Summary
여기에서 우리는 형질전환 대두 털 뿌리의 고효율 생산을 위한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
대두(Glycine max)는 수천 가지 산업적 용도를 가진 농업에서 귀중한 작물입니다. 콩 뿌리는 질소와 병원균을 고정하기 위해 공생을 형성하는 토양 매개 미생물과의 주요 상호 작용 부위이며, 이는 농업 생산을 개선하기 위해 콩 뿌리 유전학과 관련된 연구를 가장 중요하게 만듭니다. 대두 털 뿌리(HR)의 유전적 변형은 Agrobacterium rhizogenes 균주 NCPPB2659(K599)에 의해 매개되며 처음부터 끝까지 단 2개월이 소요되는 대두 뿌리의 유전자 기능을 연구하는 데 효율적인 도구입니다. 여기에서 우리는 대두 HR에서 관심 유전자를 과발현하고 침묵시키는 방법을 설명하는 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 방법론에는 대두 종자 살균, 자엽의 K599 감염, RNA 분리를 위한 유전자 변형 HR의 선택 및 수확, 그리고 필요한 경우 대사산물 분석이 포함됩니다. 이 접근법의 처리량은 여러 유전자 또는 네트워크를 동시에 연구하기에 충분하며 장기적으로 안정적인 형질전환 접근법을 도입하기 전에 최적의 엔지니어링 전략을 결정할 수 있습니다.
Introduction
대두(Glycine max)는 농업에서 가장 가치 있는 작물 중 하나입니다. 그것은 식품, 동물 사료, 기름과 같은 수천 개의 상업 및 산업 용도를 가지고 있으며 제조 원료의 원천으로사용됩니다 1. 질소 고정 토양 미생물, 즉 근경(rhizobia)과 공생 관계를 형성하는 능력은 대두 유전학 연구의 중요성을 더욱 높인다2. 예를 들어, 콩 뿌리의 질소 고정 특성을 미세 조정하면 탄소 배출량을 줄이고 질소 비료에 대한 요구량을 크게 줄일 수 있습니다3. 따라서 특히 콩 뿌리 생물학의 측면을 제어하는 유전학을 이해하는 것은 농업과 산업 분야에서 광범위하게 응용됩니다. 이러한 이점을 고려할 때 대두 유전자의 기능을 분석하기 위한 신뢰할 수 있는 프로토콜을 갖는 것이 중요합니다.
Agrobacterium tumefaciens는 많은 식물 종의 핵 게놈에 전달 DNA(T-DNA)를 통합할 수 있는 능력이 있기 때문에 식물 유전자 변형에 가장 일반적으로 사용되는 도구일 것입니다. 아그로박테리움이 식물을 감염시키면 종양 유도(Ti) 플라스미드를 숙주 염색체로 전달하여 감염 부위에 종양을 형성합니다. 아그로박테리움 매개 형질전환은 유전자 기능 분석과 작물 형질을 변형시키기 위해 수십 년 동안 널리 사용되어 왔다4. 관심 있는 모든 유전자는 A. tumefaciens 매개 형질전환을 통해 숙주 식물 세포로 쉽게 전달될 수 있지만 이 방법에는 몇 가지 단점이 있습니다. 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며 대두와 같은 많은 식물 종에 대한 광범위한 전문 지식이 필요합니다. A. tumefaciens를 이용한 자엽 결절 접근법으로 몇 가지 종류의 대두를 형질전환시킬 수 있지만, 이 접근법의 비효율성으로 인해 신속하고 효율적인 대체 유전자 변형 기술이 필요합니다 4,5. 비전문가도 이러한 단점을 극복하기 위해 이 아그로박테리움 뿌리 유전자 매개 털뿌리(HR) 형질전환 방법을 사용할 수 있습니다.
HR 변환은 유전자 기능 분석뿐만 아니라 특수 대사 산물 및 정밀 화학 물질, 복잡한 생리 활성 당단백질 생산과 같은 생명 공학 응용 분야에도 비교적 빠른 도구입니다6. 대두 HR의 생산은 자엽의 표면에 상처를 입힌 후 아그로박테리움 리조제네스(Agrobacterium rhizogenes)를 접종함으로써 생성될 수 있기 때문에 광범위한 전문 지식을 필요로 하지 않는다 7. A. rhizogenes는 이소성 뿌리 성장을 자극하는 동시에 T-DNA 세그먼트를 식물 세포의 게놈으로 전달, 운반 및 통합하는 Ti 플라스미드에 의해 암호화된 독성(Vir) 유전자를 발현합니다8.
조직, 세포 및 장기 배양의 생물학적 또는 A. tumefaciens 기반 형질전환과 같은 다른 대두 유전자 발현 시스템과 비교하여 HR 발현 시스템은 몇 가지 이점을 나타냅니다. 첫째, HR은 유전적으로 안정적이며 호르몬이 없는 배지에서 빠르게 생산된다 1,9,10. 또한, HR은 천연 뿌리11,12와 동등하거나 그 이상의 양으로 특수 대사 산물을 생산할 수 있습니다. 이러한 장점으로 인해 HR은 A. tumefaciens와 양립할 수 없거나 양립할 수 있는 조직을 형성하기 위해 특별한 조직 배양 조건이 필요한 식물 종에 적합한 생명공학 도구입니다. HR 방법은 RNA 시퀀싱을 사용하여 단백질-단백질 상호 작용, 단백질 세포 내 국소화, 재조합 단백질 생산, 식물 정화, 돌연변이 유발 및 게놈 전체 효과를 분석하기 위한 효율적인 접근 방식입니다13,14,15. 또한 중요한 미생물 병원균인 Phytophthora sojae에 대한 대두의 방어를 촉진하고 인간에게 인상적인 항암 및 신경 보호 활성을 갖는 글리세올린을 포함하여 업계에서 가치가 있는 특수 대사 산물의 생산을 연구하는 데 사용할 수 있습니다16,17.
이 보고서는 대두 HR을 생산하기 위한 쉽고 효율적인 프로토콜을 보여줍니다. 이전 HR 형질전환 방법과 비교하여 이 프로토콜은 대두 자엽을 접종하기 전에 Ti 플라스미드의 존재에 대해 A. rhizogenes 형질전환체를 사전 스크리닝하여 HR 형성 속도에서 유의한(33%-50%) 개선을 제공합니다. 우리는 대두 전사 인자 유전자를 과발현하거나 침묵시키는 여러 이진 벡터를 변형하여 이 프로토콜의 적용 가능성을 입증합니다.
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Protocol
알림: 모든 진행 단계는 무균 상태에서 수행하는 것이 좋습니다.
1. 콩 종자 살균
- 생물 안전 캐비닛에 16-20개의 둥근 Williams 82 대두 종자를 50mL 원심분리기 튜브에 깨끗한 상태(즉, 균열이나 흠집 없음)로 넣습니다.
- 70% 이소프로필 알코올 30mL를 넣고 30초 동안 부드럽게 흔든 다음 알코올을 디캔팅합니다.
- 씨앗을 10% 표백제 30mL로 10초 동안 부드럽게 흔들고 씨앗을 실온(RT, 25°C)에서 5분 동안 용액에 그대로 둡니다. 5분 후 표백제를 배출합니다.
- 헹굼 당 1분 동안 멸균된 초순수 H2O 30mL로 진탕을 3회 반복하고 각 헹굼 사이에H2O를 버립니다.
- 멸균된 종자를 5mL의 발아 및 공동 재배(GC) 배지(오토클레이브 절반 강도 액체 Murashige 및 Skoog[MS] 배지에 1% 자당[pH = 5.8]로 포화시킨 다음 2.5mL/L 비타민)를 멸균된 페트리 접시에 넣습니다.
- 플레이트를 RT(25°C)의 어두운 곳에 3일 동안 두었다가 22°C에서 16시간 동안 차가운 흰색 T5 형광등(100μE m-2·s-1) 아래에서 4일 동안 옮겨 씨앗이 발아할 수 있도록 합니다.
알림: 구겨지거나 금이 간 씨앗은 버리십시오. 가장 좋은 씨앗은 크고 균일하게 노란색입니다. 일부 종자는 손상, 질병 또는 발아 실패로 인해 최적이 아닐 수 있으므로 좋은 품질의 종자를 선택하기 위해 실험에 필요한 종자 수를 두 배 이상 소독하십시오.
2. 자엽의 K599 감염
참고: pGWB 시리즈 벡터는 이중 선택을 통해 전체 T-DNA 카세트의 게놈 통합을 보장하므로 사용합니다. 전기천공법은 관심 유전자를 보유하는 이진 벡터를 A. rhizogenes pRi2659로 변형시키는 데 사용되었습니다18.
- A. rhizogenes pRi2659 플라스미드18의 서열에 기초하여, Ti 플라스미드 유전자를 검출하기 위한 디자인 프라이머 VirD2(VirD2 forward: 5'-CCCGATCGAGCTCAAGTTAT-3'; VirD2 역방향: 5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGT-3'; 예상 증폭 크기: 221bp). 형질전환 후, PCR 키트를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 VirD2의 보존에 대해 아그로박테리움 콜로니를 테스트합니다(재료 표 참조). PCR 사이클: 3분 동안 94°C; 35 사이클 (1 분 동안 94 °C, 30 초 동안 58 °C, 1 분 동안 72 °C); 및 72°C에서 10분 동안 반응합니다.
- VirD2와 관심 유전자(GOI)를 모두 포함하는 A. rhizogenes 콜로니를 선택한 후, 관심 플라스미드에 적합한 항생제(50mg/L)가 들어 있는 Luria-Bertani(LB) 배지 플레이트에 일부를 줄무늬로 추출하고 30°C에서 밤새 배양합니다. 스펙티노마이신을 사용하는 경우 100mg/L의 농도를 추가하십시오.
- P200 피펫 팁을 사용하여 LB 플레이트에서 ~1.5cm 길이의 K599 아그로박테리움을 긁어내고 1mL의 인산염 완충액(PB; 0.01MNa2HPO4, 0.15M NaCl, pH 7.5)에 세포를 재현탁합니다.
- 멸균된 초순수 H2O(v/v = 1:1) 및 아세토시링곤(AS; 디메틸 설폭사이드[DMSO] 중 100mM 재고, v/v = 1:1000)에 아그로박테리움을 희석합니다. 큐벳 튜브를 이용하여 광학 밀도 600nm(OD600)에서 흡광도를 측정한다. 예상되는 최적 범위는 0.5에서 0.8 사이입니다.
- 생물 안전 캐비닛에서 멸균 된 메스를 K599 아그로박테리움 용액에 담그고 자엽의 내부 표면 (adaxial, 평평한면)을 따라 1mm 깊이로 여러 번 자릅니다. 접종하는 동안 멸균 된 집게를 사용하여 자엽을 안정시킵니다.
- 약 6-8개의 자엽을 아래로 자른 채로 GS가 포함된 GC 배지로 포화된 여과지가 들어 있는 페트리 접시에 놓습니다.
참고: 6개의 플레이트를 준비하려면 50mL의 GC 배지와 50μL의 100mM AS로 100μM의 최종 농도를 달성하면 충분합니다. - 플레이트를 RT(25°C)에서 16시간 광주기(~65μE) 하에서 3일 동안 배양합니다.
- 감염된 자엽을 털이 많은 뿌리 성장(HRG) 플레이트(3% 자당[pH = 5.8] 및 2.6g/L Gelzan이 포함된 오토클레이브 절반 강도 MS)로 옮긴 다음 2.5mL/L 비타민 혼합물과 500mg/L 티멘틴을 추가합니다.
참고: 일부 대체 공급업체의 timentin에 몇 가지 문제가 있었으며 그 중 K599는 제거되지 않았습니다. HRG 매체에는 더 큰 페트리 접시 플레이트 (100mm x 25mm)를 사용하는 것이 좋습니다. - HRG 플레이트를 성장 챔버에서 22°C에서 100μE 광주기로 설정된 매개변수로 16시간 광주기에서 2-3cm 길이의 2차 뿌리가 관찰될 때까지(~3-4주) 배양합니다.
3. HR의 선택 및 수확
- 굳은살에서 자라는 1차 뿌리(길이 5-7cm)를 멸균 메스와 집게를 사용하여 2차 뿌리(길이 2-3cm)를 수확합니다. 적절한 항생제가 들어있는 HRG 플레이트로 옮깁니다. 선택 HRG 플레이트에서 HR을 5일 더 성장시키십시오.
참고: 카나마이신(50mg/L), 하이그로마이신(50mg/L) 또는 포스피노트리신(10mg/L)이 일반적으로 선택에 사용됩니다. 발현 벡터의 경우, pGWB2는 과발현에 사용되고, pANDA35HK는 RNAi 침묵에 사용되며, pGWB6은 세포내 국소화에 사용되고, pMDC7은 유도성 발현에 사용됩니다. - 5 일째에 3-6cm 길이의 2 차 뿌리를 가진 형질 전환 HR을 수확합니다. 형광 단백질을 관찰하면 2차 뿌리에는 자가형광이 거의 없습니다. 유도제 또는 화학 처리를 수행하는 경우 2차 뿌리를 1cm 조각으로 자르고 HRG 한천에 ~100mg을 더미에 놓습니다. 이어서, 말뚝을 80 μL의 적절한 처리로 포화시키고, 플레이트를 RT (25°C)에서 인큐베이션하도록 한다.
- 원하는 치료 시간 후에 RNA 또는 대사 산물 추출을 진행합니다.
- RNA의 경우 멸균된 종이 타월에 뿌리를 빠르게 두드려 건조시키고 2mL 미세 원심분리기 튜브에 직접 채취합니다.
- 파라필름을 사용하여 튜브 상단을 즉시 밀봉하고 뾰족한 집게를 사용하여 두 개의 작은 구멍을 만들고 튜브를 액체 질소에 담그십시오. 3일 동안 동결건조시킨 다음, 샘플을 -80°C에서 보관한다.
알림: 흰색인 HR을 선택하는 것이 중요합니다. 선택적 플레이트에서 5일 동안 성장한 후 형질전환 HR은 흰색으로 유지되지만 형질전환되지 않은 뿌리는 갈색으로 변합니다.
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Representative Results
대표적인 결과는 발표 된 데이터19,20에서 나온 것입니다. 형질전환된 K599 아그로박테리움의 콜로니 PCR(cPCR) 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 양성 콜로니에 의해 나타난 바와 같이, 관심있는 유전자는 cPCR에 의해 검출되었다 (도 1A). 그러나 콜로니의 1/3 내지 1/2은 VirD2 유전자 스크리닝에 대해 음성이었고(그림 1B), 이는 Ti 플라스미드의 손실을 나타내며 캘러스 또는 털이 많은 뿌리를 생성할 수 없습니다. 도 2는 대두 HRs의 전체 제조 절차 및 유전자 발현 분석을 나타낸 것이다. 그림 3은 GFP-GmJAZ1-6의 세포내 국소화를 보여줍니다. 도 4는 윌리엄스 82 털뿌리에서 글리세올린 전사인자인 GmHSF6-1 및 GmMYB29A2의 RNAi 과발현을 보여주는 유전자 발현 분석 결과이다. 유사한 결과가 여러 최근 보고서20,21에서 얻어졌다.
그림 1: 관심 유전자 또는 VirD2의 콜로니 PCR 프라이머를 사용한 K599 아그로박테리움의 콜로니 PCR(cPCR). (A) 관심 유전자 cPCR. (B) VirD2 cPCR. 약어: C = 콜로니; +ve = 양성 대조군; -ve = 음성 대조군. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 대두 털뿌리(HR) 배양 및 유전자 기능 분석 절차의 개요. K599 아그로박테리움 감염 2주 후 상처 부위에 굳은살이 형성되었습니다. 세포 분화는 1주 후에 발생했고, 이어서 HR 신장을 위해 1주가 경과하였다. 그 후 24시간 동안 HR 수확 및 벽 글루칸 추출기(WGE)/모의 처리가 이어졌습니다. HR은 각각 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC) 분석을 위한 대사산물 추출과 유전자 발현 분석을 위한 RNA 분리를 실시했습니다. WGE는 Phytophthora sojae의 벽 글루칸 유도제입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 형질전환 Williams 82 털이 많은 뿌리에서 녹색 형광 단백질(GFP)에 번역적으로 융합된 GmJAZ1-6의 형광 현미경. (A) 녹색 채널(GFP). (B) 블루 채널(DAPI). (C) 병합된 녹색 및 파란색 채널. 모든 이미지는 Zeiss 컨포칼 현미경을 사용하여 수집되었습니다. DAPI(6μg/mL) 이미지는 핵 염색을 나타냅니다. 스케일 바는 5μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 유전자 발현 분석. (A) GmHSF6-1 과발현에서의 유전자 발현 19 Williams 82 대두 HRs를 24시간 모의 처리 하에 또는 WGE로 24시간 동안 유도했습니다. (B) RNAi-GmMYB29A2 20 Williams 82 대두 HR에서 유전자 발현이 WGE로 24시간 동안 유도되었습니다. WGE는 Phytophthora sojae의 벽 글루칸 유도제입니다. ᅡ대조군보다 유의하게 크고 b가 유의하게 적으며, 쌍을 이룬 학생 t-검정(p < 0.01). 오차 막대는 SE(n≥ 3개의 생물학적 반복물)를 나타냅니다. 하나의 1차 뿌리에서 수집된 2차 뿌리는 하나의 생물학적 복제를 나타냅니다. 이 수치는 Lin et al.19 및 Jahan et al.20의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
지난 10년 동안 대두 HR 방법은 질소 고정 22,23, 생물학적 및 비생물적 스트레스 내성 24,25, 대사 산물 생합성 경로 26,27에 관여하는 유전자를 연구하는 강력한 도구로 개발되었습니다. 식물이 대사 산물을 생산하는 방법에 대한 지식은 병원체에 대한 생화학적 방어를 매개하는 유전자 네트워크를 연구하는 데 사용될 수 있기 때문에 농업 생산과 제약 산업에 많은 이점이 있습니다28.
생산성과 비용 효율성을 우선시하기 위해 이 프로토콜은 절차를 단순화합니다. 예를 들어, 겔화제를 함유한 더 비싼 고체 배지를 사용하는 대신에, 대두 종자는 액체 성장 배지로 포화된 산업용 등급의 종이 타월을 사용하여 멸균 조건 하에서 발아된다. 무균 실험실 기술과 멸균 작업 조건 유지는 곰팡이 및 효모와 같은 광범위한 미생물이 체외 배양의 오염을 일으킬 수 있기 때문에 HR 변형 실험에 필수적입니다.
또한 적절한 강도의 빛과 광주기를 사용하는 것이 HR 문화에 매우 중요합니다. 시험관 내 배양에서 식물의 성장 및 발달 과정은 다양한 이전 연구에서 관찰된 바와 같이 광도 및 광주기의 품질에 의해 크게 영향을 받습니다. 광도가 너무 낮거나 너무 높으면 루트 유도 과정이 느려질 수 있습니다. 마찬가지로, 광주기가 부적절하면 캘러스 형성 및 분화 세포 발달의 실패로 이어질 수 있다29. 또한, 우리의 과거 실험에 따르면, 비 형질 전환 HR은 유일한 항생제로 사용될 때 카나마이신 (50 mg / L)에 내성이 있습니다. 이러한 이유로, 우리는 일반적으로 하이그로마이신과 카나마이신에 대한 이중 내성을 인코딩하는 벡터를 사용합니다. 이 엄격한 선택에 따라 우리는 전체 뿌리의 15%-30%의 양성 형질전환 HR 비율을 얻을 수 있지만 이러한 HR의 ~80%는 벡터에 의해 암호화된 유전자를 상당히 과발현/침묵시켰습니다.
HR 형질전환 실험의 성공을 보장하기 위해서는 실험에 사용된 A. rhizogenes 균주가 독성 유전자를 암호화하는 Ti 플라스미드를 보유하는지 테스트하는 것이 중요합니다. Ti 플라스미드의 존재는 T-DNA를 식물 게놈4에 성공적으로 통합하는 데 필요합니다. Ti 플라스미드를 검출하기 위한 cPCR의 사용은 이 프로토콜에서 필수적인 단계가 되었습니다. 과거에는 변환의 33%-50%가 캘리와 루트를 생성하지 못한다는 것을 발견했습니다. 무의식적으로, 이것은 A. rhizogenes의 형질전환 또는 후속 배양 동안 Ti 플라스미드의 손실 때문이었습니다. 이제 형질전환 후 아그로박테리움 콜로니의 PCR 분석을 통해 Ti 플라스미드가 존재하고 형질전환 실험의 100%가 뿌리를 생성하는지 확인합니다. 이 프로토콜에서 cPCR을 사용하는 것은 표준 HR 변환 절차에 중요한 추가 사항임이 입증되었습니다. 실패한 실험 횟수를 줄여 시간과 자원을 모두 절약했습니다. 또한 cPCR 단계를 통해 형질전환 과정이 의도한 대로 작동하는지 확인할 수 있어 실험 결과의 신뢰성과 재현성을 보장할 수 있습니다.
그럼에도 불구하고 이 단순화된 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, 이 프로토콜은 형질전환 HR의 유전자 기능에 대한 기본적인 세포 생물학적 질문에 답할 수 있습니다. 그러나 새싹 및 잎과 같은 다른 식물 조직과 관련된 질문은 HR에서 테스트하지 못할 수 있습니다. 연구 중인 과정이 이소성 호르몬 수치 또는 A. rhizogenes에 의해 도입된 기타 요인의 영향을 받지 않는지 확인하는 것이 항상 중요합니다. 연구원은 한계에 주목하고 정확하고 의미 있는 결과를 보장하기 위해 실험을 신중하게 설계해야 합니다.
요약하면, 여기에 입증된 프로토콜은 콩 뿌리의 유전자 기능을 조사하기 위한 매우 효율적인 방법입니다. 우리는 최근 다유전자 공학적 접근법을 연구하고 대두 생화학적 방어 조절과 관련된 유전자 네트워크를 이해하는 데 있어 그 가치를 입증했습니다19. 이 접근법의 상대적 효율성은 수많은 유전자에 대한 조사가 필요한 식물 생물학의 복잡한 질문에 답하는 데 이상적입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회(NSERC) 보조금 번호 RGPIN-2020-06111과 Brad Lace의 관대한 기부로 자금을 지원받았습니다. K599 아그로박테리움 및 예비 프로토콜에 대해 Wayne Parrott (University of Georgia)에, pGWB2, pGWB6 및 pANDA35HK 빈 벡터에 대해 Nakagawa & Hachiya 연구실 (Shimane University)에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Cayman | 23224 | |
| Bleach | lavo | 21124 | |
| DMSO | Fisher bioreagents | 195679 | |
| Gelzan | Phytotech | HYY3251089A | |
| Hygromycin | Phytotech | HHA0397050B | |
| Isopropyl alcohol | Fisher chemical | 206462 | |
| Kanamycin | Phytotech | SQS0378007G | |
| LB powder | Fisher bioreagents | 200318 | |
| MS powder | Caisson labs | 2210001 | |
| Na2HPO4 | Fisher bioreagents | 194171 | |
| NaCl | Fisher chemical | 192946 | |
| Petri dishes | Fisherbrand | 08-757-11 | 100 mm x 25 mm |
| Phosphinothricin | Cedarlane | P034-250MG | |
| REDExtract-N-Amp PCR Kit | Sigma | R4775 | |
| Sucrose | Bioshop | 2D76475 | |
| Timentin | Caisson labs | 12222002 | |
| Vitamins | Caisson labs | 2211010 |
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