Summary
هنا ، نصف بالتفصيل بروتوكول تحديد طول التيلومير باستخدام الكشف الكيميائي غير المشع ، مع التركيز على تحسين معلمات الأداء المختلفة لمجموعة فحص طول التيلومير TAGGG ، مثل الكميات العازلة وتركيزات المسبار.
Abstract
التيلوميرات هي تسلسلات متكررة موجودة في نهايات الكروموسومات. تقصيرها هو سمة مميزة للخلايا الجسدية البشرية. يحدث التقصير بسبب مشكلة في النسخ المتماثل النهائي وغياب إنزيم التيلوميراز المسؤول عن الحفاظ على طول التيلومير. ومن المثير للاهتمام أن التيلوميرات تقصر أيضا استجابة للعمليات الفسيولوجية الداخلية المختلفة ، مثل الإجهاد التأكسدي والالتهاب ، والتي قد تتأثر بسبب العوامل خارج الخلية مثل الملوثات أو العوامل المعدية أو المغذيات أو الإشعاع. وبالتالي ، فإن طول التيلومير بمثابة علامة حيوية ممتازة للشيخوخة ومعايير الصحة الفسيولوجية المختلفة. تستخدم مجموعة فحص طول التيلومير TAGGG لتحديد متوسط أطوال التيلومير باستخدام مقايسة جزء تقييد التيلومير (TRF) وهي قابلة للتكرار بدرجة كبيرة. ومع ذلك ، فهي طريقة مكلفة ، ولهذا السبب ، لا يتم استخدامها بشكل روتيني لأعداد العينات الكبيرة. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لقياس محسن وفعال من حيث التكلفة لطول التيلومير باستخدام البقع الجنوبية أو تحليل TRF والكشف القائم على التلألؤ الكيميائي غير المشع.
Introduction
التيلوميرات هي تسلسلات الحمض النووي المتكررة الموجودة في نهاية الكروموسومات. لديهم تكرارات ترادفية ل TTAGGG ويحافظون على سلامة الجينوم من خلال حماية الكروموسوم من كل من الاهتراء ومشكلة النسخ المتماثل النهائي ، مما يعني أن جزءا من الجزء المتدلي 3 بوصات لا يمكن تكراره بواسطة بوليميراز الحمض النووي 1,2. تؤدي التيلوميرات القصيرة إلى تشوهات كروموسومية في الخلايا ، بسبب توقف الخلايا بشكل دائم في مرحلة تسمى الشيخوخة المتماثلة3. تسبب التيلوميرات القصيرة أيضا مجموعة من المشاكل الأخرى ، مثل خلل الميتوكوندريا 4,5 وخلل الخلية.
يتم فقدان التكرارات التيلوميرية للحمض النووي عندما تنقسم الخلية ، بمتوسط خسارة من 25 إلى 200 نقطة أساس في السنة 6 ، مما يؤدي إلى الشيخوخة الخلوية بعد عدد معين من الانقسامات6. ترتبط الشيخوخة بتواتر أعلى من الأمراض المصاحبة ، والتي تتميز بتقصير طولالتيلومير 7. تحليل جزء تقييد التيلومير (TRF) ، كما وصفه ميندر ، هو طريقة مكلفة للغاية8. لهذا السبب ، لا يتم تنفيذه أثناء تحديد طول التيلومير في معظم الدراسات.
في الوقت الحاضر ، تستخدم غالبية الدراسات الوبائية قياسات كمية لطول التيلومير القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل (qPCR). ومع ذلك ، فإن الطريقة القائمة على qPCR هي طريقة قياس نسبية ، لأنها تقيس النسبة بين التيلوميرات ومنتجات تضخيم الجينات أحادية النسخة ، وليس طول التيلومير المطلق. قياس طول التيلومير باستخدام بروتوكول TRF هو الطريقة القياسية الذهبية ، حيث يمكنه قياس توزيع طول التيلومير في العينة ويمكن التعبير عن القياسات بالقيم المطلقة بالكيلوباس (kb). ومع ذلك ، فإن استخدامه محدود لأنه مرهق وكثيف العمالة ومكلف. هنا ، نقدم بروتوكولا محسنا لقياس طول التيلومير باستخدام TRFs القائمة على التلألؤ الكيميائي.
يتضمن تحليل TRF سبع خطوات رئيسية: 1) زراعة الخلايا لاستخراج الحمض النووي الجينومي ، 2) استخراج الحمض النووي الجينومي باستخدام الفينول: الكلوروفورم: طريقة كحول الأيزو أميل(P: C: I) ، 3) تقييد هضم الحمض النووي الجينومي ، 4) هلام الأغاروز الكهربائي ، 5) النشاف الجنوبي لجزء الحمض النووي لهضم التقييد ، 6) التهجين والكشف عن طريق التلألؤ الكيميائي - يتم تصور مسبار التيلومير المتجمد بواسطة ركيزة كيميائية شديدة الحساسية للفوسفاتيز القلوي ، ثنائي الصوديوم 2-كلورو -5- (4-ميثوكسي سبيرو [1،2-ديوكسيتان-3،2′- (5-كلوروتريسيكلو [3.3.1.13.7] ديكان]) -4-يل] -1-فينيل فوسفات (CDP-Star) - و 7) تحليل للحصول على متوسط طول التيلومير ومعلومات النطاق من هذه اللطاخات التيلومية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع الكواشف المستخدمة في البروتوكول أدناه. ويدرج الجدول 1 الكواشف المصنوعة في المختبر إلى جانب الأحجام المحسنة، ويبين الجدول 2 تركيزات العمل من الكواشف المتاحة تجاريا.
1. ثقافة الخلية
- الحفاظ على الخلايا التي سيتم قياس طول التيلومير الخاص بها (المستخدمة هنا كانت خلايا A2780 ، وهي خط خلايا غدية المبيض) في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco الوسط الكامل المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) ، والستربتومايسين ، والبنسلين ، والأمفوتريسين B في طبق بتري 6 سم. احتضان عند 37 درجة مئوية في بيئة رطبة وخاضعة للرقابة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تتجمع الخلايا بنسبة 80٪ -100٪.
- قم بإزالة الوسائط واغسلها ب 5 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
- عالج الخلايا ب 1 مل من حمض التربسين والإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) لفصل الخلايا عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق.
- أضف 2 مل من وسائط DMEM الكاملة لتعطيل التربسين وجمع الخلايا في أنبوب طرد مركزي.
- حبيبات الخلايا في 2,348 × غرام لمدة 5 دقائق.
- اغسل الحبيبات باستخدام 1x PBS وأجهزة طرد مركزي عند 2,348 × جم لمدة 5 دقائق.
- قم بتخزين الحبيبات في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
ملاحظة: يمكن أن يختلف عدد الخلايا حسب خط الخلية. حصلنا على ما يقرب من 2.5 × 106 خلايا في حالة خط الخلايا A2780 ، والذي يستخدم في خطوات أخرى.
2. عزل الحمض النووي الجينومي
- أضف 500 ميكرولتر من محلول التحلل (10 مللي متر tris-Cl ، درجة الحموضة 8.0 ؛ 25 مللي متر EDTA ، درجة الحموضة 8.0 ؛ 100 مللي مول كلوريد الصوديوم ؛ 0.5٪ وزن / فولت كبريتات دوديسيل الصوديوم) إلى حبيبات الخلية واخلطها برفق باستخدام طرف مقطوع (بقطر فتحة لا يقل عن 2 مم). أضف 20 ميكروغرام / مل من RNase A المحضر حديثا واخلطه برفق عن طريق الانقلاب.
- احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وأحيانا عكس الأنبوب أثناء الحضانة.
- أضف بروتيناز K إلى تركيز نهائي قدره 100 ميكروغرام / مل واخلطه برفق عن طريق الانعكاس 10 مرات. احتضان عند 55 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. اقلب الأنبوب على فترات منتظمة (كل 10 دقائق) أثناء الحضانة.
- أضف 500 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: كاشف كحول الأيزو أميل (25:24:1) واخلطه برفق عن طريق الانقلاب 20 مرة. جهاز طرد مركزي عند 9391 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (حوالي 25 درجة مئوية).
ملاحظة: يوضح الشكل 1 أ الطبقات الثلاث التي تم الحصول عليها بعد الطرد المركزي. - قم بإزالة الطبقة المائية العلوية اللزجة من الطبقات الثلاث المرئية ، وضعها في أنبوب جديد باستخدام طرف مقطوع ، وأضف كمية متساوية من الكلوروفورم. تخلط بانعكاس لطيف 20 مرة.
- أجهزة الطرد المركزي الأنابيب عند 9391 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- اجمع الطبقة المائية وأضف كمية مناسبة من 5 M NaCl بحيث يكون التركيز النهائي لكلوريد الصوديوم 0.2 M.
- أضف مجلدين من الإيثانول بنسبة 100٪. تخلط عن طريق انعكاس لطيف 20-25 مرة. جهاز طرد مركزي عند 15,871 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة المادة الطافية وأضف 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪ لغسل الحبيبات. أجهزة الطرد المركزي عند 15871 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة المادة الطافية ، وجفف الحبيبات بالهواء لبضع دقائق ، وأضف 50 ميكرولتر من الماء المعقم الخالي من النيوكلياز. اسمح للحمض النووي بإعادة الترطيب لمدة 1-2 أيام في درجة حرارة الغرفة. تخلط عن طريق السحب باستخدام طرف القطع.
- قياس تركيز الحمض النووي باستخدام قياس الطيف الضوئي بالأشعة فوق البنفسجية (UV). قم بتخفيف العينات ، إذا لزم الأمر ، باستخدام ماء معقم خال من النيوكلياز للحصول على تركيز لا يقل عن 300-500 نانوغرام / ميكرولتر.
- تحقق من سلامة الحمض النووي عن طريق تشغيله على هلام أغاروز 1٪ (الشكل 1 ب).
- قم بتخزين الحمض النووي المخفف في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
3. هضم الحمض النووي الجينومي
- تحضير خليط إنزيم من Rsa1 (20 U) و Hinf1 (20 U) وإضافة 2 ميكرولتر من المخزن المؤقت لهضم التقييد لكل تفاعل.
- خذ حجما مناسبا من الحمض النووي الجينومي بحيث تكون الكمية الإجمالية للحمض النووي 1.5 ميكروغرام. قم بتكوين الحجم بماء معقم خال من النيوكلياز ، بحيث يكون الحجم الكلي بعد إضافة الإنزيم 20 ميكرولتر.
- تخلط جيدا عن طريق النقر ، تليها تدور النبض.
- احتضان الخليط على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
4. هلام الاغاروز الكهربائي
- تحضير 10 سم × 15 سم 0.8٪ هلام الأغاروز في 1x ثلاثي خلات EDTA (TAE) العازلة باستخدام أغاروز عالية الجودة.
- أضف 5 ميكرولتر من صبغة التحميل إلى كل عينة من الحمض النووي الجينومي المهضوم ، مما يجعل الحجم النهائي 25 ميكرولتر ، وقم بتحميل العينات على الهلام.
- قم بإعداد مزيج الواسمات الجزيئية باستخدام 1 ميكرولتر من الواسمات الجزيئية (سلم) ، و 3 ميكرولتر من الماء المعقم الخالي من النيوكلياز ، و 1 ميكرولتر من صبغة التحميل 5x.
- قم بتحميل 5 ميكرولتر من مزيج الواسمات الجزيئية على جانبي عينات الحمض النووي المهضومة الجينومية إذا كان هناك عدد أكبر من العينات (~ 10) ، أو على جانب واحد فقط إذا كان هناك أقل من أو يساوي خمس عينات.
- قم بتشغيل الجل عند 5 فولت / سم لمدة 6 ساعات. بمجرد اكتمال التشغيل ، قم بعمل شق على أحد أركان الجل لتحديد ترتيب التحميل.
- اغمر الجل في 0.25 M حمض الهيدروكلوريك لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع التقليب اللطيف.
- شطف الجل مرتين بالماء المقطر.
- قم بتشويه الحمض النووي عن طريق غمر الجل في محلول 0.5 M NaOH و 1.5 M NaCl مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة مع تحريض لطيف.
- شطف الجل مرتين بالماء المقطر.
- قم بتحييد الحمض النووي عن طريق غمر الجل في محلول 0.5 M tris-HCl و 3 M NaCl (درجة الحموضة 7.5) مرتين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تحريض لطيف.
5. النشاف الجنوبي
- قطع غشاء النايلون من 10 سم × 12 سم في الحجم وجعل الشق في نفس موقف الجل.
- قم بتنشيط الغشاء عن طريق الغمس في الماء المقطر متبوعا بمحلول سترات محلول ملحي الصوديوم (SSC) 20x (انظر الجدول 1).
- قم بإعداد النقل.
- خذ صينية زجاجية نظيفة وضع صينية أخرى فيها في وضع مقلوب. قم بإنشاء فتيل باستخدام ورق ترشيح عادي بحيث تلامس الأطراف قاعدة الدرج الخارجي.
- ضع الجل فوق ورق الترشيح. ضع غشاء النايلون المنشط برفق فوق الجل ، مع تداخل الشقوق ، وقم بإزالة أي فقاعات هواء عن طريق التدحرج فوق قضيب زجاجي.
- ضع كومة 2 سم من ورق ترشيح السليلوز 9.5 سم × 11.5 سم ، متبوعا بكومة 6 سم من ورق الترشيح العادي بنفس الأبعاد. ضع وزنا فوق هذا الإعداد بحيث يكون هناك توزيع متساو للوزن أدناه. املأ الدرج الخارجي بمخزن مؤقت SSC 20x (انظر الشكل 2).
- اترك الإعداد للنقل بين عشية وضحاها.
- بعد النقل الجنوبي ، قم بتثبيت الحمض النووي المنقول على الغشاء عن طريق التشابك فوق البنفسجي على جهاز تحويل الأشعة فوق البنفسجية أو رابط متشابك للأشعة فوق البنفسجية. استخدم مصباح 302 نانومتر 8 واط لمدة 5 دقائق ، أو مصباح 254 نانومتر 8 واط لمدة 2 دقيقة ، وهو ما يعادل حوالي 120 مللي جول. تأكد من أن جانب الغشاء الذي يتم نقل الحمض النووي عليه يواجه المصباح.
- اغسل الغشاء مرتين باستخدام 25 مل من 2x SSC buffer.
- أوقف البروتوكول مؤقتا ، إذا لزم الأمر ، عن طريق تجفيف البقعة تماما وتخزينها عند 2-8 درجة مئوية بعد لفها بشكل غير محكم في ورق القصدير ، حتى تتم المعالجة الإضافية.
6. التهجين والكشف عن التلألؤ الكيميائي
- سخن المخزن المؤقت للتهجين المسبق إلى 42 درجة مئوية.
ملاحظة: تتضمن الخطوات التالية كميات المحاليل / المخازن المؤقتة التي سيتم استخدامها لكل 100 سم2 من اللطخة. - احتضان الغشاء في 10 مل من المخزن المؤقت قبل التهجين لمدة 1 ساعة عند 42 درجة مئوية مع التقليب اللطيف للتهجين المسبق.
- أضف 0.5 ميكرولتر من مسبار التيلومير لكل 5 مل من المخزن المؤقت للتهجين المسبق التسخين لصنع محلول التهجين.
- احتضان اللطخة في 10 مل من محلول التهجين عند 42 درجة مئوية لمدة 3 ساعات مع التقليب اللطيف.
- اغسل اللطخة بمحلول مؤقت صارم 1 (الجدول 1) مرتين لمدة 10 دقائق (25 مل لكل منهما) في درجة حرارة الغرفة مع تحريط لطيف.
- المخزن المؤقت الصارم 2 (الجدول 1) لمدة 30 دقيقة عند 50 درجة مئوية.
- اغسل اللطخة بمحلول مؤقت صارم 2 مرتين لمدة 15 دقيقة (25 مل لكل منهما) عند 50 درجة مئوية مع تحريط لطيف.
- اشطفيه ب 15 مل من محلول الغسيل لمدة 5 دقائق مع التقليب اللطيف في RT.
- احتضان الغشاء في 10 مل من محلول حجب 1x المحضر حديثا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تحريض لطيف.
- احتضان الغشاء في 10 مل من مضاد الديجيوكسيجينين المترافق مع محلول عمل الفوسفاتيز القلوي (انظر الجدول 2) لمدة 30 دقيقة في RT مع تحريض لطيف.
- اغسل اللطخة مرتين باستخدام المخزن المؤقت للغسيل في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة مع تحريط لطيف.
- احتضان في 10 مل من المخزن المؤقت للكشف لمدة 5 دقائق في RT مع تحريض لطيف.
- قم بإزالة المخزن المؤقت للكشف الزائد واحتفظ بالغشاء مع توجيه الحمض النووي لأعلى على كيس تهجين أو صفيحة خلات. أضف ~ 1-1.5 مل من محلول الركيزة بالتنقيط على الغشاء ، ضع ورقة أخرى على الفور ، واحتضانها لمدة 5 دقائق في RT.
- الضغط على حل الركيزة الزائدة للتصوير.
- قم بتصوير اللطخة لمدة 20 دقيقة تقريبا في نظام تصوير وثائق هلامية ، مع جمع صور متعددة في نقاط زمنية مختلفة. حدد الصور غير المشبعة لمزيد من التحليل.
ملاحظة: في حالة ضعف الإشارة ، يمكن إجراء التصوير لفترة أطول من الوقت.
7. التحليل
- بعد الحصول على ملفات الصور ، قم بتصديرها للنشر بتنسيق .tif بأعلى دقة ممكنة (600 نقطة في البوصة في هذه الحالة).
- قم بتثبيت برنامج Telotool . يتطلب هذا إصدارا محددا (R2012a) من MATLAB (متاح مجانا) للتشغيل.
- افتح البرنامج وانقر على زر تحميل ملف الصورة في أعلى اليمين.
- بعد تحميل الصورة ، انقر فوق عكس الصورة ، بحيث تكون خلفية الصورة سوداء وتكون اللطاخات / الأشرطة بيضاء.
- اقتصاص الصورة مع الزوايا العليا بدءا من الآبار. بعد إجراء تحديد الاقتصاص ، انقر بزر الماوس الأيمن بداخله وحدد اقتصاص الصورة.
- بعد اقتصاص الصورة ، انقر فوق حساب الممرات واسمح باكتشاف المسار تلقائيا.
- إذا لم يتم اكتشاف الممرات بشكل صحيح ، على سبيل المثال ، إذا لم يتم اكتشاف ممرات معينة على الإطلاق ، أو إذا تم اكتشاف ممرات إضافية أو جزئية ، فقم بإجراء تعديل المسار كما هو موضح أدناه.
- انقر فوق ضبط الممرات وفي النافذة المنبثقة التي تفتح ، أضف و / أو اضبط الممرات حسب الحاجة ، وانقر فوق تطبيق وإغلاق.
- بعد ضبط الممرات ، تأكد من رؤية نقطة حمراء على كل من الممرات واضبط السلالم باستخدام زر Ladder Fit ، مع التأكد من أن عدد القمم في كلا حارتي السلم في نفس الموضع. قم بإزالة أي قمم غريبة باستخدام زر حذف الحد الأقصى .
- بعد ضبط السلالم ، حدد ملفات تعريف المسار ، وانقر فوق ملاءمة السلم ، وحدد ملاءمة متعددة الحدود.
- انقر فوق Trendline ، على النحو الموصى به من قبل البرنامج ، ثم حدد مصحح في الخيار التالي.
- انقر فوق الحصول على النتائج لعرض النتائج كجدول ، حيث يكون متوسط صف TRF هو قياس طول التيلومير لعينات الحارة المعنية.
- انقر فوق حفظ الكل لتخزين النتائج في شكل جدول بيانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أظهر الحمض النووي الجينومي المستخرج (gDNA) ، والذي تم تشغيله على هلام أغاروز 1٪ ، سلامة جيدة ، كما هو موضح في الشكل 1B ، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام العينة لمزيد من المعالجة النهائية ل TRFs. ثم تم إجراء اختبار TRF عن طريق تعديل أحجام الحلول المطلوبة في كل خطوة (انظر الجدول 1 والجدول 2). كانت إشارة TRF مرئية بوضوح (الشكل 3). وبالتالي ، من خلال تعديل أحجام المحلول وتركيزاته ، يمكن معالجة المزيد من العينات دون أي تأثير سلبي على النتائج ، ويمكن تحديد طول التيلومير بنجاح باستخدام البرامج المتاحة مجانا مثل Telotool10.
الشكل 1: عزل الحمض النووي الجينومي وفحص جودته. (أ) ثلاث مراحل فصل متميزة يتم الحصول عليها عند الطرد المركزي بعد إضافة الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزو أميل. تحتوي الطبقة المائية العلوية على gDNA ، ويحتوي الطور البيني على البروتينات ، وتحتوي المرحلة العضوية السفلية على الحمض النووي الريبي المتحلل ، وحطام الخلايا ، والدهون. ب: صورة لهلام أغاروز 1٪ يظهر الحمض النووي (gDNA) سليما غير مهضوم. يظهر الممر 1 سلما بحجم 1 كيلوبايت ويظهر الحارة 2 الحمض النووي gDNA غير المهضوم لخط الخلايا السرطانية A2780. اختصار: gDNA = الحمض النووي الجينومي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: رسم توضيحي لإعداد نقل النشاف الجنوبي. رسم تخطيطي تمثيلي يوضح تجميع النظام لنقل مسحات تكرار التيلومير من الجل إلى غشاء النايلون عن طريق العمل الشعري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: الكشف عن التلألؤ الكيميائي ل TRFs بعد النشاف والتهجين الجنوبي. لطخة تظهر مجموعة من التكرارات التيلوميرية كمسحة في الحارة 2. يظهر الممر 1 علامة جزيئية ، مع الأوزان الجزيئية (kb) للنطاقات المشار إليها على الجانب الأيسر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: قائمة الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول. يحتوي الجدول على الكواشف المعدة في المختبر جنبا إلى جنب مع تفاصيل التخزين الخاصة بها ، والاستخدام الموصى به لكواشف مجموعة مقايسة طول التيلومير TAGGG ، وأحجام استخدامها المعدلة ، وفقا للتحسين في هذا البروتوكول. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: قائمة الكواشف المتاحة تجاريا مع تعليمات الاستخدام المعدلة. يحتوي الجدول على الكواشف المتاحة تجاريا جنبا إلى جنب مع التخفيفات المختلفة ، وتفاصيل التخزين الخاصة بها ، واستخدامها الموصى به بواسطة مجموعة فحص طول التيلومير TAGGG وأحجام الاستخدام المعدلة ، وفقا للتحسين في هذا البروتوكول. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصفنا إجراء مفصلا لطريقة غير مشعة قائمة على التلألؤ الكيميائي لقياس طول التيلومير باستخدام النشاف الجنوبي. وقد اختبر البروتوكول للسماح بالاستخدام الحكيم للعديد من الكواشف دون المساس بجودة النتائج. يمكن إعادة استخدام المخزن المؤقت للتهجين والتهجين حتى خمس مرات. يمكن أن يتراوح تركيز الإنزيم بين 10-20 وحدة لكل 1.5-2 ميكروغرام من الحمض النووي الجينومي دون التأثير على النتائج. يمكن استخدام العديد من مكونات المجموعة الأخرى ، مثل علامة الوزن الجزيئي المسمى DIG ومسبار التهجين ، بتركيزات أقل من الموصى بها. يشار إلى وحدات التخزين المحسنة في الجدول 2. لقد اختبرناها بنصف الأحجام / التركيزات الموصى بها ووجدنا الأداء الأمثل. يؤدي اتباع هذه الخطوات إلى تقليل تكلفة العينة بشكل كبير ، مما يمكن الباحثين من قياس طول التيلومير باستخدام هذه الطريقة على نطاق أوسع.
هناك العديد من بروتوكولات TRF المنشورة. لقد قمنا بتحسين بروتوكول المجموعة المتاح تجاريا لجعله فعالا من حيث التكلفة. يختلف هذا البروتوكول عن بعض البروتوكولات المنشورة لأنه لا يستخدم النشاط الإشعاعي11,12. كما أنه بسيط نسبيا ، لأنه يستخدم مكونات المجموعة بدلا من تحضير الكواشف الداخلية ، وخاصة مسبار التيلومير13.
إذا كانت الصورة النهائية غير مكتملة ، فقد جف الغشاء جزئيا أثناء الحضانة. لحل هذه المشكلة ، يجب على المرء إما زيادة حجم المحلول أو تحريكه بسرعة أعلى. إذا لم تكن هناك مسحات مرئية على اللطخة ، فقد تكون هناك مشكلة أثناء النقل الجنوبي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تكون هناك مشكلة في كمية الحمض النووي أو نوعيته.
هناك بعض القيود على هذه الطريقة. أولا ، يستغرق استخراج الحمض النووي الجينومي والقياس الكمي ما يزيد عن 4 أيام بناء على مصدر الحمض النووي14. يستغرق الحمض النووي ذو الوزن الجزيئي العالي وقتا أطول لإعادة الترطيب والتجانس ، مما يجعل القياس الكمي والامتصاص الدقيق أمرا صعبا. ثانيا ، بروتوكول TRF طويل (2 أيام كحد أدنى) ويتطلب عمال مختبر مهرة لتنفيذه. إنها أيضا طريقة مكلفة بسبب الكواشف والكميات المطلوبة. يقيس بروتوكول TRF أيضا متوسط طول التيلومير في كل عينة ، على عكس أقصر طول تيلومير يقيسه TESLA أو طول التيلومير لكل خلية توفر الطرق القائمة على قياس التدفقالخلوي 15. هناك قيد آخر لتحليل TRF باستخدام الإنزيمات المستخدمة هنا وهو المبالغة في تقدير طول التيلومير ، حيث لا تحتوي هذه الإنزيمات على موقع تقييد في المناطق التيلوميرية الفرعية15.
ومع ذلك ، على الرغم من القيود ، هناك أسباب تجعل هذه الطريقة لا تزال تعتبر المعيار الذهبي لقياس طول التيلومير. يتم تقديم أطوال التيلومير بدقة في القيم المطلقة - في أزواج الكيلوبيس (kbp).
يمكن استخدام هذه الطريقة لقياس متوسط طول التيلومير في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا, من خطوط الخلايا 16,17 إلى كريات معطف بافي 18,19. هذا يجعلها طريقة قوية لاستخدامها في عدة أنواع من الدراسات البحثية. يمكن استخدامه أيضا في الدراسات الوبائية واسعة النطاق وكذلك في الدراسات التي يتم فيها تطوير العلاجات القائمة على الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نعرب عن تقديرنا للسيدة براتشي شاه لمساعدتنا في البداية في تحسين البروتوكول. نود أن نشكر الدكتور مانوج جارج على توفير خط خلايا سرطان المبيض A2780. يتم دعم EK من خلال منحة بحثية من قسم التكنولوجيا الحيوية (رقم BT / RLF / Re-entry / 06/2015) ، وقسم العلوم والتكنولوجيا (ECR / 2018 / 002117) ، ومنحة NMIMS Seed Grant (IO 401405).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Line | |||
| A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line) | Received as a gift | ||
| Equipment | |||
| ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking) | Biorad | Universal hood II (721BR14277) | |
| Nanodrop (Epoch 2) | Biotek | EPOCH2 | |
| Software | |||
| TeloTool | Version 1.3 | ||
| Materials | |||
| Acetic Acid | Molychem | 64-19-7 | |
| Agarose | MP | 180720 | |
| Amphotericin B | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| DMEM | HyClone, Cytiva, USA | SH30243.01 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Molychem | 6381-92-6 | |
| HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| Nylon membrane | Sigma | 11209299001 | |
| Penicillin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Affymetrix | 151-21-3 | |
| Streptomycin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Whatman paper | GE healthcare lifesciences | 1001-917 | |
| Reagents | |||
| 1 kb ladder | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Blocking solution 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
| Detection buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Dig easy hyb | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Digestion Buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 (alternative to kit) | NEB | R0155T | |
| Loading Dye | BIOLABS | N3231S | |
| Maleic acid buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Molecular marker | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Probe | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 (alternative to kit) | NEB | R0167L | |
| Substrate | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Wash buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 |
References
- Greider, C. W.
- Valdes, A. M., et al. Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet. 366 (9486), 662-664 (2005).
- Allsopp, R. C., et al. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (21), 10114-10118 (1992).
- Epel, E. S., et al. Accelerated telomere shortening in response to life stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (49), 17312-17315 (2004).
- Canela, A., Vera, E., Klatt, P., Blasco, M. A. High-throughput telomere length quantification by FISH and its application to human population studies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5300-5305 (2007).
- Révész, D., Milaneschi, Y., Verhoeven, J. E., Penninx, B. W. Telomere length as a marker of cellular aging is associated with prevalence and progression of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (12), 4607-4615 (2014).
- Rizvi, S., Raza, S. T., Mahdi, F. Telomere length variations in aging and age-related diseases. Current Aging Science. 7 (3), 161-167 (2014).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere restriction fragment (TRF) analysis. Bio-Protocol. 5 (22), e1658 (2015).
- Zhu, Y., Liu, X., Ding, X., Wang, F., Geng, X. Telomere and its role in the aging pathways: telomere shortening, cell senescence and mitochondria dysfunction. Biogerontology. 20 (1), 1-16 (2019).
- Göhring, J., Fulcher, N., Jacak, J., Riha, K. TeloTool: a new tool for telomere length measurement from terminal restriction fragment analysis with improved probe intensity correction. Nucleic Acids Research. 42 (3), 21 (2014).
- Jenkins, F. J., Kerr, C. M., Fouquerel, E., Bovbjerg, D. H., Opresko, P. L. Modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization. Journal of Visualized Experiments. (125), e56001 (2017).
- Fojtová, M., Fajkus, P., Sováková, P. P., Fajkus, J. Terminal restriction fragments (TRF) method to analyze telomere lengths. Bio-protocol. 5 (23), e1671 (2015).
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nature Protocols. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Trigodet, F., et al. High molecular weight DNA extraction strategies for long-read sequencing of complex metagenomes. Molecular Ecology Resources. 22 (5), 1786-1802 (2022).
- Lai, T. P., Wright, W. E., Shay, J. W. Comparison of telomere length measurement methods. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 373 (1741), 20160451 (2018).
- Mochida, A., et al. Telomere size and telomerase activity in Epstein-Barr virus (EBV)-positive and EBV-negative Burkitt's lymphoma cell lines. Archives of Virology. 150 (10), 2139-2150 (2005).
- Gupta, N., et al. Replicative senescence, telomere shortening and cell proliferation rate in Gaddi goat's skin fibroblast cell line. Cell Biology International. 31 (10), 1257-1264 (2007).
- Michaeli, J., et al. Leukocyte telomere length correlates with extended female fertility. Cells. 11 (3), 513 (2022).
- Lesmana, A., et al. Continuous reference intervals for leukocyte telomere length in children: the method matters. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 59 (7), 1279-1288 (2021).
