Summary
Drosophila Schneider (S2) hücreleri genlerin keşfi ve fonksiyonel analiz için giderek daha popüler bir sistem. Amacımız giderek daha önemli bir deneysel sistem S2 hücrelerin mikroskobik teknikler bazı tanımlamak için.
Abstract
Ideal bir deney sistemi, çeşitli teknikler için uygun bakımı için ucuz ve kolay olacağını ve geniş bir literatür ve genom dizisi veritabanı tarafından desteklenen olurdu. Kültüre Drosophila S2 hücreleri, ilişkisiz 20-24 saat eski embriyolar 1 ürün, bütün bu özelliklere sahip. Sonuç olarak, S2 hücreler moleküler sürecin bileşenleri veya ilgi mekanizması kodlayan genlerin keşfi de dahil olmak üzere hücresel süreçlerin analizi için son derece uygundur. Onların yardımcı programı en çok sorumlu olan S2 hücreleri canlı veya sabit olarak korunur kolaylığı, çift iplikli RNA-aracılı (ds) girişim (RNAi), kendine has duyarlılığı ve floresan mikroskopi için tractability hücreleri.
S2 hücreleri, ucuz, piyasada bulunan, tam olarak tanımlanmış, serum ücretsiz medya 2 çok sayıda dahil olmak üzere, çeşitli medya yetiştirilebilir . Buna ek olarak, 21-24 ° C'de en iyi ve hızlı bir şekilde büyür ve konteynerlerin çeşitli kültür olabilir. Memeli hücrelerinin aksine, S2 hücrelerinin düzenli bir atmosfer gerektirmez, ancak bunun yerine normal hava ile iyi ve hatta kapalı şişelerde muhafaza edilebilir.
S2 hücreleri RNAi kolaylığı tamamlayan faz ya da sabit veya canlı hücrelerin floresan mikroskobu ile deneysel olarak indüklenmiş fenotipleri kolayca analiz yeteneği. S2 hücreleri tek tek tabaka olarak kültür yetişen ancak temas inhibisyonu gösterilecek. Bunun yerine, hücreler yoğun kültürlerde koloniler halinde büyürler. Düşük yoğunluklu, S2 kültürleri, yuvarlak ve gevşek bağlı cam veya doku kültürü ile tedavi edilen plastik yetişir. Ancak, S2 hücrelerinin sitoloji lektin, Concanavalin A (CONA) 3 ile kaplanmış bir yüzey üzerine kısaca kültür onlar tarafından yaygın bir biçimde düzleştirmek için onları teşvik ederek büyük ölçüde geliştirilmiş olabilir. S2 hücreleri de stabil bir şekilde etiket yapıları veya canlı ya da sabit hücrelerin ilgi organelleri floresan etiketli işaretleri ile transfekte olabilir. Bu nedenle, hücrelerin mikroskobik analizi için her zamanki senaryo şudur: Birincisi, S2 hücreleri (etiketli işaretleyicileri ifade transgenlerin sahip) bir hedef protein (ler) ortadan kaldırmak için RNAi tarafından tedavi edilir. RNAi tedavi süresi protein farklılıkların izin ayarlanabilir hedef protein canlılığı için önemli ise kinetiği ters çevirin ve hücre travma / ölümü en aza indirmek için. Daha sonra, tedavi edilen hücrelerin yaymak için hücreler neden ve sıkıca cama yapışır CONA önceden kaplı lamel içeren bir çanak aktarılır. Son olarak, hücreler araştırmacı mikroskopi modları seçimi ile görüntülü. S2 hücreler, bu hücrelerin, oda sıcaklığında ve normal atmosfer sağlıklı kalmak, canlı hücreleri, uzun görselleştirme gerektiren çalışmalar için özellikle iyi.
Protocol
1. Mikroskopi için S2 hücrelerin hazırlanması
Schneider S2 hücreleri Oregon R Drosophila tripsinize geç embriyolar elde edildi. Schneider orijinal kültür hücre tiplerinin bir karışımı oluşuyordu ancak 1 ile devam eden geçit daha homojen hale geldi . Hemocyte gibi gen ekspresyonu (onlar fagositik) makrofaj gibi olmak olarak tarif edilmiştir. ATCC, DGRC veya Invitrogen S2 hücreler elde edilebilir.
Büyüme orta A. Seçim
Medya bir dizi kültür S2 hücreleri kullanılmaktadır. Medya hiçbiri,% 5 CO 2 atmosfer gerektiren aşağıda belirtilen .
- Schneider aslında onun tanımlanan orta (Schneider Drosophila orta)% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş. FBS serum ücretsiz medya aşağıda belirtilen daha bu ortamda daha pahalı hale getirir iken, nispeten düşük otofloresans ve böylece canlı hücreler Epifloresans mikroskopi için iyi bir seçimdir. Ancak, indüksiyon öncesi gen "geçirgen" ifadesi neden bu transgenlerin ifade indüklenebilir Metallothionein organizatörü (örneğin, Invitrogen PMT vektör içine subcloned genler) kontrolü altında düşük bir seviyede uyarmak için yeterli metal içermemeli.
- Birkaç serum ücretsiz medya (örneğin, Sf900 II, HyClone SFX-Böcek, Böcek-Xpress) piyasada mevcuttur. Bu ortam nispeten ucuzdur ama Schneider orta kıyasla Metallothionein organizatörü düzenlenmiş transgenlerin kullanırken genellikle yüksek düzeyde ifade uyarmak. Ayrıca, bu medya Schneiders orta / FBS (canlı hücre floresan mikroskobi gerçekleştirmek önemli bir husus) ile karşılaştırıldığında önemli otofloresans üretir.
- İsteğe bağlı olarak, antibiyotikler, orta eklenebilir; bu genellikle penisilin G ve streptomisin sülfat (50-100 ünite / ml ve 50-100 mg / ml nihai konsantrasyonları, sırasıyla). Ayrıca, anti-mantar reaktif, amfoterisin B, 250 ng / ml (son konsantrasyon) eklenebilir.
B. Kültür koşulları
S2 hücreler normal laboratuar sıcaklık ve atmosfer şartları altında kolayca tutulur. Görüntüleme genişletilmiş kez S2 hücreleri canlı hücre ölümünün başlıca nedenleri, dehidrasyon ve fotoğraf toksisite. Dehidrasyon yeterli orta mikroskop çanak tutarak kolayca önlenir. Foto-toksisitesi yüksek yoğunluklu, yüksek enerjili ışık hücrelerin kümülatif maruziyet en aza indirmek isteyen bir yanıltıcıdır sorun yeterli mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip ilginç olayları yakalamak için yeterli sıklıkta görüntüleme.
- S2 hücrelerin doku kültürü plastik büyüyen genellikle yuvarlak ve gevşek yapışmış. Konfluent hücreleri yoğun bir tek tabaka olarak büyür ve sonra, giderek daha fazla hücre kaldırın ve süspansiyon büyümek olacak. Hücreleri kapak kayma üzerine düzleştirmek için uyarılan hem sabit ve canlı hücrelerin mikroskobik görüntüleme, büyük ölçüde geliştirilmiş. Bu hile aşağıda açıklanmıştır (2 A. 2).
2. S2 hücrelerin mikroskobik
A. Canlı hücre mikroskopi
Ters mikroskoplar cam alt yemekleri kaplama canlı S2 hücreleri görselleştirmek için kullanın. Aşağıda açıklanan cam alt yemekleri, hücrelerin, normal kültür durumuna çok benzer bir durumda tutmak ve canlı hücreler mikroskopi dereceli cam aracılığıyla incelenecektir sağlar olacak.
- Cam alt yemeklerin hazırlanması
Bileşenler:- Sylgard 184 silikon elastomer kiti
Bu yemekler için kapak fişleri takmak için tutkal. Kullanmadan hemen önce ağırlık oranı: kiti, 10:1 (sertleştirici reçine) karıştırılır bir iki parça, reçine temel bileşeni ve sertleştirici vardır.
Reçine / sertleştirici karışımı hazırlamak için:- Tekne ağırlığında plastik reçine yaklaşık 5 g tartılır. Not kilo reçine.
- Sertleştirici reçine ağırlığı 0,1 ile çarpılarak gerekli ne kadar hesaplayın. Yeni bir transfer pipetlemeyin kullanarak aynı tartmak tekne sertleştirici bu miktar ekleyin.
- Bileşenlerin iyice karıştırın. Görünür kabarcıklar hakkında Merak etmeyin, yavaş yavaş kaybolur.
- Tutkal artık hazırdır. Bu bal gibi bir tutarlılık ve en az bir saat için kullanışlı olacaktır. 5.5 g tutkal yaklaşık 75 yemekleri yapmak için yeterli, ancak bu tutkal uyguladığınızda ne kadar cimri bağlıdır.
- Plastik 35mm Petri kutularına
Bunun yerine ucuz, standart Petri kapları kullanmak sadece hücreleri (ve plastik) cam alt eklemek zorunda, çünkü hücre kültürü notu yemekleri kullanmayın. Bazı mikroskop aşamalarında 35 tutmak için dairesel kelepçeleri varmm yemekleri; eğer bu var, yemekler kelepçe uygun olduğundan emin olun. Şaşırtıcı bir şekilde, tüm 35mm yemekler aynı dış çapa sahip değil. - Cam kapak
Mikroskop ve ihtiyaçlarına uygun bir kapak fişleri seçin. (Örneğin fotoğraf kazınmış ızgaraları, Elektron Mikroskopi Bilimler, dairesel 23x23 mm, ızgara, hayır. 2, kedi yok. 72.264-23) pahalı özel cam her şey çok daha ucuz toplu kapak cam (örneğin, VWR, 22x22 mm kare cam , 1.5, kedi.. 48.366-227) olabilir. Dikkat: cam Petri kabındaki yapacak delik daha biraz daha büyük (en az 1mm hakkında) olması gerekir, hem de çanak çapı daha küçük olmalıdır. Kare cam satın almak istiyorsanız, tamamen cam kapağı (ve biraz ötesine) dairesel delik olacağını emin olabilir, ancak çanak iki ulaşamayacaktır. Kapak camını temizlemek için tercih ederseniz, bulaşıkları yapıştırma onları önce bunu yapın. - Güç matkap
Biz değişken hız ve sürekli kullanım için bir kilit düğmesi ile bir el matkabı kullanın. Sondaj yemekleri bir matkap basın ile çok daha kolay, ama cam alt yemekleri küçük ölçekli üretim, bir matkap basın satın haklı çıkarmaz. - Matkap ucu
¾ inç maça matkap ucu (: http://en.wikipedia.org/wiki/Drill_bit maça biraz bu web sayfasında resimde) kullanın. Tabii ki, bit çaplı çanak alt deliğin çapı belirler. - Konik taşlama matkap ucu
Kaba kum ve çatal bit olarak aynı çap konik şekilli bir taşlama biraz kullanın. Tüm delikler delinmiştir sonra plastik parçaları, çanak alt delik bu proje kenarında uzak bur Bu bit kullanın. Çanak dış yüzünde plastik parçaları kapağı cam tabak da aynı hizada oturan önleyecektir. Çanak içine kadar yapıştırma küçük plastik parçaları hakkında endişelenmeyin: kapak cam veya hücreleri etkilemez. - Kalın duvarlar strafor kutu
Bu sondaj yüzey olarak kullanılır. Sızdırmazlık bandı şeritleri ile strafor kutunun bir dış yan kapak (1,5 inç Scotch sızdırmazlık bantı); sızdırmazlık bant delme sırasında strafor bit kaçış en aza indirir.
Montaj- Yerde ki alt tarafı çanak strafor kutu karşı; strafor kutu bantlanmış yüzeyinde 35mm Petri kabı alt yarısını yerleştirin. , Çanak kenarlarına sıkıca tutarken, çanak ile bir delik açın. Dikkat: çanak tutan parmakları dönen bir matkap ucu bir inç bir kısmını olacak. Doğal olarak, bu tehlikeli. Çanak dönmeye başlarsa delme işlemini durdurun. Bir matkap basın ve / veya sıkıca çanak tutmak için akıllı bir yol varsa, onları kullanın. Biz bir kaza vardı, ama bu yordamı güvenli hale getirmek için ne gerekiyorsa hiç.
- Tüm yemekler, delme sonra, delik taşlama matkap ucu kullanarak dış kenarı düz. Biz bit sayaç kenar üzerinde yansıtarak, kendi tarafında güç matkap yerleştirin. Matkap, üzerine ağır bir şey ama esnek koyarak yerinde tutulur (kum 10kg içeren ağır plastik torba kullanımı). Matkap sürekli çalışmasını sağlamak için kilit düğmesini kullanın ve sonra her çanak tutan ve taşlama biraz karşı yeni bir delik kaba kenarından uzak pürüzsüz hareket tüm yemekleri jantlar pürüzsüz.
- Bütün çanak dipleri büyük bir behere koyun ve küçük plastik veya strafor, gevşek parçaları (hangi şamandıra) kaldırmak için distile su ile birkaç kez yıkayın. Daha sonra, kuruması için çanak dipleri yatıyordu.
- Yemekleri kuru olduğunda, Sylgard 184 yapıştırıcı hazırlar. Her yemeğin dış yüzeyi üzerinde açılan deliğin etrafında küçük bir daire tutkal sürün. Çok değil tutkal tabi, aslında, çok yapıştırıcı bir karmaşa yapacak. Yapıştırıcı ile temas, delik üzerine bir kapak camına yerleştirin. Kapağı camı düzgün ve eşit çanak karşı oturmak gerekir. Tutkal mükemmel deliği etrafında dağıtılan değilse, sonra yapıştırıcı kapağı cam ve çanak alt arasındaki eksik küçük boşluklar var olabilir. Başlangıçta bu boşlukları hakkında endişelenmenize gerek yok; genellikle yapıştırıcı, bu boşlukları doldurmak için sürünme olacak.
- Kapak cam yapıştırma sonra, geri dönün ve tutkal tarafından kapatıldı yemekleri boşlukları kontrol edin. Herhangi bir boşluk, tutkal boşluğu yakın kapak cam kenarına küçük bir dab geçerli tutkal boşluğuna fitil.
- Kuruması için, yukarı, alt tarafı bir kenara yemekleri ayarlayın. Bu oda sıcaklığında bir gün veya daha uzun sürebilir, ama sıcak bir inkübatör yemekleri koyarak kür oranını artırabilir.
- Steril yemekleri ihtiyacınız olursa, doku kültürü kaputu, çanak dipleri ve kapakları koymak ve bunları yaymak. Çanak dipleri kapakları koymayın. Bunun yerine, kendi iç yüzeyleri korkunç şekilde parçalara açmakUV ampulü ctly karşı karşıya. En az 45 dakika süreyle sterilize UV ışığı açın. Cona kat yemekleri (aşağıya bakın) planlıyorsanız, kaplanmış sonra kadar yemekleri sterilize yoktur.
- Yemekleri artık kullanıma hazırdır.
- Sylgard 184 silikon elastomer kiti
- Concanavalin A
Lektin, Concanavalin A (CONA), CONA 3 ile kaplı bir yüzeye karşı düzleştirmek S2 hücreleri uyarmak için bulundu. S2 hücreleri CONA ile kaplı kapak fişleri üzerine numaralı seribaşı ettiklerinde, yaymak ve mikroskopi için mükemmel örnekler haline.- CONA kat düz kapak fişleri için, temizlenmiş Parafilm bir parçasının üstüne kapak fişleri bir tezgah üstü bantlanmış yayıldı. Yeri 10 μLs sonra bir 0.5 mg / ml her kapak kayma yüzeyi CONA çözüm (steril su) ve tüm üst kapak kayma üzerinde malzeme yayıldı. Kuruduktan sonra, kapak fişleri, temiz, kuru bir kapta saklayın. Kaplı cam bir doku kültürü kaputu UV ışığı ile sterilize edilebilir.
- Cona kat cam alt yemekleri için benzer cam (yani, kapak bakan yan), 10 μLs üst yüzüne CONA çözüm yayıldı. Kuruduktan sonra, yemekler, yukarıda açıklandığı gibi sterilize edilebilir. CONA kaplı yemekleri veya lamelleri oda sıcaklığında saklanır ve hazırlık ay sonra kullanılabilir.
- Görüntüleme
- RNAi tedavi S2 hücreler yavaşça tekrar süspansiyon ve orta 2 mL içeren bir CONA kaplı, cam alt çanak aktarabilirsiniz. CONA kaplı kapak kayma irtibata Sağlıklı hücreler sıkıca yapışır ve yayılmaya başlayacak. Bu işlem yaklaşık 15 dakika belirgin hale gelir, ve 45 dakika ile 1 saat kadar tamamlanması gerekiyor. Not bağlı hücreler CONA kaplı yüzey nedeniyle sıkı ek sitokinez gerçekleştirmez ve zamanla polyploid. CONA kaplı yemekler içine numaralı seribaşı hücreler uzun süre sağlıklı olarak kalacaktır, ama bu yemekler prolifere olmaz.
- Hücreler eklenmiş sonra eski orta autofluorescent ise, orta değiştirilebilir. Bu, küçük derinliklerinde--alan hedefleri ile konfokal veya deconvolution mikroskoplar veya geniş alan mikroskopları kullanarak çalışmalar için gerekli olmayabilir.
- S2 hücrelerin oda sıcaklığında normal / atmosferi, sağlıklı hücrelerin mikroskop sonra hiçbir özel koşullar ya da ekipman ihtiyaç vardır. Biz, genellikle uzun zaman atlamalı filmleri canlı S2 hücrelerinin alır. Pratikte, bu deneyler runtime photobleaching ve fototoksisite olağan sorunları ile sınırlıdır.
B. Sabit hücre mikroskopi
- Cam alt yemekleri vs düz kapak fişleri: Ya bu hücreleri tespit edilebilir. Düz kapak fişleri kullanarak, bireysel bir 35mm çanak (doku kültürü notu olması gerekmez) bir tek CONA kaplı kapak kayma, medya 2 mL ekleyin ve sonra yemeğin içine RNAi-tedavili hücrelerde transfer. Hücreleri kapak kayma bağlı sonra, orta kaldırmak hücrelerin kısaca uygun bir tampon (PBS iyi çalışır) ile yıkayın ve çanak fiksatif (aşağıya bakın). Daha sonra, kapak kayma çanak kaldırılabilir ve immün tarafından, örneğin, ileri işlenmiş.
- Fiksasyon: S2 hücreleri gidermek için çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Iyi fiksasyon yöntemi epitoplar ya da etiketlenen proteinler yok ya da kaybetmeden, bir fiksatif ilgi özellikleri ne kadar iyi korur tarafından tespit edilecektir. Bazı prosedürler, yoğun ya da kompakt yapılarda bulunan bazı proteinlerin epitoplar göstermek için önce bir ayıklama adım fiksasyon gerektirir. S2 hücre literatürde oldukça geniş olduğundan, ilgi S2 hücre yapısı en iyi şekilde düzeltmek için yayınlanan bir yöntem bulmak genellikle mümkün.
- Metanol ortak bir fiksatif. Metanol soğuk olmalı (en az -20 ° C) ve susuz (moleküler elekler [tipi 3A] soyut su metanol eklenebilir). 300 mL susuz metanol ile ilgili bir patlamaya dayanıklı 20 ° C dondurucu bir kapalı 1L cam beher soğutun. Metanol soğuk olduğunda, dondurucuya kaldırabilirsiniz hızlı cam alt çanak (veya bir kapak kayma içeren çanak) orta kaldırmak ve sonra çanak metanol içine hızla aşağı atılmak ve orada bırakın. Metanol beher genellikle yaklaşık bir düzine yemekleri tutar. Hızlı bir şekilde çalışın ve mümkün olduğunca çabuk dondurucu beher (yemekleri içeren) geri dönmek. Fixation 10-15 dk. Daha sonra, beher bulaşıkları kaldırmak onları kalan metanol dökmek ve PBS /% 0.1 Triton X-100 ekleyerek rehidrate. Onlar şimdi standart boyama işlemleri için hazır.
- Formaldehit başka bir ortak fiksatif. Biz tampon% 10 formaldehit (PBS kabul edilebilir, ancak sizin ihtiyaçlarınıza en uygun tampon kullanmak) kullanın. Biz formaldehit bu görece yüksek konsantrasyonu nedeniyle S2 hücreleriaksi tespit işlemi sırasında hücre morfolojisi ve organizasyon korumak yardımcı olacaktır sitoplazmik ara filamentler yoksundur.
- Fiksatif atık behere dökün ve sabit hücreler PBST üç kısa yıkama yıkama (PBS +% 0.1 TritonX-100).
- Sonra, 15 dakika boyunca hücreleri çözüm engelleme 1ml ekleyin. Biz rutin PBST% 5 normal keçi serumu kullanın.
- Engelleme çözüm dökün ve hücreler üzerine doğrudan birincil antikor (çözüm engelleme seyreltilmiş) ekleyebilirsiniz. 100 ul antikor çözüm hücreleri tamamen kapsaması gerekir. Antikor çözüm buharlaşmasını önlemek için geri çanak Petri kapak yerleştirin. Oda sıcaklığında 30 dakika hücrelerin antikor ile inkübe edelim.
- Antikor çözümü çıkarın ve üç PBST yıkar gerçekleştirmek. Yemek için 2 ml PBST eklemek için bir transfer pipetlemeyin kullanın. Her yıkama (girdap çanak gerek) arasında 5 dakika bekleyin.
- Son yıkama dökün ve 100 ikincil antikor ul (çözüm engelleme seyreltilmiş) hücreleri üzerine doğrudan ekleyin. Antikor çözüm buharlaşmasını önlemek için geri çanak Petri kapak yerleştirin. Oda sıcaklığında 30 dakika hücrelerin antikor ile inkübe edelim.
- Ikincil antikor çıkarın ve üç 5 dakika PBST yıkar gerçekleştirmek. Son yıkama damping sonra, hücreler üzerine doğrudan seçtiğiniz montaj medya birkaç damla ekleyin. PBS (9:1) ve 20 saklanan ° C: Biz 0,1 M propyl gallate gliserol bir çözüm içine çözünmüş Petri kapağını değiştirin ve tabak, karanlık bir ortamda saklayın.
3. Sınırlamalar / sorunlar
Herhangi bir deney sistemi ile gibi, sınırlamalar S2 hücrelerinin kullanımı vardır. Öncelikle birçok transforme memeli hücre hatları için mitotik indeksleri kadar 10 kat daha yüksek ise, kültürlü, S2 hücreleri, tipik olarak düşük mitotik indeksi (serum ücretsiz medya yaklaşık% 1) gösterirler. Bu nedenle, mitotik fenotipleri çalışmaları için, hücre kültürleri S2 uygun aşamalı hücreleri bulmak için uzun bir arama gerektirir. İkincisi, hücre döngüsü çalışmaları için, ilaç tedavileri, S2 hücreleri belirli bir hücre döngüsü aşamaları sırasında tutuklanması çok etkilidir. Ancak, kültür memeli hücrelerinde geri dönüşümlü hücre döngüsü tutuklamak etkileri bileşikler S2 hücreleri kolayca arınma değil. Böylece, hızla çoğalan S2 hücreleri senkronize için protokolleri henüz kanıtlanmamıştır. Üçüncü olarak, S2 hücreleri göçmen değil de epitel özelliklerini görüntülemek.
4. Beklenen Sonuçlar
S2 hücreleri için en büyük satış noktası, model sistem olarak bir yardımcı programdır. Onlar ilgi protein hücresel fonksiyonları değerlendirmek için özellikle yararlıdır: S2 hücreler laboratuvarda sentezlenen kolayca (ve nispeten ucuza) RNAi kullanarak dsRNA tarafından tedavi ve canlı hücre analizi ve sabit hücrelerin immünofloresan için iyi hizmet . Buna ek olarak, S2 hücreleri için çok önemli bir avantaj kolaylığı, nispeten ucuz, serum serbest orta ve doku kültürü inkübatör kullanarak laboratuarda muhafaza edilebilir olan.
Tipik bir deneyde, uygun doku kültürü konteyner S2 hücreleri (6 veya 96 plaka söylemek) kaplama, kuyular, ev yapımı dsRNA ekleyerek ve ardından hedeflenen proteinlerin RNAi tarafından yavaş yavaş tükenmiş gibi kültürleri korumak içerecektir. Tüketilmekte hedef proteinlere bağlı olarak, hücreleri hedef protein knock-down bir sonucu olarak, morfolojik ve / veya davranış değişikliği gösterebilir. Minimum hedef protein ifade azaltmak için gerekli protein için özeldir ve Western blot tespit edilmelidir.
Normalde S2 hücreleri plastik ya da cam sıkı bir şekilde uyması değil, ve bu tedavi edilen hücrelerin mikroskobik inceleme gerektiren deneyler için bir sorun teşkil eder. Ancak, S2 hücreler yoğun lektin, Concanavalin A (CONA) ile kaplı bir yüzey kaplama ile sadece düzleştirmek için ikna edilebilir. CONA üzerindeki kaplama bir saat içinde, çoğu hücreleri CONA yüzey (Şekil 1) yaygın bir biçimde yayılan bir sonucu olarak yuvarlak görünümünü kaybetmiştir. Hücreler artık daha fazla işlem (örneğin, fiksasyon ve immün) veya canlı hücrelerin mikroskobik gözlem için hazır.
S2 hücreler de ya da geçici olarak dışsal bir genin veya gen genom (böylece tekrarlanan bölünmeler yoluyla dışsal gen sağlayan bir hücre hattı oluşturma) stably dahil etmek için (çeşitli kimyasal reaktifler veya elektroporasyon kullanarak) transfekte olabilir. Transfections sabit veya canlı hücreleri (Şekil 2), ya da ilgi işareti yapıları pull-down in vivo veya immunoprecipitation deneyler, vb. Yem olarak kullanılır floresan etiketli proteinlerin ifade gibi, pek çok amaca hizmet edebilir
Analiz yöntemi course, deney tarafından ele alınan biyolojik bir soru üzerine. RNAi tedavi S2 hücreleri ortak bir analiz metodu sabit hücreleri (Şekil 3) immünofloresan. Örneğin, immünofloresan genellikle Drosophila gen kütüphaneleri genom ekranlar ile hızla in vivo ilginç faaliyetleri ile proteinleri tespit etmek için kullanılır. Analiz potansiyel fonksiyonel hedef proteinler arasındaki etkileşimleri incelemek için S2 hücrelerinde aynı anda birden çok hedef proteinleri tüketerek daha ayrıntılı olarak yapılabilir. Ve analiz hücreleri yaşamak için dinamik süreçleri RNAi etkisini gözlemlemek için uzatılabilir. CONA kaplı cam alt yemekleri kaplama ve çevre odasının gerek kalmadan, ters bir mikroskop kaç saat için görüntülendi çünkü Yine, S2 hücreler özellikle bu tip analizler için çok uygundur.
Şekil 1. Faz kontrastlı görüntüler Concanavalin A kaplı cam alt çanak kaplama sonra S2 hücreleri (20x büyütme). Numaraları kaplama sonra dakika göstermektedir. Not kaplı kapak astar üzerine düzleştirmek gibi hücrelerin karanlık faz haline. Düzleştirme Hücre 15 dakika (oklar) açıktır ve 60 dakika tamamlanmış olur. Sağ panel: ekli hücrelerinin görüntü Büyütülmüş; uzun ve basık kenar açıkça görülebilir (ok ucu). Ölçeği bar (dört sola panelleri için), 20 mm.
Şekil 2 S2 hücreleri geçici bir füzyon nucleophosmin (çekirdeği için bir işaretleyici) fluorofor erimiş, eGFP (yeşil) oluşan yapı ile transfekte. Bu hücreler bir CONA kaplı cam dipli çanak kaplama, ve sonra DIC ve Epifloresans görüntülenmiş. Ölçeği bar, 15 mm.
Şekil 3 Sabit S2 PLP (yeşil bir centriole işaretleyici) hücreleri immunohistokimyasal, mikrotübül (kırmızı) ve kromozom (mavi) Hoechst-lekeli. Fiksasyon ve immün önce, hücrelerin knock-down bulaşıcı olmayan hastalıkların kontrolü RNAi veya RNAi mili kutup 4 "odaklanma" teşvik kinesin gibi bir protein ya da 4 günlük tedavi tabi tutuldu. NCD RNAi ile tedavi edilen hücrelerde mili direkleri ve düzensiz iğ yayvan unutmayın. Ölçeği bar, 2.5 mikron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücre biyolojisi alan için ideal bir sistem, kolay manipüle korumak için ucuz olacağını ve çeşitli teknikler için uygun. Drosophila S2 hücreleri bu gereksinimleri karşılamak ve böylece hızla büyüyen bir hücre sayısı için tercih edilen sistem haline gelmiştir biyoloji laboratuvarları.
Biz yöntemleri mikroskopi için S2 hücreleri hazırlamak için kısa bir özetini sundu. Dikkate değer bir erdemdir S2 hücreler normal atmosfer ve oda sıcaklığında iyi büyür gerçeği, bu nedenle, herhangi bir özel bakım gereksinimleri olmadan uzun süre mikroskop sol. Genellikle biraz yuvarlak ve normal kültür koşulları altında gevşek yapışmış olsa da, S2 hücreler yoğun görüntüleme için düzleştirmek için ikna edilebilir. S2 hücreleri, mükemmel mikroskopi örnekleri, kapak kayma takın ve ince yaymak Concanavalin önceden kaplanmış cam alt yemekler kültüre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü P30 CA23074, Amerikan Kanser Derneği Kurumsal Araştırma Bursu 74-001-31 ve Üniv tarafından desteklendi. Arizona GI SPOR (NCI / NIH CA9506O).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S2 cells | ATCC | CRL-1963 | http://www.atcc.org/ |
| S2 cells | DGRC | stock number 6 | https://dgrc.cgb.indiana.edu/ |
| S2 cells | Invitrogen | R690-07 | |
| Sf900 II | Invitrogen | 10902-096 | serum-free medium |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30278 | serum-free medium |
| Insect-Xpress | BioWhittaker | 12-730 | serum-free medium |
| Schneider’s S2 medium | Invitrogen | 11720-034 | Add 10% (final) heat-inactivated FBS to make complete medium. |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438026 | heat inactivated |
| 100x antibiotic solution | MP Biomedicals | 91674049 | contains penicillin (10000 U/mL), streptomycin (10000 μg/mL), and amphotericin B (25 μg/mL) |
| Concanavalin A | MP Biomedicals | 195283 | |
| Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | 32% solution |
| Methanol | Mallinckrodt Baker Inc. | 9049 | anhydrous, ACS grade |
| Molecular sieves | Acros Organics | 19724 | type 3A |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).
- Goshima, G. Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells. Science. 316, 417-421 (2007).
