Summary
Стимул-вызвали [Са
Abstract
Люминесцентной микроскопии клеток, загруженных с люминесцентными, Ca
Protocol
Сперма от здоровых плодородных мужчин с нормальным анализ спермы, как правило, подготовлены для работы с изображениями в следующем.
- Семен образцы хранятся при температуре 37 ° С в течение не более 30 мин. Клетки выделяют из семенной плазмы подплыть на дополнена сбалансированным Эрла раствор соли (sEBSS, мм: 1,8 CaCl 2 · 2H 2 O, 5,37 KCl, 0,81 MgSO 4 .7 H 2 O, 26,2 NaHCO 3, 1,0 NaH 2 PO 4. 2H 2 O, NaCl 116,4, 55,6 D-глюкозы, 2,73 Na пируват, лактат 41,8 Na) с добавлением 0,3% угля de-lipidated/fatty кислоты свободной фракции V BSA (качество БСА имеет решающее значение для успешной капацитации спермы). 1 мл sEBBS является пипеткой в каждую из серий по 5 мл пробирок и осторожно underlayered 0,3 мл спермы. После инкубации в течение 1 часа (37 ° С, 6% CO 2) верхнюю 0,7 мл мягко удалены друг от трубки и объединены. 10 мкл спермы подвески разбавляют 90 мкл 1% (об. / об) формалина для иммобилизации клеток, то сперма учитываются в камере Нойбауэр. Плотность клеток в суспензии корректируются (с sEBSS) до 6 миллионов клеток / мл.
- Затем образец разделить на порции по 200 мкл в слабо ограничен трубами и инкубировали (37 ° С, 6% СО 2) в течение 5-6 ч, чтобы капацитации.
- Покровные стекла (22x50 мм), которые ранее лечились с поли-D-лизина. 10 мкл поли-D-лизина раствор (10% вес / объем) применяется как количество малых капель к центру покровное. Поли-D-лизин затем дают высохнуть на воздухе. Это может быть на сцене и подогревом должна быть полной сухости. Покровное крепится с помощью вакуумной смазки для закрытых, специально построенный, perfusable, поликарбонат изображения камеры (размерами 35 мм х 20 мм х 5 мм, мощность ≈ 180 мкл). Похожа на камеру Warner RC20 поли-D-лизин- покровное покрытие составляет основу камеры, когда клетки просматривать на инвертированный микроскоп и 12 мм диаметр кругового покровное формы верхней поверхности камеры, позволяя пропускания света.
- Орегон Зеленый BAPTA1-AM (ОГБ) или кальция Зеленый 1-AM используются для маркировки клеток. ОГБ готовят растворением в ДМСО. Pluronic F127 кислоты (моющее средство) включена в ДМСО для предотвращения "слипания" с красителем. Это может быть подготовлен в лаборатории (100 мг Pluronic в 0,5 мл ДМСО), непосредственно перед употреблением, или может быть приобретен заранее подготовленные. 20 мкл добавляют 50 мкг аликвоту ОГБ (2,5 мг / мл). Флакон можно хранить размороженное для дальнейшего использования.
- После капацитации из спермы (5-6 ч в sEBBS, 37 ° С, 6% CO 2) трубка выбран для работы с изображениями и 1,2 мкл раствора ОГБ добавляется, что дает конечной концентрации 10 мкМ. Трубка затем инкубировали еще в течение 40 мин, после чего клеточная суспензия мягко вводят в приток порт изображений с камеры P1000 (синий) кончиком пипетки. Камера помещается в инкубатор, поли-D-лизин покрытием покровное стороной вниз, в течение 20 мин. Клетки, как правило, плавают по поверхности камеры и будет придерживаться поли-D-лизин покрытием области.
- Камера в настоящее время монтируется на микроскоп, подключенный к перфузионной аппаратуры и перфузии при температуре около 0,5 мл / мин. Роликовый насос каналы солевым в камеру и переполнения выходного отверстия удаляется всасывающий насос с ловушкой. Препарат остается в темноте в течение не менее 10 мин в то время как свободные клетки и внеклеточной красителя удаляются перфузии камеры. Температурная стабильность является критически важным, поскольку малые флуктуации могут не только влиять на ячейки Са 2 + гомеостаз, но могут также повлиять К сут красителя. Эксперименты, как правило, производится при 25 ° С, достигается за счет поддержания температуры темной комнате, на этом уровне. Мы обнаружили, что поддержание комнатной температуры на требуемом уровне обеспечивает большую температуру и сосредоточиться стабильность, чем при использовании контролируемой температурой сцене или термостатом нагреватель на солевой приток.
- Клетки смотреть под фазового контраста (40x или 60x нефти погружение) объективные и области для работы с изображениями выбран. Часть поли-D-лизин покрытием области, которая находится рядом с входной порт является предпочтительным, где солевой поток ламинарный и последовательным. Важно также использовать области, где плотность клеток подходит (чрезмерная плотность влияет на качество и целостность данных, передаваемых через датчик сигнала от соседних клеток), и где клетки адекватно прилагается, но жгутиковых деятельности заметны. Изображение фазового контраста сохранен. Микроскоп затем переключился на режим флуоресценции (возбуждение 480 нм, излучение 540 нм), а время экспозиции сокращается до минимума, необходимого для получения четкого изображения флуоресценции (обычно 50-200 мс).
- Эксперимент начался, активизируя временных рядов получения изображений программное обеспечение (IQ). Обычно изображения, полученные в 0,1 Гц и освещение ограничено периодами получения изображений только с помощью softwaповторно выдержку. Гораздо большие ставки получения изображения можно использовать, но необходимо учитывать для задач отбеливания и генерации артефактов из-за фото-повреждения клеток (см. обсуждение). IQ (и большинства других программных платформ приобретение) позволит в режиме реального времени графический флуоресценции в ходе эксперимента.
- После контрольного периода в 3-5 минут продолжительность манипуляции солевые компоненты (такие как [Са 2 +] о) и применения препаратов достигается путем замены физиологического раствора в перфузионной заголовка. Время добавления каждого стимула отметить так, чтобы время прибытия в камеру изображения можно рассчитать, что обеспечивает достаточную точность для оценки медленные ответы, описанные здесь (дискретизации 0,1 Гц). Для более быстрого ответа большей точностью может быть достигнуто путем добавления раздражители непосредственно соленый поток через второй порт приток, как это предусмотрено в Warner RC20 камеры.
- Изображения анализируются оффлайн, используя IQ. Интересующие регионы (трансформирования) нарисованы вокруг каждой ячейки (или его части клетки), а также ячейки зоны свободной выбран (для автоматического вычитание фона с помощью программного обеспечения. Изображение серии затем проверяется, чтобы удалить клетки, которые погибли или подверглись акросомы реакции ( который выглядит как большой и быстрый рост флуоресценции следуют потеря цитоплазматического краситель) в ходе эксперимента, и те, которые показали достаточную движение привести к появлению артефактов при анализе как временных рядов.
- Времени интенсивности флуоресценции серии Затем полученные для каждого ROI, и эти данные анализируются в автономном режиме в Excel. Первоначально флуоресценции нормирована на среднее значение, полученные в ходе контрольного периода, используя уравнение R = [(FF отдыха) / F отдыха] х 100%, где R является% изменения флуоресценции по сравнению с контрольной период, F является интенсивность флуоресценции в т время и F остальное среднем не менее 30 определений F, полученные в ходе контрольного периода.
Представитель Результаты
На рисунке 1 показана серия изображений из эксперимента, в котором клетки стимулировали 3 мкМ прогестерона. Верхнем ряду и кино 1, показывают, флуоресцентные изображения в серого и то же маги приведены ниже (и в кино 2) в псевдо-(таблицы поиска '16_colors "в изображение J), где в« холодных »цветов указывают на низкую интенсивность и люминесцентные теплые цвета указывают на высокую интенсивность флуоресценции. Клетки могут быть просмотрены в псевдо в ходе эксперимента, используя справочные таблицы в IQ, но с использованием серой шкалы в целом является более информативным для оценки. Ли клетки хорошо маркирован. Первые два изображения были собраны в 0 с и 100 с после начала записи. Флуоресценции должно быть стабильным и имеет тенденцию быть сильной в сообщение акросомную района и спермы шеи. Прогестерон вошли изображения камеры примерно в 175 с и 3-й и 4-го изображения (180 с и 220 с), показывает быстрый рост [Са 2 +] я (флуоресценция), происходящих в задней области головы и шеи клетки. Последующие изображения при 290, 360, 740, 990 и 1440 с, показывающий распад начального [Са 2 +] я переходные и развитию вторичных устойчивый подъем. На рисунке 2 показана таблица анализа, конвертирования сырого флуоресценции значения для каждого ROI к нормированным флуоресценции (% изменения по сравнению с флуоресценции контрольного периода) Рисунок 3 показывает время-нормированный флуоресценции участков для 3 клеток с "типичными" ответы на 3 мкМ прогестерона.
Рисунок 1. Пример данных из ячейки стимулировали прогестерона. Серия флуоресцентные изображения в градациях серого (верхний ряд) и псевдо (нижний ряд) показаны. Время точки 0, 180, 220, 290, 360 и 990. 3 мкМ прогестерона вошли изображения камеры при температуре 175 С. Трансформирования приведены в первой панели.
Рисунок 2. Анализ одной клетке флуоресценция данных в Excel. Цифры в черном являются временные ряды флуоресценции данных, расположенных по вертикали. Цифры в красный (ниже) нормированы данные, полученные с помощью уравнения, приведенные в тексте. На графике показана нормированная флуоресценцию времени участок для сотовых 64 в этом эксперименте, который, при стимуляции, показывает, переходные рост флуоресценции затем медленный подъем и ряд небольших колебаний.
Рисунок 3. Флуоресценция времени следы на 3 отдельных клеток, выраженное в% изменения по отношению к контрольным значением .. 3 мкМ прогестерон был добавлен в момент отмечен стрелкой. Пунктирная линия показывает, означает контроль флуоресценции.
Discussion
Когда выполнены успешно, эта методика позволяет записывать распределения и кинетика спонтанного и индуцированного Са 2 + сигналов в человеческой сперме. Ответы могут быть получены из большого количества клеток (до 200), который является важным, поскольку человеческий сперматозоид может показать большое изменение в их спонтанного и вынужденного Са 2 + сигналы. Успешное маркировки и выживания клетки во время записи сильно зависит от качества образцов. Бедные образцы дают плохие маркировки, исчерпывающие ответы и клеток может погибнуть во время записи.
Человек сперматозоиды очень чувствительны к фото-повреждениям и соответственно, мы используем минимально необходимой освещенности (интенсивности и времени экспозиции) в целях обеспечения максимальной выживаемости клеток и свести к минимуму артефакты из-за гибели клеток. Высокой чувствительности камеры (разрешение использования низкой интенсивности освещения) является большим преимуществом, так как камера будет забрать слабая флуоресценция. Back-подсветкой, EM-CCD камеры особенно хорошо подходят, хотя и очень дорого. Светодиодная подсветка (вместо использования ксенона или ртутной лампы с возбуждением фильтр также улучшает выживаемость клеток (Nishigaki и др., 2006).
Мы не используем Фура-2, несмотря на очевидные преимущества соотношение метрике изображений, потому что Фура требует возбуждения УФ-светом и потому, что нужно взять два изображения для каждого отношения. Для данных, полученных с одной длиной волны, видимый свет красители, нормализация интенсивности флуоресценции в значительной степени компенсирует разницу в загрузке красителя между клетками, но не для красителя распределение внутри отдельной клетки, и это нужно иметь в виду. Хотя одно красителей длина волны может, в принципе, быть откалиброваны, точность техника бедных и мы не пытаемся это сделать.
В то время как соотношение данных, полученных с Фура-2 (или выбросов соотношение красителя индо), даже без калибровки, дайте приемлемо точное представление относительные изменения [Са 2 +] я, интенсивности флуоресценции красителей одной длине волны далека от линейной , связанные с [Са 2 +] i. За наиболее полезную часть кривой насыщения отношений для одной длины волны красители обычно приближается к логарифмической. Мы в настоящее время используют Орегон Зеленый BAPTA-1 (рис. 4), поскольку он чувствителен даже к небольшим изменениям [Са 2 +] я близка к уровню отдыха с (50-100 нм). Когда [Са 2 +] я поднимается выше 1 мкМ ответов будет недостаточно представлены с точки зрения изменения и флуоресценции красителя может насытить. Вариант для совершенствования техники, не прибегая к УФ-возбуждения заключается в двойной нагрузки клеток с красителем, таких как Fluo-3 и Фура красный. Оба могут возбуждаться на 488 нм, но одновременное их ответы очень разные. Запись излучения на 540 и 650 нм обеспечивает коэффициент, который может обеспечить лучший метод для точного мониторинга [Са 2 +] я (Haughland, 2002) и могут быть применимы к спермы (Nisigaki и др., 2006).
Рисунок 4. Отношения между свободными [Са 2 +] (нМ) и флуоресценции излучения на пике волны (около 525 нм) для Орегон Зеленый BAPTA-1 и Орегон Зеленый BAPTA-2. OGB1 дает более высокую флуоресценции при отдыхает [Са 2 +], но насыщает на более низких уровнях и, следовательно, имеет меньший диапазон полезной. Данные для этих участков были получены из молекулярных проб руководства (Haughland, 2002).
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансируется за счет Wellcome Trust, Совет по медицинским исследованиям, Королевского общества, Бирмингем наукограда и целевого Бесплодие исследований. Мы хотели бы отметить экспертную помощь исследований Керн в строительстве и интеграции изображений буровых установок.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low light level Camera | QImaging | Rolera XR | |
| Oregon Green BAPTA-1 | Invitrogen | 06807 | |
| Imaging Software | Andor | IQ | |
| Imaging Software | National Institutes of Health | Image J | Public domain software |
| LED illumination system | Cairn Research | Opto LED | |
| Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) | Invitrogen | P3000MP |
References
- Haughland, R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. , 9th Edition, Molecular Probes. Eugene, OR. (2002).
- Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging. Biotechniques. 41, 191-197 (2006).
