Summary
이 프로토콜은 야생형 마우스에서 피질을 그대로 유지하면서 이광자 현미경으로 단일 뉴런 활동을 이미징하고 부분 피질 돌연변이 마우스에서 광시야 현미경으로 전체 SC를 이미징하는 것을 포함하여 깨어 있는 마우스의 상구(SC)에서 칼슘 반응을 이미징하는 절차를 자세히 설명합니다.
Abstract
모든 척추동물에서 진화적으로 보존된 중뇌 구조인 상구(superior colliculus, SC)는 대뇌피질이 출현하기 전에 가장 정교한 시각 중추입니다. ~30가지 유형의 망막 신경절 세포(RGC)로부터 직접 입력을 받으며, 각 세포는 특정 시각적 특징을 인코딩합니다. SC가 단순히 망막 특징을 물려받는지, 아니면 SC에서 추가적이고 잠재적으로 새로운 처리가 발생하는지는 여전히 파악하기 어렵습니다. SC에서 시각 정보의 신경 코딩을 밝히기 위해 깨어 있는 쥐에서 두 가지 보완적인 방법으로 시각적 반응을 광학적으로 기록하는 자세한 프로토콜을 제공합니다. 한 가지 방법은 이광자 현미경을 사용하여 중첩 피질을 절제하지 않고 단일 세포 해상도로 칼슘 활성을 이미지화하는 반면, 다른 방법은 광시야 현미경을 사용하여 피질이 거의 발달하지 않은 돌연변이 쥐의 전체 SC를 이미지화합니다. 이 프로토콜은 동물 준비, 바이러스 주입, 헤드플레이트 이식, 플러그 주입, 데이터 수집 및 데이터 분석을 포함한 이 두 가지 방법을 자세히 설명합니다. 대표적인 결과는 이광자 칼슘 이미징이 단일 세포 해상도에서 시각적으로 유발된 신경 반응을 나타내고 광시야 칼슘 이미징이 SC 전체에 걸쳐 신경 활동을 나타낸다는 것을 보여줍니다. 이 두 가지 방법을 결합하면 SC의 신경 코딩을 서로 다른 규모로 밝힐 수 있으며 이러한 조합은 다른 뇌 영역에도 적용될 수 있습니다.
Introduction
상구(superior colliculus, SC)는 모든 척추동물에서 중요한 시각 중추입니다. 포유류에서는 망막과 시각 피질(visual cortex)1로부터 직접 입력을받는다. 광학 기록은 피질 2,3,4,5에 널리 적용되어 왔지만, SC에서의 적용은 열악한 광학 액세스 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17에 의해 방해를 받는다 ,18,19. 이 프로토콜의 목표는 SC에서 신경 활동을 광학적으로 기록하기 위한 두 가지 보완 방법에 대한 세부 정보를 제공하는 것입니다.
SC는 피질과 횡동(transverse sinus) 아래에 위치하여 측부 뉴런에 대한 광학적 접근을 제한합니다. 이러한 한계를 극복하기 위한 한 가지 접근법은 중첩 피질을 흡인하고 전방 SC 7,9,10,13,14,19를 노출시키는 것입니다. 그러나 SC는 대뇌 피질 입력을 받기 때문에 이러한 작업은 SC 뉴런이 시각적 자극에 반응하는 방식에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 한계를 극복하기 위하여는, 우리는 피질을 온전하게 남겨두면서 실리콘 마개를 가진 후방-내측 SC의 표층을, 8,11 남겨 두는 양자택일 의정서를 여기에서 상세히 기술한다. 특히, 단일 세포 분해능을 달성하기 위해 야생형 마우스의 후방-내측 SC에서 칼슘 반응을 이미지화하기 위해 이광자 현미경을 적용했습니다. 또한 넓은 범위를 달성하기 위해 광시야 현미경을 적용하여 후방 피질이 발달하지 않은 돌연변이 쥐의 전체 SC를 이미지화했습니다20.
이 프로토콜에 설명된 두 가지 방법은 서로 보완적입니다. 피질을 절제하지 않는 2광자 칼슘 이미징은 손상되지 않은 피질 입력으로 단일 세포 해상도로 신경 활동을 기록하는 데 적합합니다. 광시야 칼슘 이미징은 공간 해상도를 희생하면서 전체 SC의 신경 활동을 기록하는 데 적합합니다.
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Protocol
모든 실험 절차는 동물 복지 지침에 따라 수행되었으며 베이징에 있는 중국 뇌 연구소의 IACUC의 승인을 받았습니다.
참고: 이 프로토콜의 타임라인은 다음과 같습니다: 1) 흡입 컵을 만드십시오. 2) 바이러스를 주입합니다. 3) 헤드플레이트를 이식합니다. 4) 3 주 후, 플러그를 이식하십시오. 5) 트레드밀에서 ~3일의 회복 및 습관화 후 이광자/광시야 이미징을 수행합니다.
1. 흡입 컵 준비(그림 1A)
- 아크릴 접시에 인산염 완충 식염수(PBS, 1x) 한 방울을 넣고 21G의 납작한 바늘로 만져 모세관으로 팁을 채웁니다.
- 바늘 끝을 반투명 실리콘 접착제로 덮고 약 ~10분 동안 고정합니다.
- 실리콘 접착제를 가위로 직경 ~ 2mm의 디스크로 자릅니다.
2. 플러그 준비(그림 1B)
- 0.75mm 두께의 플라스틱 심 스톡을 준비하고 중앙에 1cm x 1cm 정사각형을 잘라냅니다. 두 개의 아크릴 블록을 준비합니다. 심 스톡과 아크릴 블록을 알코올로 세척하고 렌즈 페이퍼로 닦습니다.
- 하나의 아크릴 블록에 심 스톡을 놓고 실리콘 접착제를 중앙에 증착하여 개구부의 ~90%를 채우고(기포 방지) 다른 아크릴 블록과 ~1kg의 힘을 가하고 20분 동안 기다립니다.
- 수술용 현미경으로 삼각형이 인쇄된 종이 위에 메스로 실리콘 접착제를 높이 1mm, 너비 1.5mm의 삼각형 프리즘으로 자릅니다.
- 플라스틱 접착 테이프로 삼각형 프리즘의 먼지를 제거하고 직경 5mm, 두께 0.15mm의 유리 커버슬립에 붙입니다.
- 삼각형 프리즘이 있는 커버슬립을 코로나 처리기 아래에 놓고 코로나 처리기를 켜고 번개가 칠 때까지 커버슬립에 더 가까이 가져옵니다. 서로 붙을 때까지 몇 분 동안 그 위치에 유지합니다.
알림: 이 단계는 다른 코로나 처리기와 다를 수 있습니다. - 플러그를 페트리 접시에 넣고 70°C의 인큐베이터에 밤새 넣습니다.
3. 동물의 제조 및 바이러스 작제물의 주입
- 생후 6주(이미징 시 9주)에 C57BL/6J(야생형) 및 Emx1-Cre:Pals1flox/wt (부분 피질) 20 마리의 남녀 마우스를 사용합니다.
- 수술 절차에 사용되는 모든 재료와 기구를 소독하십시오.
- 마우스를 5% 이소플루란으로 마취한 다음 수술 중 1L/min의 유속으로 이소플루란을 1%-2%로 유지합니다. 발가락 꼬집기 반사의 부족으로 마취 수준을 확인합니다.
- 이어 바가 있는 입체 프레임에 마우스를 머리에 고정합니다. 수술 내내 쥐의 눈에 안과 연고를 발라 건조를 방지하고, 온도 조절 가열 패드로 체온을 37°C로 유지합니다.
- 털을 면도하고 요오드포와 75% 에탄올로 피부 표면을 살균합니다. 리도카인(5mg/kg, 피하주사[SQ]), 틸리딘(2mg/kg, SQ), 멜록시캠(2mg/kg, SQ)을 주사합니다.
참고: 살균, 진통 및 국소 마취를 위한 수술 절차는 기관마다 다를 수 있습니다. - 수술용 가위로 SC 위의 피부를 제거하여 두개골을 노출시킵니다. 면봉으로 두개골을 청소하십시오.
- 두개골 표면이 평평해질 때까지 입체 프레임을 조정합니다. 경막이 노출될 때까지 람다의 측면 0.5mm, 전방 0.42mm의 구멍을 뚫습니다.
- 람다에서 1mm 및 1.6mm 깊이에 GCaMP6m(rAAV2/9-hsyn-GCaMP6m, 1x PBS에 용해된 1 x 1013 GC/mL)을 발현하는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 비스듬한 유리 마이크로피펫(팁이 직경 40-50μm, 25°로 경사짐)으로 주입합니다.
- 각 깊이에서 50nL/min의 속도로 100nL를 주입하고 각 주입 후 5분 동안 기다립니다. 주입 후 인젝터를 천천히 빼냅니다.
4. 헤드플레이트 이식
- 두개골 위의 근육과 조직을 청소하고 칼날로 두개골을 긁습니다. 출혈이 발생하면 젤 폼으로 출혈을 멈추고 혈액을 청소하십시오. 헤드플레이트(그림 1C)를 자가 경화 치과용 접착 수지 시멘트로 두개골에 부착합니다. 구체적으로, 폴리머 3/4 스푼, 모노머 3 방울, 촉매 1 방울을 얼음 위의 세라믹 그릇에 섞습니다. 혼합물을 헤드플레이트와 두개골에 바릅니다. 함께 부착하고 접착제가 굳을 때까지 5분 동안 기다립니다.
- 감염을 예방하기 위해 항생제(세프티오푸르 나트륨, 5mg/kg, SQ)를 주사합니다. 입체 프레임에서 마우스를 제거하고 복구를 위해 가열 패드에 놓습니다. 마취에서 회복된 후 홈 케이지로 되돌려 놓으십시오. 통증 관리를 위해 수술 후 3일 동안 이부프로펜 함유 식수(0.5mL/50mL)를 쥐에게 제공합니다.
5. 플러그 이식(그림 2)
- 바이러스 주입 후 3주 후에 플러그를 이식합니다. 3.2-3.5단계에서 설명한 대로 마우스를 입체 프레임에 마취하고 고정합니다. 잠재적인 출혈을 막기 위해 식염수에 적신 젤 폼을 준비합니다.
- 람다 뒤쪽 3mm를 중심으로 마이크로드릴을 사용하여 2mm x 0.5mm 타원을 드릴링합니다. 금이 갈 때까지 타원의 경계를 얇게 만듭니다. 타원형 녹음 창 앞의 두개골을 얇게 하여 커버슬립이 SC에 가까워지도록 합니다.
- 가는 집게를 사용하여 뼈 피판을 제거합니다. 횡동에 있는 경막 뒤쪽을 자르고 경막 조각을 제거합니다. 필요한 경우 건조를 방지하기 위해 3mL 주사기로 뇌에 인공 뇌척수액(ACSF)을 추가합니다. 두개골과 녹음 창을 젤 폼과 면봉으로 말리십시오.
- 녹음 창에 실리콘 접착제 한 방울을 떨어뜨립니다. 흡입 컵을 사용하여 음압으로 플러그를 잡습니다. 전동식 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 흡입 컵을 이동하고 커버슬립이 두개골에 닿을 때까지 플러그를 실리콘 접착제로 내립니다. 그런 다음 플러그를 앞으로 ~1mm 움직여 횡동을 밀어내고 SC를 노출시킵니다. 이 단계는 실리콘 접착제가 끈적거리기 전에 1-2분 안에 수행해야 합니다.
- 헤드플레이트를 청소하고 플러그 경계 주위에 부틸 시아노아크릴레이트와 수지 시멘트를 도포하여 헤드플레이트에 고정합니다.
알림: 4.2단계에 설명된 대로 수술 후 관리를 제공합니다.
6. 이광자 이미징(그림 3)
- 헤드플레이트가 있는 회전하는 트레드밀에 동물의 머리를 고정합니다. 트레드밀을 이광자 현미경 아래에 놓고 높이를 적절한 위치로 조정합니다. 대물렌즈와 헤드플레이트 사이에 검은색 알루미늄 콘을 놓아 시각적 자극을 위해 모니터의 빛 오염을 방지합니다. ~15분 동안 마우스를 습관화합니다.
- 16x 배율, 0.8 NA(numerical aperture) 및 3 mm working distance(WD) 대물렌즈로 현미경에서 2광자 이미징을 수행합니다. 두 개의 갈보 스캐너로 제어되는 모드 잠금 기술이 적용된 Ti:sapphire 레이저를 사용하여 920nm에서 GCaMP6m을 여기시킵니다. 샘플 평면에서 레이저 출력을 20-80mW 사이로 조정합니다.
- 2.4 μ m/픽셀의 공간 해상도로 4.8Hz에서 600μm x 600μm의 시야를 스캔하고 최대 350 μ m의 깊이에서 이미지 신경 활동을 스캔합니다.
알림: 샘플링 속도 및 공간 해상도는 갈보 스캐너용이며 공진 스캐너에 맞게 조정해야 합니다. - 방출된 형광을 dichroic mirror로 수집하고 bandpass filter를 통과시킨 후 광전자 증배관(PMT)을 사용하여 검출합니다.
- 로터리 엔코더로 트레드밀에서 마우스의 움직임을 기록합니다. 50mm 렌즈가 장착된 카메라를 사용하여 동공 크기와 위치를 기록합니다. 이러한 기록 및 이미지 획득을 자극 컴퓨터에서 보낸 트리거를 기록하여 시각적 자극에 동기화합니다.
7. 이광자 이미징으로 측정한 칼슘 반응 분석
- SIMA21 또는 NoRMCorre22를 사용하여 이미징 중 뇌 움직임을 수정합니다.
- 셀 마술 지팡이 툴(ImageJ)을 사용하여 관심 영역(ROI)을 수동으로 그리고 MATLAB에서 타원에 맞춥니다. neuropil 오염을 제거한 후 각 ROI의 형광 흔적을 추출합니다.
F true 및 F raw는 각각 ROI의 보정된 형광 진폭과 원시 형광 진폭이고, Fneuropil은 주변 신경필의 형광 진폭이며, r은 초점이 맞지 않는 신경필 오염 계수(설정의 경우 0.7)입니다. r은 앞서 설명한 바와 같이 F참= 0인 혈관의 신호를 측정하여 추정됩니다(23,24). - 각 프레임(25)을 중심으로 하는15초 창에서 8번째 백분위수 값을 빼서 느린 기준선 변동을 제거합니다.
- 뉴런의 시각적 반응을 자극 기간 동안 ROI에서 형광 진폭의 상대적 변화로 정의합니다.
F 피크는 시각적 자극 중 형광 트레이스의 피크 진폭이고, F기준선은 자극 전 0.5초 동안의 평균 진폭입니다.
8. 광시야 이미징 및 데이터 분석(그림 4)
- 탠덤 렌즈(tandem lens)4 를 사용하여 광시야 매크로스코프를 구축합니다(그림 4A). 탠덤 렌즈 매크로스코프는 어댑터를 통해 연결된 두 개의 카메라 렌즈(50mm 및 105mm)이며 배율은 ~2배입니다.
- 3.2-3.5 단계에 설명된 대로 부분 피질 돌연변이 마우스를 준비합니다. SC의 각 측면 중앙에서 200μm 깊이로 GCaMP6m을 발현하는 AAV 100nL를 주입합니다.
- ~3주 후 SC 위에 직경 5mm의 커버슬립을 이식합니다. SC를 중심으로 4mm x 3mm의 타원형 개두술을 시행하고 그 주변의 뼈를 얇게 합니다. 그런 다음 커버슬립을 SC에 직접 누르고 수지 시멘트로 고정합니다.
- 여기 필터(469 nm ± 35 nm)가 있는 청색 발광 다이오드(LED)로 GCaMP6m을 자극합니다. 10Hz에서 방출 필터(525nm ± 39nm)를 통과한 후 CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor) 카메라를 사용하여 이미지를 획득합니다. 이 카메라는 2.63μm/픽셀의 공간 해상도에서 5.36mm x 2.85mm의 영역을 커버합니다.
- 획득한 각 이미지를 정규화된 상자 필터로 컨벌루션하고 원래 크기의 1/4로 다운샘플링합니다. 이미지의 각 픽셀에 대해 7.4단계에 설명된 대로 응답을 정의합니다.
알림: 4.2단계에 설명된 대로 수술 후 관리를 제공합니다.
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Representative Results
그림 1A,B는 각각 흡입 컵과 플러그를 만드는 방법을 보여줍니다. 그림 2는 플러그를 성공적으로 이식하는 방법을 보여줍니다. 플러그를 이식한 후 그림 2D와 같이 후방-내측 SC가 노출됩니다. 그림 3은 이광자 현미경을 사용하여 이미지화한 야생형 쥐의 SC 뉴런의 칼슘 반응을 보여줍니다. 현미경으로 쉽게 캡처할 수 있는 삼각형 프리즘을 사용하여 이미징 부위를 찾을 수 있습니다(그림 3B). 시각적 응답은 단일 셀 해상도로 표시됩니다(그림 3C, D및 비디오 1). 그림 4는 광시야 현미경을 사용하여 이미지화한 부분 피질 돌연변이 마우스의 SC 뉴런의 칼슘 반응을 보여줍니다. 획득한 이미지는 먼저 원래 크기의 1/4로 다운샘플링되었습니다(그림 4B). 시각적으로 유발된 칼슘 반응은 SC의 양쪽에 표시됩니다(그림 4C 및 비디오 2). 그림 5는 주입 부위와 이미징 부위의 SC에서 GCaMP6m의 발현을 보여줍니다. 주사 부위에 뉴런이 적습니다.
그림 1: 준비. (A) 흡입컵을 제조하기 위한 3단계(단계 1.1-1.3); 바늘 내부의 PBS는 표시되지 않습니다. (B) 플러그를 만드는 세 단계(2.1-2.3단계). (C) 야생형 마우스용 직경 8mm의 두 가지 유형의 헤드플레이트. 부분 피질 돌연변이 마우스를 위한 직경 7mm의 두 가지 유형의 헤드플레이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 플러그 이식 (5.2-5.5 단계). (A) 뼈가 얇아진다. 주변은 수지 시멘트입니다. (B) 뼈와 경막을 제거하여 하구와 소뇌를 노출시킵니다. (C) 플러그를 내리고 횡동을 앞으로 밀어 후방-내측 SC를 노출시킵니다. 녹색 점선 원은 커버슬립을 표시합니다. 파란색 점선 삼각형은 플러그를 표시합니다. 빨간색 점선 원은 흡입 컵을 표시합니다. (D) 플러그는 부틸 시아노아크릴레이트와 수지 시멘트로 고정됩니다. 이미지는 후방-내측 SC를 선명하게 보여주기 위해 과다 노출됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 이광자 칼슘 이미징. (A) 플러그를 이식한 후의 쥐 뇌 해부학적 구조. 어두운 점선은 SC의 윤곽을 표시합니다. 노란색 삼각형은 삼각형 프리즘을 나타냅니다. 초록색은 GCaMP 표현식을 나타냅니다. (B) 스캔하기 전에 현미경으로 본 실리콘 삼각형 프리즘의 사진. (C) SC 뉴런에서 추출한 GCamMP의 형광 이미지로, 야생형 마우스의 이광자 현미경으로 측정한 이미지입니다. (D) 이미지에 걸친 형광의 표준 편차 투영( 비디오 1 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 광시야 칼슘 이미징. (A) 광시야 이미징 설정 사진. (B) Raw 이미지 및 다운샘플링된 이미지의 예. 노란색 점선은 SC의 윤곽을 표시합니다. (C) SC 뉴런의 칼슘 반응에 대한 단일 프레임 및 표준 편차 투영법으로, 부분 피질 마우스의 광시야 현미경으로 측정되었습니다(비디오 2 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 주사 부위에서 서로 다른 거리에 있는 쥐 뇌의 관상 절편. 맨 아래 행은 맨 위 행에 표시된 상자의 고배율을 보여줍니다. 노란색 점선 사각형은 주입 부위를 표시하며, 주입 부위에는 오른쪽 영역보다 뉴런이 적게 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: 비디오 3에서 이광자 현미경으로 시각적 자극에 대한 SC 뉴런의 칼슘 반응에 대한 원시 및 동작 보정 비디오. 이미지는 4.8Hz에서 획득하여 20Hz로 표시했습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 2: 광시야 현미경으로 시각적 자극에 대한 SC 뉴런의 칼슘 반응에 대한 원시 및 동작 보정 비디오. 이미지는 10Hz에서 획득하여 20Hz로 표시했습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 3: 12개의 다른 방향(50°/s)으로 표류하는 검은색 전체 화면 막대(너비 5°). 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
프로토콜의 중요한 단계
가장 중요한 단계는 5.2단계와 5.3단계의 개두술입니다. 첫째, 람다 뒤쪽 0.5mm의 뼈는 두껍고 내부에 혈관이 있어 시추 과정에서 출혈이 발생할 수 있습니다. 출혈을 멈추기 위해 적절한 젤 폼을 준비해야 합니다. 둘째, 횡동(transverse sinus) 바로 위의 뼈를 제거할 때 혈관 손상증이 발생할 가능성이 높습니다. 문제 해결을 위한 한 가지 다른 방법은 타원형 내부의 뼈를 얇게 만들고 조각별로 제거하는 것입니다. 또 다른 요령은 뼈를 들어 올리기 전에 뼈를 담가 뼈에서 경막이 더 쉽게 분리되고 출혈을 방지하는 것입니다.
또 다른 중요한 단계는 5.4단계의 플러그 이식으로, 전체 프로세스가 1-2분 동안 지속되어야 합니다. 문제 해결을 위해 먼저 마이크로 매니퓰레이터가 있는 플러그를 ACSF의 적절한 위치로 이동하고 플러그의 최종 위치를 설정할 수 있습니다. 그런 다음 실리콘 접착제를 넣고 플러그를 적절한 속도로 최종 위치로 이동합니다.
중요성
이 프로토콜에는 두 가지 장점이 있습니다. 첫째, 야생형 마우스에서 온전한 피질을 사용하여 단일 세포 해상도에서 후방-내측 SC를 이미징하기 위한 세부 정보를 제공하는 반면, 이전 보고서에서는 오버레이 피질을 흡인하여 전방 외측 SC를 노출시켰습니다. 둘째, 광시야 칼슘 이미징 기술을 사용하여 부분 피질 돌연변이 마우스의 전체 SC를 이미징하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 두 가지 접근 방식은 서로 다른 규모로 행동하는 동물의 다른 뇌 영역을 이미지화하는 데 적용될 수 있습니다.
두 가지 대안적인 방법이 중첩 피질(overlaying cortex)을 흡인하지 않고 후방-내측 SC를 이미지화하는 것으로 보고되었다15,16. Schröder et al.은 원형 4mm 개두술을 시행하고 SC16을 노출시키기 위해 양쪽 끝에 와셔와 유리 커버슬립이 있는 스테인리스 스틸 튜브를 부착했습니다. 우리가 사용한 것에 비해 더 큰 개두술과 더 단단한 재료는 이식 중에 출혈을 일으킬 가능성이 더 큽니다. 또한 스테인리스 스틸은 생체 적합성이 없기 때문에 만성 영상 촬영에 감염을 일으킬 가능성이 더 높습니다. 마찬가지로, Savier et al.에서 사용된 유리 커버슬립도 더 단단하고 생체 적합성이 없었으며, 출혈과 감염을 유발할 가능성이 더 높았다15. 이 두 방법의 또 다른 차이점은 바이러스 주입 부위가 이미징 창 밖에 있기 때문에 이미징 품질이 주입 부위의 잠재적 손상에 덜 영향을 받는다는 것입니다(그림 5).
프로토콜의 한계
이 프로토콜은 SC의 표층에서의 칼슘 반응의 이미징에 대한 세부사항을 제공한다. 예를 들어, 프리즘(26)을 사용하는 더 깊은 층을 이미징하는 것은 다루지 않는다. 2광자 칼슘 이미징 접근법은 후방-내측 SC의 신경 활동을 기록하는 데 사용되며 전방-외측 SC는 다루지 않습니다 7,13. 광시야 현미경을 사용한 전체 SC 칼슘 이미징을 돌연변이 부분 피질 마우스에 적용했습니다. 와이드 타입 마우스의 전체 SC를 이미징하려면 오버레이 피질을 흡인해야 합니다. 바이러스 주입 없이 전체 SC를 이미징하는 또 다른 방법은 고유 이미징 기술입니다. 그러나 신호 대 잡음비 6,8이 더 낮습니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (32271060)의 지원을 받고 있습니다. Y.-t.L.은 연구를 설계하고, 실험을 수행하고, 데이터를 분석하고, 원고를 썼습니다. Z.L.과 R.W.가 실험을 수행하였다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16x objective | Nikon | ||
| 50-mm lens | Computar | M5018-MP2 | |
| 5-mm coverslip | Warner instruments | CS-5R | |
| bandpass filter | Chroma Technology | HQ575/250 m-2p | |
| butyl cyanoacrylate | Vetbond, World Precision Instruments | ||
| camera for monitoring pupil | FLIR | BFS-U3-04S2M-CS | |
| camera for widefield imaging | Basler | acA2000-165µm | |
| corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | |
| dichroic | Chroma Technology | T600/200dcrb | |
| galvanometers | Cambridge Technology | ||
| glass bead sterilizer | RWD | RS1502 | |
| microdrill | RWD | 78001 | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | QUAD | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu | R3896 | |
| rotory encoder | USdigital | MA3-A10-125-N | |
| self-curing dental adhesive resin cement | SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan | ||
| thermostatic heating pad | RWD | 69020 | |
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP DeepSee | |
| translucent silicone adhesive | Kwik-Sil, World Precision Instruments | ||
| treadmill | Xinglin Biology | ||
| Virus Strains | |||
| rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m | Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing | ||
| Animals | |||
| C57BL/6J wild type | Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing | ||
| Emx1-Cre | The Jackson Laboratory | 5628 | |
| Pals1flox/wt | Christopher A. Walsh Lab | ||
| Software | |||
| ImageJ | NIH Image | ||
| Labview | National Instruments | ||
| MATLAB | Mathworks |
References
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- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
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