음 치료 세포가 확산 세포를 유도하고 단단히 유리에 준수하는 코나 사전 코팅 coverslip을 포함하는 음식으로 전송됩니다. 마지막으로, 세포는 현미경 모드의 연구자의 선택과 몇 군데 있습니다. 이러한 세포가 실내 온도와 정상적인 분위기에서 건강을 유지 이후 S2 세포 사는 세포의 확장 시각화를 필요로하는 연구에 특히 좋다.
Protocol
1. 현미경에 대한 S2 세포 준비
슈나이더 S2 세포는 오레곤 R Drosophila의 trypsinized 하순 배아에서 파생되었습니다. 슈나이더의 원래 문화가 세포 유형의 혼합물로 구성되어 있지만 지속적인 통로 1 더 균질되었다. 그들은 hemocyte 같은 유전자 발현과 함께 (그들은 phagocytic 있습니다) 대식 세포와 같은 것으로 설명되었습니다. S2 세포는 ATCC, DGRC 또는 Invitrogen에서 얻을 수 있습니다.
성장 매체 A. 선택
미디어의 숫자는 문화 S2 세포에 사용되었습니다. 미디어 누구도 5 % CO 2 분위기를 필요로 아래 언급하지 않습니다.
- 슈나이더는 원래 그녀의 정의 매체 (슈나이더의 Drosophila 매체) 10 % 열 inactivated 태아 소 혈청 (FBS)와 보충하는 데 사용됩니다. FBS는 혈청이없는 미디어를 아래에 언급된 이상이 매체는 더 비싼 만드는 동안, 그것은 비교적 낮은 autofluorescence을 보유하고 있으므로 라이브 세포 epifluorescence 현미경을위한 좋은 선택입니다. 그러나, 그것은 유도 전에 유전자의 "새는"표현의 원인, inducible의 metallothionein의 발기인 (예 : Invitrogen의 PMT 벡터로 subcloned 유전자)의 통제하에 그 transgenes 표현의 낮은 수준을 자극하기에 충분한 금속을 포함 않습니다.
- 몇 가지 혈청 프리 미디어 (예 : Sf900 II, HyClone SFX - 곤충 및 곤충 - 익스프레스) 상업적으로 사용할 수 있습니다. 이러한 미디어는 상대적으로 저렴한 있지만 슈나이더의 매체에 비해 metallothionein 발기인 - 규제 transgenes를 사용할 때 일반적으로 표현의 높은 수준을 자극. 또한 이러한 미디어는 슈나이 더스 '중간 / FBS (라이브 세포 형광 현미경을 수행하는 중요한 고려 사항)에 비해 상당한 autofluorescence을 생산합니다.
- 선택, 항생제는 매체에 추가할 수 있습니다, 이들은 일반적으로 페니실린 G와 스트렙토 마이신 황산 (50-100 단위 / ML 및 50-100 μg / ML 최종 농도 각각)입니다. 또한, 안티 - 곰팡이 시약, amphotericin B는, 250 NG / ML (최종 농도)에 추가할 수 있습니다.
B. 문화 조건
S2 세포는 쉽게 일반적인 실험실 온도와 대기 조건에서 유지 관리됩니다. 이미지가 확장 번 S2 세포를 살 때, 세포 사망의 주요 원인은 탈수 및 사진 - 독성 있습니다. 탈수가 쉽게 현미경의 접시에 충분한 매체를함으로써 예방합니다. 사진 독성은 높은 강도, 높은 에너지 빛을 세포 '누적 노출을 최소화해야하는 난이도가 문제 충분한 공간과 시간적 해상도 흥미로운 이벤트를 캡처하는 이미징 자주 충분 동안.
- 조직 문화 플라스틱에 성장 S2 세포는 일반적으로 반올림하고 느슨하게 자기편 있습니다. 콘플루앙 세포는 짙은 monolayer으로 성장하고, 점점 더 많은 세포가 발사와 정지에서 성장합니다. 세포가 커버 슬립에 버리고 유도하는 경우 모두 고정 및 라이브 세포의 현미경 들어, 이미지가 크게 향상됩니다. 이 트릭은 아래에서 설명합니다 (2. A. 2.).
2. S2 세포의 현미경
A. 라이브 세포 현미경
우리는 유리 바닥 요리에 도금 라이브 S2 세포를 시각화하기 위해 거꾸로 현미경을 사용합니다. 아래에 설명된 유리 바닥 요리는 정상 culturing 상태와 매우 유사한 상태로 세포를 유지하고, 또한 라이브 세포가 현미경 수준의 유리를 통해 심사 수 있습니다 것입니다.
- 유리 바닥 요리 준비
구성 요소 :- Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트
이것은 요리에 커버 전표를 첨부하는 접착제입니다. 바로 사용하기 전에 체중 비율 : 키트 10시 1분 (경화 대리인 수지)에 혼합하는 두 부분의 수지베이스 구성 요소와 경화 에이전트를 가지고 있습니다.
수지 / 치료 에이전트 혼합물을 준비하려면 :- 보트의 무게를 플라스틱으로 수지의 약 5g을 나가는거야. 수지의 무게를합니다.
- 경화 에이전트가 0.1에 의해 수지의 중량을 곱하여 필요합니다 얼마나 계산합니다. 새로운 전송 pipet을 사용하여 동일한 무게 배 경화 대리인이 금액을 추가합니다.
- 철저하게 구성 요소를 섞어 저어. 나타나는 거품 걱정하지 마십시오 그들은 서서히 사라집니다.
- 접착제 이제 준비가되었습니다. 그것은 벌꿀처럼 일관성을 가지고 있으며, 적어도 한 시간 동안 사용 가능합니다. 접착제의 5.5 G는 약 75 요리를 만들기 위해 충분하다, 그러나 이것은 당신이 접착제를 적용할 때 당신이 얼마나 인색에 따라 다릅니다.
- 플라스틱 35mm 페트리 요리
그래서 그 대신 우리가 싼 표준 배양 접시를 사용하여 - 우리는 오직 세포가 유리 바닥 (아니라 플라스틱)에 연결하는 데 관심이 있기 때문에 우리는 세포 배양 등급 요리를 사용하지 마십시오. 일부 현미경 단계 35를 잡아 원형 클램프를mm 요리, 당신이있다면, 귀하의 요리가 클램프에 맞는 것을해야합니다. 놀랍게도, 모든 35mm 요리 같은 외경이 없습니다. - 유리 커버
당신의 현미경과 요구에 맞는 커버 전표를 선택합니다. 훨씬 싸게 대량 커버 유리 (예 : VWR, 22x22 mm 평방 유리 사진 에칭 격자 (예 : 전자 현미경 과학, 원형 23x23 mm, gridded, 안돼. 2, 고양이. 아니. 72264-23)와 고가의 특수 유리에서 아무것도 ,도. 1.5, 고양이. 아니. 48366-227)를 사용할 수 없습니다. 주의 : 유리 당신이 배양 접시에있는 것입니다 구멍보다 (적어도 1mm 정도) 약간 큰해야하며, 또한 접시의 직경보다 작아야합니다. 당신은 정사각형 유리를 구입하려고한다면, 유리가 완전히 커버 (그리고 조금 넘어를 연장) 원형 구멍을 것으로 확신할 수 있지만, 접시의 측면에 도달하지 않습니다. 귀하의 커버 유리를 청소하고자 할 경우, 요리 gluing을하기 전에 이렇게. - 동력 천공기
우리는 변수 속도 및 지속적인 사용을위한 잠금 버튼이있는 핸드 드릴을 사용합니다. 드릴링 요리 드릴 프레스와 함께 훨씬 더 쉽게이지만, 유리 바닥 요리의 소규모 생산 드릴 언론의 구입을 정당화하지 않습니다. - 드릴 비트
어 인치 스페이드 드릴 비트를 (http://en.wikipedia.org/wiki/Drill_bit 스페이드 비트가이 웹페이지에 그림)을 사용합니다. 물론, 비트의 직경은 접시의 바닥에있는 구멍의 직경을 결정합니다. - 원뿔 숫돌 드릴 비트
거친 모래와 스페이드 비트와 같은에 대한 직경 conically 모양의 연삭 비트를 사용합니다. 모든 구멍을 뚫고되었습니다 후 접시의 바닥에서 구멍 해당 프로젝트의 가장자리에 플라스틱 조각을 멀리 버이 비트를 사용합니다. 접시의 외부 얼굴에 플라스틱 조각은 요리에 대한 플러시 앉아의 커버 유리를 방지할 수 있습니다. 접시 내부에 편을 드는 작은 플라스틱 조각에 대해 걱정하지 마십시오 : 그들은 커버 유리 또는 세포에는 영향을 미치지 않습니다. - 두꺼운 벽 스티로폼 상자
이것은 드릴링 표면으로 사용됩니다. 씰링 테이프의 스트립과 함께 스티로폼 상자 중 하나 외부 측면을 커버하는 것은 (우리가 1.5 인치 스카치 씰링 테이프를 사용), 씰링 테이프 천공 동안 스티로폼의 비트의 탈출을 최소화합니다.
어셈블리- 장소 그래서는 바닥 쪽의 요리는 스티로폼 상자에 위배되는, 스티로폼 상자의 테이프 표면에 35mm 페트리 접시의 아래쪽 절반을 놓으십시오. 단단히 접시의 측면을 잡고 있지만, 요리를 통해 구멍을 드릴. 주의 : 손가락이 접시를 들고 것은 회전 드릴 비트에서 인치의 일부 것입니다. 물론, 이것은 위험합니다. 접시가 회전하기 시작하면 드릴링 중지합니다. 여러분이 드릴 언론 및 / 또는 단단히 접시를 개최하는 현명한 방법이있다면, 그들을 사용합니다. 우리는 사고가 없었다,하지만 당신이이 절차가 안전해야 뭐든지 할 적이 없다.
- 당신의 요리를 모두 드릴링 후, 연마 드릴 비트를 사용하여 구멍의 바깥쪽 가장자리를 부드럽게. 우리는 비트 카운터의 가장자리를 통해 밖으로 돌출과, 그 측면에 전원 훈련을 넣으십시오. 훈련은 그것에 무거운 것을 그러나 고분 고 분한 놈이 배치 장소에서 개최된다 (우리는 모래 10kg를 포함하는 헤비 듀티 비닐 봉투 사용). 각 접시를 개최하고 새 구멍의 거친 가장자리를 멀리 부드럽게 연마 비트에 대해 그것을 이동하여 모든 요리의 테두리를 부드럽게 다음 훈련은 지속적으로 계속 실행하기 위해 잠금 버튼을 사용합니다.
- 큰 비커에있는 모든 요리 보틈스 넣고 플라스틱이나 스티로폼의 작은, 느슨한 조각 (어느 부동됩니다) 제거 증류수와 함께 그들에게 여러 번 씻어. 후, 건조하는 요리 보틈스 밖의 해변.
- 요리 건조하면 Sylgard 184 접착제를 준비합니다. 각 음식의 외부 표면에 구멍 뚫고 주위에 접착제의 작은 원형을 적용합니다. 별로 안 접착제가 필요합니다, 사실, 너무 접착제가 엉망 만들 것입니다. 접착제 접촉, 구멍을 통해 커버 유리를 놓습니다. 커버 유리는 원활하고 균일하게 접시에 대해 앉아해야합니다. 접착제가 완전히 구멍 주위에 배포되지 않은 경우 다음 접착제가 커버 유리 접시 바닥 사이에없는 작은 차이가있을 수 있습니다. 처음에는이 간격에 대해 걱정하지 마십시오, 일반적으로 접착제 그들을 채우기 위해 이러한 격차에 크리프 것입니다.
- 커버 유리의 모두 gluing 후, 다시 가서 접착제에 의해 폐쇄되지 않은 간격을위한 요리를 확인하십시오. 모든 간격에서 간격 근처의 커버 유리의 가장자리에 접착제의 작은 소량을 적용하고, 접착제가 틈새로 심지 것입니다.
- 건조, 위, 옆으로 하단 측면을 요리를 설정합니다. 이것은 상온에서 하루 이상 걸릴 수 있지만, 당신은 따뜻한 인큐베이터에있는 접시를 넣어 경화 속도를 높일 수 있습니다.
- 당신은 멸균 요리를해야하는 경우, 조직 문화 후드의 요리 보틈스와 뚜껑을 넣고 그들을 확산. 접시의 바닥에 피부를 넣지 마십시오. 대신, 그들의 내부 표면해진되도록 조각을 돌려ctly UV 램프에 직면. 적어도 45 분에 대한 살균 UV 라이트를 켭니다. 당신은 코나의 외투 요리 (아래 참조)에 계획하는 경우, 그들은 코팅 후 때까지 요리를 검사하지 않습니다.
- 요리는 이제 사용 준비가되어 있습니다.
- Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트
- concanavalin를 사용하여
렉틴과, concanavalin는 (코나), 코나 3 코팅 표면에 대한 버리고 S2 세포를 자극하는 발견되었습니다. S2 세포 코나와 코팅 커버 전표에 씨앗을 때, 그들은 확산과 현미경을위한 훌륭한 표본이된다.- 코나 외투 일반 커버 풀렸는데하려면, Parafilm의 조각 위에 청소 커버 전표가 벤치 맨 위로 아래로 녹화 확산. 다음 0.5 MG / ML 각 커버 슬립의 표면에 코나의 솔루션 (멸균 물)와 대신 10 μLs은 커버 슬립의 전체 상단을 통해 자료를 보급. 건조 후 깨끗한 마른 용기에 커버 전표를 저장합니다. 코팅 유리는 조직 문화 후드의 자외선과 소독 수 있습니다.
- 코나 코팅 유리 바닥 요리하려면, 마찬가지로 유리의 (즉, 뚜껑 방향 쪽) 상단쪽으로 코나 솔루션 10 μLs을 확산. 건조 후, 요리는 위에서 설명한대로 소독 수 있습니다. 코나 - 코팅 요리 또는 coverslips은 상온에서 저장하고 준비 후 개월 사용할 수 있습니다.
- 이미징
- 부드럽게 RNAi - 대우 S2 세포를 resuspend와 매체 2 MLS를 포함하는 코나 - 코팅, 유리 바닥 요리로 전송할 수 있습니다. 코나 - 코팅 커버 슬립에 문의 건강한 세포는 그것에 긴밀하게 준수하고 확산되기 시작합니다. 이 과정은 약 15 분에 의해 려면요해야하며, 45 분 1 시간으로 완료해야합니다. 연결된 세포 코나 - 코팅 표면으로 인해 꽉 첨부 cytokinesis을 수행할 수 있으며 시간이 지남에 따라 polyploid가됩니다. 코나 - 코팅 접시에 씨앗 세포가 오랜 시간 동안 건강한 상태로 유지됩니다하지만, 이러한 요리 분아 따위에 의해 번식하지 않습니다.
- 세포가 첨부되면 기존의 매체 autofluorescent 경우, 매체는 교환할 수 있습니다. 이것은 작은 깊이 - 오브 - 필드 목표와 공촛점 또는 deconvolution 현미경 또는 넓은 필드 현미경을 사용하는 연구가 필요하지 않을 수 있습니다.
- S2 세포가 실내 온도 / 정상적인 분위기에서 건강 때문에 세포가 현미경에있는 경우 다음 특별한 조건이나 장비가 필요하지 않습니다. 우리는 종종 라이브 S2 세포의 긴 시간 경과 영화 가져가라. 실제로이 실험의 런타임 photobleaching과 phototoxicity의 일반적인 문제로 제한됩니다.
B. 고정 세포 현미경
- 유리 바닥 요리 대 일반 커버 전표가 : 세포를 고정하면 어느 이러한 사용할 수 있습니다. 일반 커버 전표를 사용하면 개별 35mm 요리 (어떤 조직 문화 학년 필요가 없습니다)에 하나의 코나 - 코팅 커버 슬립을 배치, 미디어 2 MLS를 추가하고, 다음 접시에 RNAi - 대우 세포를 전송합니다. 세포 커버 슬립에 부착된 후, 매체를 제거 간략 적절한 버퍼 (PBS가 제대로 작동)로 세포를 세척하고, 요리에 정착액 (아래 참조)을 추가합니다. 그 후 커버 슬립이 접시에서 제거 할 수 있습니다 immunostaining으로, 예를 들어, 추가로 처리되었습니다.
- 고정 : 다양한 방법이 S2 세포를 수정하는 데 사용되었습니다. 최고의 고정 방법은 epitopes 또는 태그가 단백질을 파괴 또는 손실없이 정착액 관심의 기능을 유지하는 정도에 따라 결정됩니다. 어떤 절차가 짙은 또는 컴팩트 구조에있는 몇몇 단백질의 epitopes를 노출하기 위해 고정하기 전에 추출 단계가 필요합니다. S2 세포 문학은 매우 광범위하기 때문에, 그것은 최적의 관심의 S2 세포 구조를 해결하기 위해 게시 방법을 찾기 위해 일반적으로 수 있습니다.
- 메탄올은 일반 정착액입니다. 메탄올 감기해야합니다 (적어도 -20 ° C) 및 무수 (분자 sieves [유형 3A]이 추상 물 메탄올에 추가할 수 있습니다.) 폭발 방지 20 ° C의 냉장고에서 대상 1L 유리 비이커에 무수 메탄올 300 MLS에 대해 우리는 진정. 메탄올이 차가운 경우, 냉동고에서 제거 신속 유리 바닥 요리 (또는 커버 전표를 포함하는 요리)에서 매체를 제거한 다음 빠르게 메탄올에 접시를 빠지게하고 거기 두십시오. 메탄올의 비커는 일반적으로 약 십여 요리를 보유하고 있습니다. 신속하게 작업 가능한 빨리 냉동실에 비커를 (요리를 포함)을 반환합니다. 고정은 10-15 분 안에 완료됩니다. 그 후, 비커에서 요리를 제거 그들에 남아있는 메탄올을 부어하고, PBS / 0.1 % 트리톤 X - 100을 추가하여 그들을 rehydrate. 그들은 지금 표준 얼룩 절차에 대한 준비가되어 있습니다.
- 포름 알데히드는 다른 일반적인 정착액입니다. 우리는 버퍼의 10 % 포름 알데히드를 (PBS는 허용하지만, 여러분의 필요에 가장 적합한 버퍼를 사용)을 사용합니다. 우리는 포름 알데히드의 상대적으로 높은 농도 때문에 S2 세포를 사용그렇지 않으면 고정 과정에서 세포 형태 및 조직을 유지하는 데 도움이 될 세포질 중간 필라멘트 부족합니다.
- 폐기물 비커에 정착액을 붓고하고 PBST 세 간단한 세척으로 고정 세포를 씻어 (PBS + 0.1 % TritonX - 100).
- 다음 15 분 동안 세포 솔루션을 차단 1ml 추가할 수 있습니다. 우리는 일상적으로 PBST에 5% 정상 염소 혈청을 사용합니다.
- 차단 솔루션을 붓고 직접 세포에 항체를 기본 (솔루션 차단에 희석)을 추가합니다. 항체 용액 100 μl 완전히 세포를 커버한다. 항체 솔루션의 증발을 방지하기 위해 다시 접시에있는 페트리 덮개를 놓습니다. 실온에서 30 분 세포와 항체 부화하자.
- 항체 용액을 제거 세 PBST의 세척을 수행합니다. 접시에 PBST 2 ML를 추가하는 전송 pipet을 사용합니다. 각 세척 (소용돌이 접시를 필요 없어) 사이에 5 분 기다리십시오.
- 마지막 세척을 붓고 직접 세포에 이차 항체 100 μl를 (솔루션 차단에 희석)을 추가합니다. 항체 솔루션의 증발을 방지하기 위해 다시 접시에있는 페트리 덮개를 놓습니다. 실온에서 30 분 세포와 항체 부화하자.
- 보조 항체를 제거하고 PBST 세 오분 세척을 수행합니다. 마지막 세척을 덤프 후 직접 세포에 선택의 장착 미디어 몇 방울을 추가합니다. PBS (9시 1분) 및 20에 저장된 ° C. : 우리는 글리세롤의 솔루션으로 해산 0.1 M의 프로필 gallate를 사용하여 페트리의 뚜껑을 교체하고 어두운 환경에서 요리를 저장합니다.
3. 제약 / 문제
어떤 실험 시스템과 마찬가지로 제한이 S2 세포의 사용에 있습니다. 많은 변화를 포유 동물 세포 라인에 대한 mitotic 지수만큼 10 배 높은 반면 첫째, 교양 S2 세포는 일반적으로, 낮은 mitotic 인덱스를 (혈청이없는 미디어의 약 1 %) 나타냅니다. 따라서, mitotic의 phenotypes의 연구, S2 세포 문화는 적절하게 - 공연 세포를 찾기 위해 더 이상 검색을 필요로합니다. 둘째, 세포주기의 연구, 약물 치료는 특정 세포주기 단계 동안 S2 세포를 체포에 매우 효과적입니다. 그러나, 교양 포유 동물 세포에서 가역 세포주기 체포 영향을 미칠 화합물을 쉽게 S2 세포에서 막가는하지 않습니다. 따라서, proliferating S2 세포를 동기화를위한 프로토콜이 설치되지 않았습니다. 셋째, S2 전지는 철새하지 않으며 그들은 상피 특성을 표시 않습니다.
4. 예상 결과
S2 세포에 대한 가장 큰 판매 포인트는 모델 시스템으로 자신의 유틸리티입니다. 그들은 관심의 단백질의 세포 기능을 평가에 특히 유용합니다 : S2 세포는 실험실에서 합성 쉽게 (상대적으로 싸게)입니다 RNAi를 사용 dsRNA에 의해 처리하고, 그들은 라이브 세포 분석을위한 고정 세포 immunofluorescence을 위해 잘 봉사 아르 . 또한, S2 세포에 주요 이점은 그들이 상대적으로 저렴한 혈청 무료 매체없이 조직 문화 배양기를 이용하여 실험실에서 유지 수있는 용이입니다.
전형적인 실험은, (6 96 잘 플레이트 말) 적절한 조직 문화 컨테이너의 S2 세포를 도금 우물에 집에서 만든 dsRNA를 추가하고, 다음 타겟 단백질이 점차 RNAi에 의해 고갈로 문화를 유지 포함합니다. 고갈되는 대상 단백질에 따라 세포가 표적 단백질 노크 다운의 결과로 형태학의 및 / 또는 행동 변화를 보여줄 수 있습니다. 최소 목표 단백질 발현을 줄이기 위해 필요한 시간은 단백질을 특정하고 서양은 모래 바닥에 의해 결정되어야합니다.
일반적으로 S2 세포는 플라스틱이나 유리에 단단히 준수하지, 이것은 치료 세포의 현미경 검사를 요구하는 실험에 대한 문제를 일으킬 것입니다. 그러나, S2 세포가 단순히 렉틴, concanavalin A (코나)과 코팅 표면을 도금하여 광범위하게 버리고 유도하실 수 있습니다. 코나에 도금을 한 시간, 대부분의 세포는 코나의 표면 (그림 1)에 광범위하게 확산의 결과로 자신의 둥근 모양을 잃었어요. 세포는 이제 더 이상 처리 (예, 고정 및 immunostaining에 의해) 또는 라이브 세포 현미경 관찰을위한 준비가되어 있습니다.
S2 세포 역시 transiently 외인성 유전자를 표현하거나 안정 게놈 (즉 반복 부서를 통해 외인성 유전자를 유지 세포주를 만드는)에 유전자를 포함하는 (화학 시약 또는 electroporation 다양한 사용) transfected 수 있습니다. Transfections는 고정 또는 라이브 세포 (그림 2), 또는에 대한 관심의 표시 구조는 풀다운 생체내 또는 immunoprecipitation 실험 등에 미끼로 사용하는 찬란 태그 단백질의 표현 같은 다양한 용도로 서비스를 제공할 수
분석의 방법은 기의 의존rse, 실험에 의해 해결되는 생물 학적 문제에. RNAi - 처리 S2 세포의 분석의 일반적인 방법은 고정된 세포 (그림 3)의 immunofluorescence입니다. 예를 들어, immunofluorescence는 일반적으로 급속하게 생체내에서 흥미로운 활동과 단백질을 식별하는 Drosophila의 유전자 라이브러리의 게놈 - 와이드 스크린과 함께 사용됩니다. 분석은 동시에 대상 단백질 간의 잠재적인 상호 작용 기능을 검사하기 위해 S2 세포에서 여러 대상 단백질을 파괴하여보다 정교한 만들 수 있습니다. 그리고 분석은 동적 프로세스에 RNAi의 효과를 관찰하기 위해 세포를 살아 확장할 수 있습니다. 그들은 코나 - 코팅 유리 바닥 요리에 도금과 환경 챔버의 필요없이 거꾸로 현미경에 많은 시간 동안 시각 수 있기 때문에 다시 S2 세포, 특히 분석의이 유형에 적합합니다.
그림 1. concanavalin A - 코팅 유리 바닥 요리에 도금 후 S2 세포의 위상 대비 영상 (20x 확대). 번호 도금 후 분을 나타냅니다. 그들이 코팅된 커버 슬립에 평평으로 세포가 어두운 단계가 있습니다. 평평화 세포는 15 분 (화살표)에 의해 분명하고 60 분에 의해 근본적으로 완료됩니다. 오른쪽 패널 : 첨부 세포의 이미지를 확대, 자신의 확장과 평평 마진은 (화살촉) 명확하게 볼 수 있습니다. 스케일 바 (네 개의 왼쪽 패널), 20 μm의.
transiently 융합 nucleophosmin (핵에 대한 마커) 형광단에 융합, eGFP (녹색)로 구성된 구조와 transfected 그림 2. S2 세포. 이러한 세포는 코나 - 코팅 유리 바닥으로 요리에 도금 후 DIC와 epifluorescence와 몇 군데 있었다. 스케일 바, 15 μm의.
. 그림 3 고정 S2 전지 PLP (녹색, centriole 표시)에 대한 immunostained, microtubules (적색), 그리고 염색체에 대한 (파란색) Hoechst - 스테인드. 고정 및 immunostaining 전에 전지에 노크를 다운 Ncd 제어 RNAi 또는 RNAi, 스핀들 기둥 4 "초점"을 추진 kinesin 같은 단백질 중 하나와 함께 4 일간의 치료를 받게되었습니다. 이 Ncd RNAi 대우 세포 스핀들 기둥과 무질서 스핀들을 splayed합니다. 스케일 바, 2.5 μm의.
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Discussion
세포 생물학 분야의 경우, 이상적인 시스템은 조작하기 쉬운 유지하기 위해 저렴한 것이고, 기술의 다양한 의무. Drosophila S2 세포는 이러한 요구 사항을 만족하고, 그래서 그들은 빠르게 세포의 증가에 대한 선택의 시스템이되었습니다 생물학 실험실.
우리는 현미경에 대한 S2 세포를 준비하는 방법에 대한 간략한 개요를 제시했습니다. S2 세포의 주목할만한 미덕들은 정상적인 분위기와 실내 온도에서 잘 성장한다는 사실이다, 그러므로, 그들은 특별한 유지 보수 요구하지 않고 오랜 시간 동안 현미경에 남아 있습니다. 그들이 일반적으로 다소 반올림 및 일반 culturing 조건에서 느슨하게 자기편에도 불구하고, S2 세포가 광범위하게 이미징을위한 버리고 유도하실 수 있습니다. S2 세포는 그들이 뛰어난 현미경 표본 제작, 표지 용지에 첨부하여 얇게 퍼져 것입니다 concanavalin 사전 코팅되었습니다 유리 바닥 요리에 대한 교양.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 암 연구소 P30 CA23074, 미국 암 학회 연구 기관 그랜트 74-001-31, 그리고 대학에 의해 부분적으로 지원되었다. 애리조나 GI 스포어 (NCI / NIH CA9506O)의.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S2 cells | ATCC | CRL-1963 | http://www.atcc.org/ |
| S2 cells | DGRC | stock number 6 | https://dgrc.cgb.indiana.edu/ |
| S2 cells | Invitrogen | R690-07 | |
| Sf900 II | Invitrogen | 10902-096 | serum-free medium |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30278 | serum-free medium |
| Insect-Xpress | BioWhittaker | 12-730 | serum-free medium |
| Schneider’s S2 medium | Invitrogen | 11720-034 | Add 10% (final) heat-inactivated FBS to make complete medium. |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438026 | heat inactivated |
| 100x antibiotic solution | MP Biomedicals | 91674049 | contains penicillin (10000 U/mL), streptomycin (10000 μg/mL), and amphotericin B (25 μg/mL) |
| Concanavalin A | MP Biomedicals | 195283 | |
| Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | 32% solution |
| Methanol | Mallinckrodt Baker Inc. | 9049 | anhydrous, ACS grade |
| Molecular sieves | Acros Organics | 19724 | type 3A |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).
- Goshima, G. Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells. Science. 316, 417-421 (2007).
