Summary
Hier wird ein effektives Protokoll zur schnellen Blutperfusion vorgestellt, um Gewebeproben von afrikanischen Krallenfröschen für Transkriptomik- und Proteomik-Studien vorzubereiten.
Abstract
Xenopus sind seit über 100 Jahren leistungsfähige Modellorganismen für das Verständnis der Entwicklung und Krankheit von Wirbeltieren. Hier wird ein schnelles Blutdurchblutungsprotokoll bei Xenopus definiert, das auf eine konsistente und drastische Reduzierung des Blutes in allen Geweben abzielt. Die Perfusion erfolgt durch das Einführen einer Nadel direkt in die Herzkammer und das Pumpen von heparinisierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch das Gefäßsystem. Die Prozedur kann in ca. 10 Minuten pro Tier durchgeführt werden. Das Blut wird von einigen wenigen Proteinen und Zelltypen dominiert, die sehr häufig vorkommen, was zu zahlreichen Problemen führt, da diese Proteine die meisten anderen Moleküle und Zelltypen von Interesse maskieren. Die reproduzierbare Charakterisierung von adulten Xenopus-Geweben mit quantitativer Proteomik und Einzelzell-Transkriptomik wird von der Anwendung dieses Protokolls vor der Organentnahme profitieren. Die Protokolle für die Gewebeentnahme sind in Begleitpapieren definiert. Diese Verfahren zielen auf die Standardisierung von Praktiken bei Xenopus unterschiedlichen Geschlechts, Alters und Gesundheitszustands ab, insbesondere bei X. laevis und X. tropicalis.
Introduction
Die Ganzkörperperfusion von Amphibien wird routinemäßig zum Zwecke der Konservierung und Fixierung durchgeführt 1,2,3,4,5,6. Diese Verfahren erfolgen jedoch in einem Tempo, das die Anzahl der frischen Proben, die pro Tier entnommen werden können, begrenzt. Das Ziel dieser Arbeit ist es, ein effektives Blutperfusionsprotokoll in Xenopus zu entwickeln, wobei die Geschwindigkeit der Technik im Vordergrund steht. Das Protokoll dauert weniger als 10 Minuten pro Tier für X. tropicalis und weniger als 15 Minuten pro X. laevis-Tier. Die sekundären Prioritäten sind die einfache Replikation und die Verwendung von leicht zu beschaffenden Geräten, so dass qualitativ hochwertige Proben zwischen den Xenopus-Laboren ausgetauscht werden können.
Xenopus-Frösche werden in der biomedizinischen Forschung häufig eingesetzt, um grundlegende biologische und pathologische Prozesse zu untersuchen, die über Arten hinweg konserviert sind. Dieser Tetrapode hat eine engere evolutionäre Beziehung zu Säugetieren als andere aquatische Modelle, da er Lungen, ein Dreikammerherz und Gliedmaßen mit Fingern hat. Die internationale Gemeinschaft nutzt Xenopus effektiv, um durch eingehende Krankheitsmodellierung und molekulare Analyse der krankheitsbedingten Genfunktion ein tieferes Verständnis menschlicher Krankheiten zu erlangen. Die zahlreichen Vorteile von Xenopus als Tiermodell machen sie zu unschätzbaren Werkzeugen, um die molekularen Grundlagen der menschlichen Entwicklung und Krankheit zu untersuchen. Zu diesen Vorteilen gehören: große Eizell- und Embryogröße, hohe Fruchtbarkeit, einfache Unterbringung, schnelle äußere Entwicklung und einfache genomische Manipulation. Es wird geschätzt, dass Xenopus ~80% der identifizierten menschlichen Krankheitsgene teilen7.
Im Vergleich zu populären Säugetiermodellen ist Xenopus ein schnelles, kostengünstiges Modell, das sich leicht mit dem Morpholino-Knockdown und der Verfügbarkeit effizienter Transgene und gezielter Genmutationen unter Verwendung von CRISPR8 auszeichnet. Quantitative Massenspektrometrie und Einzelzell-Transkriptomik wurden erfolgreich auf Xenopus-Embryonen angewendet9,10, aber ein aktueller Zellatlas von Xenopus laevis zeigt, dass die Zusammensetzung der meisten Gewebe von Blutzelltypen dominiert wird 11. Durch die Entwicklung einer Technik, die Gewebe schnell ausblutet, und unter Verwendung von gekühlten Medien wird die Probenfrische durch die Perfusion nur minimal beeinträchtigt. Dies ist besonders wichtig für Anwendungen, bei denen es darum geht, eine physiologisch ungestörte mRNA- oder Proteinexpression zu profilieren.
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Protocol
Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit den Regeln und Vorschriften der Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3) durchgeführt.
ANMERKUNG: Obwohl die beschriebene primäre Methode der Euthanasie von der American Veterinary Medical Association12 als akzeptable Technik für die Euthanasie angesehen wird, wurde nicht festgestellt, dass sie zum Stillstand eines Herzschlags führt13. Auch die häufig angewandte sekundäre Methode des doppelten Sagenmachens verhindert dies nicht, ebenso wenig wie die Entnahme des Herzens aus dem Tier. Die Ausblutung von betäubten Tieren gilt als humane und effektive Methode für eine erfolgreiche Euthanasie12. Da die Erhaltung von frischem Gewebe durch Euthanasie das Ziel dieses Protokolls ist, ist es von Vorteil, dass das Herz während der primären Euthanasie mit MS-222 weiter schlägt und dass die Perfusion selbst eine sekundäre Euthanasiemethode durch Ausblutung ist.
1. Vorbereitung
- Stellen Sie sicher, dass die Forschungseinrichtung die in diesem Protokoll beschriebene Euthanasie- und Perfusionstechnik genehmigt hat.
- Bereiten Sie eine Lösung aus 5 g/l MS-222 (Tricainmethansulfonat) und 5 g/l Natriumbicarbonat vor. Das Volumen sollte größer sein als das Volumen, das erforderlich ist, um die einzuschläfernden Tiere vollständig zu bedecken. Überprüfen Sie den pH-Wert, um sicherzustellen, dass er ≥7 beträgt.
- Bereiten Sie 500 μl 180 U/ml Heparin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) pro X. laevis oder 200 μl pro X. tropicalis vor.
- Führen Sie eine primäre Euthanasie durch, indem Sie den Xenopus in diese Lösung geben (aus Schritt 1.2). Das Tier bleibt insgesamt 1 Stunde unter Wasser.
- Bestätigen Sie, dass der Xenopus seine Schmerzreaktion verloren hat, indem Sie den Fuß 15 Minuten nach der Euthanasie einklemmen. Wenn das Tier reaktiv ist, geben Sie es der Euthanasielösung zurück, bis diese Reaktion verloren geht.
- Wiegen Sie den Xenopus und nehmen Sie alle zusätzlichen Messungen vor, die vor der Probenahme erforderlich sind.
- Injizieren Sie X. laevis mit einer 31-G-Nadel mit 250 μl und X. tropicalis mit 100 μl 180 U/ml Heparin in PBS (aus Schritt 1.3) in die Muskulatur jeder Vordergliedmaße.
- Bereiten Sie eine Lösung von 1 ml/g des Tiergewichts von 54 U/ml Heparin in PBS-Perfusat vor. Personen, die mehr Erfahrung mit diesem Protokoll haben, können feststellen, dass weniger Medien erforderlich sind, um die Perfusion abzuschließen.
- Verwenden Sie eine 22 g Injektionsnadel für die Perfusion von X. laevis und eine 25 g Injektionsnadel für X. tropicali s. Stumpfen Sie die Perfusionsnadel, indem Sie die Spitze mit einem Drahtschneider abschneiden (Abbildung 1)14.
Anmerkungen: Dies verringert die Wahrscheinlichkeit, dass die Nadel durch die Herzkammer perforiert, wenn sie verschoben wird. Zusätzlich zur Abstumpfung kann die Nadel mit einem Schleifstein oder einer Feile leicht abgeschliffen werden, bleibt aber immer noch scharf genug, um die Herzkammer zu durchbohren. - Bereiten Sie die Pumpe vor, indem Sie die gekürzte Nadel anbringen und 54 U/ml heparinisiertes PBS-Perfusat zirkulieren lassen (aus Schritt 1.8). Stellen Sie sicher, dass alle Luftblasen aus dem Schlauch entfernt werden, um die Möglichkeit einer Luftembolie auszuschließen, die zu einer verminderten Perfusionseffizienz oder einem Versagen führt (siehe Tabelle 1). Bewahren Sie das Perfusionsmedium für die Dauer des Eingriffs auf Eis auf.
- Wenn die Pumpe nicht programmierbar ist, messen Sie bei eingesetzter Nadel das Fördervolumen des Mediums unter den verschiedenen Einstellungen, um zu bestimmen, welche Einstellungen 5 ml/min und 10 ml/min am nächsten kommen. Diese Durchflussraten werden unabhängig von der Art verwendet. Wenn die Perfusionspumpe programmierbar ist, kalibrieren Sie sie mit eingesetzter Nadel gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Platzieren Sie die Dissektionsfläche (Schale oder Schaumstoffplatte) schräg in einem sekundären Behälter oder ordnen Sie sie so an, dass sie den Blutabfluss erleichtert.
- Sobald der Frosch 1 h in der Lösung war, ist die primäre Euthanasie abgeschlossen. Entfernen Sie den Frosch und überprüfen Sie den Verlust der Schmerzreaktion erneut, indem Sie einen Fuß kneifen lassen.
- Legen Sie den Frosch auf den Rücken und stecken Sie jedes Glied fest (Abbildung 2). Wenn das Gewebe der Gliedmaßen erhalten werden muss, können dünne Stifte durch die Finger oder U-förmige Klammern um die Gliedmaßen gelegt werden.
- Schneiden Sie mit einer Sezierschere durch die Haut, die Mittellinie hinauf und dann seitlich, so dass zwei Klappen entstehen. (Abbildung 2)
- Fassen Sie die Linea alba mit einer Pinzette und ziehen Sie sie von der Zölomhöhle weg (Abbildung 3). Schneiden Sie vorsichtig mit einer Schere durch die Muskulatur. Machen Sie zwei Klappen aus der Hohlraumwand und schneiden oder stecken Sie alle Klappen aus dem Weg.
- Verwenden Sie eine Dissektionsschere, um die Coracoideusknochen zu durchtrennen und überschüssiges Gewebe wegzuschneiden, um einen besseren Zugang zum Herzen zu erhalten (Abbildung 3).
- Das Herz sollte noch schlagen. Wenn das Herz vor der Perfusion aufgehört hat zu schlagen, beachten Sie, dass die Frische der Probe beeinträchtigt wurde.
2. Perfusion
- Identifizieren Sie den Magen und verschieben Sie ihn sanft so, dass er sich auf dem linken Leberlappen (auf der rechten Seite des Betrachters) befindet und sein Gefäßsystem für die Dauer des Eingriffs sichtbar ist. Identifizieren Sie eine Lunge und fassen Sie sie mit einer Gewebezange an der Spitze. Ziehen Sie die Lunge aus der Zölomhöhle heraus und stecken Sie sie durch die Spitze (Abbildung 4). Tun Sie dies vorsichtig, da geplatzte Blutgefäße nicht gut durchbluten. Achten Sie darauf, ob Blut im Lappen sichtbar ist, da dies die Fähigkeit beeinträchtigt, den Abschluss des Verfahrens zu bestimmen.
- Machen Sie ein Bild der Zölomhöhle, um die Perfusionseffizienz besser beurteilen und möglicherweise abnormales Gewebe zu einem späteren Zeitpunkt zu identifizieren.
- Identifizieren Sie das dünne Perikard und ziehen Sie es mit einer Gewebezange (Abbildung 5). Perforieren Sie den Herzbeutel vorsichtig mit der Spitze der Iridektomieschere und achten Sie darauf, das darunter liegende Gewebe nicht zu schneiden. Schäle den Herzbeutel von den drei Herzkammern weg.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um den Ventrikel sanft an seiner Spitze zu fassen. Üben Sie einen begrenzten Druck aus, damit zwischen den Zugflächen der Pinzette genügend Platz für den Durchgang der Perfusionsnadel vorhanden ist (Abbildung 6).
- Führen Sie die Nadel durch den Verschluss der Pinzette in die Kammer der Herzkammer ein und achten Sie darauf, dass sie nicht durch die Herzkammer perforiert wird (Abbildung 7). Klemmen Sie die Gewebepinzette mit einem Nadelhalter mit einem Hämostaten fest.
HINWEIS: Diese Technik stabilisiert die Position der Nadel, die immer noch scharf ist. Das Einklemmen der Nadel direkt in die Herzkammer führt ebenfalls zu unnötigen Schäden, was das Umspannen erschwert, falls dies erforderlich ist (siehe Tabelle 1). - Starten Sie den Durchfluss der Pumpe bei ca. 5 ml/min. Die drei Kammern des Herzens und des Truncus arterielle werden anschwellen (Abbildung 8; siehe Tabelle 1).
- Lanzen Sie mit einer Schere vorsichtig die rechte Ohrmuschel (links vom Betrachter); Blut wird herausfließen. Stellen Sie die Flussrate auf 5 ml/min ein oder erhöhen Sie sie auf 10 ml/min.
- Fahren Sie fort, bis die Magengefäße blass sind (siehe Tabelle 1), dann lanzen Sie die linke Ohrmuschel des Herzens (rechts vom Betrachter). Wenn die Flussrate immer noch 5 ml/min beträgt, erhöhen Sie sie auf ca. 10 ml/min.
- Verwenden Sie eine Transferpipette, um die Zölomhöhle in Perfusionsmedien zu spülen, um die Sichtbarkeit zu erhalten und die Farbe des Perfusats, das aus den Ohrmuscheln fließt, besser beurteilen zu können.
- Lassen Sie die Nadel an Ort und Stelle, bis das aus den Ohrmuscheln fließende Perfusat klar ist (siehe Tabelle 1) und die Lunge ihren roten Farbton verloren hat (siehe Tabelle 1; Abbildung 9).
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Representative Results
Nach erfolgreicher Durchblutung sind alle Gewebe (mit Ausnahme der Leber bei pigmentiertem Xenopus) deutlich heller und weniger durchblutet. Die großen Blutgefäße werden weniger auffällig (Abbildung 10), und das Gewebe (mit Ausnahme der Leber) wird nach der Entnahme sauber im Puffer gespült. Während die erfolgreiche Durchführung des Protokolls letztlich nur durch die Qualität der Daten aus exbluteten Gewebeproben bestätigt werden kann, werden in der Tabelle zur Fehlerbehebung einige typische Probleme, ihre möglichen Ursachen und vorgeschlagene Abhilfemaßnahmen aufgeführt (Tabelle 1 und Abbildung 11).
Abbildung 1: Unbeschnittene und beschnittene Nadeln14. Stumpfen Sie die Nadel mit einer Drahtschere, indem Sie die Spitze abschneiden. Es wird scharf genug sein, um das Herz zu durchbohren, aber eine Perforation der Herzkammer ist im Falle eines menschlichen Versagens weniger wahrscheinlich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Ausgewachsenes Weibchen X. tropicalis , das durch jedes Glied gesteckt ist. Verwenden Sie eine gezahnte Präparierzange, um die Haut in der Nähe der Kloake zu ziehen, und lernen Sie, sie mit einer Sezierschere zu perforieren und zwei Lappen zu erstellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Muskelwand. Wenn die ventrale Haut geöffnet, aber die Muskelwand intakt ist, ist die Linea alba sichtbar. Um die Wahrscheinlichkeit einer Schädigung des darunter liegenden Gewebes zu verringern, fassen Sie die Linea alba und ziehen Sie sie vor dem Schneiden. Die Coracoideusknochen sind durch das Bauchfell sichtbar. Sobald die Zölomhöhle geöffnet ist, sollten diese Knochen reduziert werden, um einen besseren Zugang zum Herzen zu ermöglichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Die Zölomhöhle eines ausgewachsenen X. tropicalis-Männchens. Die Coracoideusknochen wurden verkleinert, so dass der Zugang zum perikardumschlossenen Herzen möglich ist. Der Magen wurde vor den linken Leberlappen verschoben und sein Gefäßsystem ist deutlich sichtbar. Die linke Lunge wurde an der Spitze aus der Zölomhöhle herausgezogen und festgesteckt, damit sie sich während des Spülvorgangs nicht zurückzieht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Perikard. Der Herzbeutel ist eine dünne, zähe Membran, die das Herz umschließt. Fassen Sie den Herzbeutel mit einer Gewebezange vorsichtig an und perforieren Sie ihn dann mit der Spitze einer Iridektomieschere. Sobald es perforiert ist, schälen Sie es vom Herzen weg. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Diagramme zur Platzierung von Nadeln in der Herzanatomie . (A) Ventrales Diagramm eines X. laevis-Herzens. (B) Herzdiagramm mit entferntem Herzbeutel, das die korrekte Platzierung von Nadel und Klemme zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Foto der Herzanatomie und der Nadelplatzierung. Wenn der Herzbeutel entfernt wurde, sind die drei Kammern des Herzens und des Truncus arterielle gut sichtbar. Fassen Sie den Ventrikel mit einer Pinzette vorsichtig an seiner Spitze und führen Sie dann die Nadel durch die Pinzette ein. Achten Sie darauf, den Ventrikel oder andere Kammern nicht unnötig zu beschädigen, da dies die Perfusionseffizienz beeinträchtigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8: Die Perfusion ist im Gange. Die rechte Ohrmuschel wurde gestochen, und die Herzkammer, der Truncus arterielle und die linke Ohrmuschel sind sichtbar angeschwollen. Der Magen bleicht und sowohl die vom Tier austretenden Medien als auch das Lungengewebe sind stark mit Blut gesättigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 9: Die Zölomhöhle nach erfolgreicher schneller Perfusion und Spülung. Die Gefäße des Magens und anderer Organe sind nicht mehr gut sichtbar. Sofern es sich bei dem Xenopus nicht um einen Albino handelt, bleibt die Leber stark pigmentiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 10: Gewebeproben eines nicht perfundierten und perfundierten Albino-Männchens X. laevis. Die Unterschiede in der Pigmentierung und Sichtbarkeit der Gefäße sind ausgeprägt. Alle Proben befinden sich innerhalb von Bohrlöchern mit einem Durchmesser von 3,5 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 11: Fehlerbehebungsdiagramme eines Xenopus-Herzens . (A) Der Ventrikel hat eine Perforation (in rot); Diese Perforation wird durch die Pinzette isoliert und hat keinen Einfluss auf die Perfusionseffizienz. (B) Ein Herz mit einer stark geschädigten Herzkammer. Die Nadel kann in den Truncus arterielle Arterien eingeführt und festgeklemmt werden. Bei dieser Technik ist es besonders wichtig, darauf zu achten, dass die Nadel gut abgestumpft ist14. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 12: Beurteilung der Perfusionseffizienz bei Albinos. Ein Albino X. laevis sowohl vor (A) als auch nach (B) schneller Perfusion. Der Albinismus macht es einfacher, die Stärke der Perfusion zu bestimmen, als es bei einem pigmentierten Tier der Fall wäre. Dies zeigt sich besonders im Lungen- und Lebergewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Tabelle zur Fehlerbehebung. Es werden einige typische Probleme, ihre möglichen Ursachen und vorgeschlagene Abhilfemaßnahmen bereitgestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt traditionelle Dissektionstechniken für den Zugang zur Zölomhöhle. Andere Techniken sind ebenfalls akzeptabel, vorausgesetzt, sie verursachen nur minimale Schäden am Gewebe, das Herz ist zugänglich und die Lunge und der Magen sind sichtbar. Ebenso können die meisten aufgeführten Sezierwerkzeuge leicht durch vergleichbare Gegenstände ersetzt werden.
Obwohl versucht wurde, die Wirksamkeit dieses Verfahrens zu optimieren, können die Ergebnisse je nach Erfahrung und Variabilität zwischen den einzelnen Fröschen variieren. Ein interessanter Aspekt der Blutperfusion, der außerhalb des Rahmens dieser Arbeit blieb, ist, wie dieses Verfahren im Vergleich zu alternativen Perfusionsmethoden für Tiere, die sich einer Operation unterziehen, abschneidet. Eine weitere unerforschte Variable ist, wie die Blutperfusion bei sehr jungen Tieren oder Tieren im fortgeschrittenen Alter funktionieren würde, bei denen die Gefäße übermäßig fragil sein könnten. Es werden zusätzliche Bemerkungen gemacht, um die Anwendung dieses Protokolls zu erleichtern. In Tabelle 1 sind einige typische Probleme, ihre möglichen Ursachen und vorgeschlagene Abhilfemaßnahmen aufgeführt.
Eine Einschränkung dieses Verfahrens besteht darin, dass die Perfusionseffizienz durch seine Geschwindigkeit negativ beeinflusst werden kann. Wenn die Perfusionseffizienz Vorrang vor der schnellen Perfusion hat, wird die Anpassung einer Axolotl-Technik empfohlen1 (Saltman et al. verwenden den Begriff Aorta, um sich auf den arteriellen Stamm zu beziehen).
Die Dauer des Verfahrens und die Menge der verwendeten Medien hängen von einer Reihe von Variablen ab. Im Allgemeinen benötigen X. tropicalis-Männchen zwischen 2 und 3 Minuten, um mit 15 bis 25 ml Medium erfolgreich zu perfundieren, während X. tropicalis-Weibchen mit 25 bis 40 ml Medium zwischen 3 und 4 Minuten benötigen. Signifikant mehr Variation von Tier zu Tier wurde bei der Perfusion von X. laevis gefunden. Obwohl eine höhere Durchflussrate die für die Perfusion größerer Tiere erforderliche Zeit verkürzen würde, kann der erhöhte Leitungsdruck leicht dazu führen, dass sich die Rohrverschraubungen lösen und die Pumpe ausfällt.
Natürlich ist es viel einfacher, die Perfusionseffizienz bei Albino-Tieren zu beurteilen. Der Unterschied zeigt sich vor allem im Lungen- und Lebergewebe (Abbildung 12). Daher wird die Verwendung von Albinos empfohlen, insbesondere wenn Sie zum ersten Mal eine Perfusion versuchen oder sich einem Training unterziehen.
Durch die Anpassung der Durchflussrate und der Nadelstärke ist das Protokoll für alle Xenopus-Arten anpassbar. Aufgrund der Homologie in der Herzanatomie und im Blutkreislauf zwischen Xenopus und den meisten anderen Amphibien15 sowie Nichtkrokodilreptilien kann diese Technik für die schnelle Ganzkörperdurchblutung anderer Modelle mit Dreikammerherzenmodifiziert werden 16. Wenn ein nicht-krokodilartiges Reptilienmodell verwendet wird, das ausschließlich die Perfusion eines der Aortenbögen erfordert, werden andere Protokolle empfohlen17.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch den OD R24 Grant OD031956 und den NICHD R01 Grant HD073104 unterstützt. Wir danken Darcy Kelly für hilfreiche Diskussionen und erste Anregungen zu diesem Protokoll. Wir möchten uns auch bei Samantha Jalbert, Jill Ralston und Wil Ratzan für ihre Hilfe und Unterstützung sowie bei unseren drei anonymen Peer-Reviewern für ihr Feedback bedanken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
| General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
| Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring | amazon.com | B09PTX6M2Z | size will be dependant on the hosing of the pump used |
| Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
| Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
| Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
| Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers | amazon.com | B087P191LP |
References
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