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Chemistry

Verfolgung der Elektrochemie an einzelnen Nanopartikeln mit oberflächenverstärkter Raman-Streuspektroskopie und -Mikroskopie

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65486
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry, University of Louisville
* These authors contributed equally

Summary

Das Protokoll beschreibt, wie elektrochemische Ereignisse an einzelnen Nanopartikeln mit Hilfe von oberflächenverstärkter Raman-Streuspektroskopie und Bildgebung überwacht werden können.

Abstract

Die Untersuchung elektrochemischer Reaktionen an einzelnen Nanopartikeln ist wichtig, um die heterogene Leistung einzelner Nanopartikel zu verstehen. Diese nanoskalige Heterogenität bleibt bei der ensemblegemittelten Charakterisierung von Nanopartikeln verborgen. Elektrochemische Techniken wurden entwickelt, um Ströme von einzelnen Nanopartikeln zu messen, liefern aber keine Informationen über die Struktur und Identität der Moleküle, die an der Elektrodenoberfläche reagieren. Optische Techniken wie die oberflächenverstärkte Raman-Streuung (SERS), Mikroskopie und Spektroskopie können elektrochemische Ereignisse an einzelnen Nanopartikeln detektieren und gleichzeitig Informationen über die Schwingungsmoden von Elektrodenoberflächenspezies liefern. In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Verfolgung der elektrochemischen Oxidationsreduktion von Nilblau (NB) an einzelnen Ag-Nanopartikeln mit Hilfe von SERS-Mikroskopie und -Spektroskopie demonstriert. Zunächst wird ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von Ag-Nanopartikeln auf einer glatten und semitransparenten Ag-Schicht beschrieben. Eine dipolare Plasmonenmode, die entlang der optischen Achse ausgerichtet ist, wird zwischen einem einzelnen Ag-Nanopartikel und einem Ag-Film gebildet. Die SERS-Emission von NB, die zwischen dem Nanopartikel und dem Film fixiert ist, wird in den Plasmonenmodus eingekoppelt, und die Hochwinkelemission wird von einem Mikroskopobjektiv gesammelt, um ein Donut-förmiges Emissionsmuster zu bilden. Diese donutförmigen SERS-Emissionsmuster ermöglichen die eindeutige Identifizierung einzelner Nanopartikel auf dem Substrat, aus denen die SERS-Spektren gewonnen werden können. In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur Verwendung des SERS-Substrats als Arbeitselektrode in einer elektrochemischen Zelle, die mit einem inversen Lichtmikroskop kompatibel ist, vorgestellt. Schließlich wird gezeigt, wie die elektrochemische Oxidationsreduktion von NB-Molekülen an einem einzelnen Ag-Nanopartikel verfolgt wird. Der hier beschriebene Aufbau und das Protokoll können modifiziert werden, um verschiedene elektrochemische Reaktionen an einzelnen Nanopartikeln zu untersuchen.

Introduction

Die Elektrochemie ist eine wichtige Messwissenschaft zur Untersuchung von Ladungstransfer, Ladungsspeicherung, Stofftransport usw. mit Anwendungen in verschiedenen Disziplinen, darunterBiologie, Chemie, Physik und Ingenieurwesen 1,2,3,4,5,6,7 . Herkömmlicherweise umfasst die Elektrochemie Messungen über ein Ensemble – eine große Ansammlung von Einzeleinheiten wie Molekülen, kristallinen Domänen, Nanopartikeln und Oberflächenstellen. Das Verständnis, wie solche einzelnen Entitäten zu ensemblegemittelten Antworten beitragen, ist jedoch aufgrund der Heterogenität der Elektrodenoberflächen in komplexen elektrochemischen Umgebungen der Schlüssel zu neuen grundlegenden und mechanistischen Erkenntnissen in der Chemie und verwandten Bereichen 8,9. Zum Beispiel hat die Ensemblereduktion ortsspezifische Reduktions-/Oxidationspotentiale10, die Bildung von Zwischenprodukten und kleineren Katalyseprodukten 11, die ortsspezifische Reaktionskinetik 12,13 und die Ladungsträgerdynamik 14,15 aufgedeckt. Die Reduzierung der Ensemble-Mittelung ist besonders wichtig, um unser Verständnis über Modellsysteme hinaus auf angewandte Systeme wie biologische Zellen, Elektrokatalyse und Batterien zu verbessern, in denen häufig eine große Heterogenität zu finden ist 16,17,18,19,20,21,22.

In den letzten zehn Jahren gab es ein Aufkommen von Techniken zur Untersuchung der Elektrochemievon Einzeleinheiten 1,2,9,10,11,12. Diese elektrochemischen Messungen haben die Möglichkeit geschaffen, kleine elektrische und ionische Ströme in verschiedenen Systemen zu messen und neue grundlegende chemische und physikalische Eigenschaftenaufzudecken 23,24,25,26,27,28. Elektrochemische Messungen liefern jedoch keine Informationen über die Identität oder Struktur von Molekülen oder Zwischenprodukten an der Elektrodenoberfläche 29,30,31,32. Chemische Informationen an der Elektroden-Elektrolyt-Grenzfläche sind von zentraler Bedeutung für das Verständnis elektrochemischer Reaktionen. Grenzflächenchemisches Wissen wird in der Regel durch die Kopplung von Elektrochemie und Spektroskopie gewonnen31,32. Schwingungsspektroskopie, wie z. B. Raman-Streuung, ist gut geeignet, komplementäre chemische Informationen über den Ladungstransfer und verwandte Ereignisse in elektrochemischen Systemen zu liefern, die überwiegend wässrige Lösungsmittel verwenden, aber nicht darauf beschränkt sind30. In Verbindung mit der Mikroskopie bietet die Raman-Streuspektroskopie eine räumliche Auflösung bis zur Beugungsgrenze des Lichts33,34. Die Beugung stellt jedoch eine Einschränkung dar, da Nanopartikel und aktive Oberflächenstellen kleiner sind als optische Beugungsgrenzen, was somit die Untersuchung einzelner Einheiten ausschließt35.

Die oberflächenverstärkte Raman-Streuung (SERS) hat sich als leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Grenzflächenchemie in elektrochemischen Reaktionen erwiesen 20,30,36,37,38. Zusätzlich zu den Schwingungsmoden von Eduktmolekülen, Lösungsmittelmolekülen, Additiven und der Oberflächenchemie von Elektroden liefert SERS ein Signal, das auf der Oberfläche von Materialien lokalisiert ist, die kollektive Oberflächenelektronenschwingungen unterstützen, die als lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanzen bekannt sind. Die Anregung von Plasmonenresonanzen führt zu einer Konzentration elektromagnetischer Strahlung an der Oberfläche des Metalls, wodurch sowohl der Lichtfluss als auch die Raman-Streuung von Oberflächenadsorbaten erhöht werden. Nanostrukturierte Edelmetalle wie Ag und Au sind häufig verwendete plasmonische Materialien, da sie Plasmonenresonanzen im sichtbaren Licht unterstützen, die für die Detektion von Emissionen mit hochempfindlichen und effizienten ladungsgekoppelten Geräten wünschenswert sind. Obwohl die größten Verbesserungen in SERS von Aggregaten von Nanopartikeln ausgehen39,40, wurde ein neues SERS-Substrat entwickelt, das SERS-Messungen an einzelnen Nanopartikeln ermöglicht: SERS-Substrat im Gap-Mode (Abbildung 1)41,42. In Gap-Mode-SERS-Substraten wird ein metallischer Spiegel hergestellt und mit einem Analyten beschichtet. Anschließend werden Nanopartikel über das Substrat verteilt. Bei der Bestrahlung mit zirkular polarisiertem Laserlicht wird eine dipolare Plasmonenresonanz angeregt, die durch die Kopplung von Nanopartikel und Substrat entsteht, was SERS-Messungen an einzelnen Nanopartikeln ermöglicht. Die SERS-Emission ist an die dipolare Plasmonenresonanz43,44,45 gekoppelt, die entlang der optischen Achse ausgerichtet ist. Durch die parallele Ausrichtung des strahlenden elektrischen Dipols und der Sammeloptik wird nur die Emission mit hohem Winkel erfasst, wodurch unterschiedliche donutförmige Emissionsmuster46,47,48,49 gebildet werden, die die Identifizierung einzelner Nanopartikel ermöglichen. Aggregate von Nanopartikeln auf dem Substrat enthalten strahlende Dipole, die nicht parallel zur optischen Achse50 verlaufen. In letzterem Fall werden Emissionen mit niedrigem und hohem Winkel gesammelt und bilden feste Emissionsmuster46.

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Herstellung von Gap-Mode-SERS-Substraten und ein Verfahren, um sie als Arbeitselektroden zur Überwachung elektrochemischer Redoxereignisse an einzelnen Ag-Nanopartikeln mit Hilfe von SERS zu verwenden. Wichtig ist, dass das Protokoll unter Verwendung von Gap-Mode-SERS-Substraten die eindeutige Identifizierung einzelner Nanopartikel durch SERS-Bildgebung ermöglicht, was eine zentrale Herausforderung für aktuelle Methoden in der Einzelnanopartikel-Elektrochemie darstellt. Als Modellsystem demonstrieren wir die Verwendung von SERS, um die elektrochemische Reduktion und Oxidation von Nilblau A (NB) an einem einzelnen Ag-Nanopartikel auszulesen, das durch ein Raster- oder Stufenpotential angetrieben wird (d.h. zyklische Voltammetrie, Chronoamperometrie). NB durchläuft eine Multi-Protonen-, Multi-Elektronen-Reduktions-/Oxidationsreaktion, bei der seine elektronische Struktur aus der Anregungsquelle heraus / in Resonanz mit ihr moduliert wird, was einen Kontrast in den entsprechenden SERS-Spektren 10,51,52 erzeugt. Das hier beschriebene Protokoll ist auch auf nicht-resonante redoxaktive Moleküle und elektrochemische Techniken anwendbar, die für Anwendungen wie die Elektrokatalyse relevant sein können.

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Protocol

1. Gap-Mode-SERS-Substratvorbereitung

  1. Reinigen Sie die Deckgläser Nr. 1 (siehe Materialtabelle) mit einer Aceton- und Wasserwäsche, wie unten beschrieben. Führen Sie diesen Schritt in einem Reinraum durch, um sicherzustellen, dass sich kein Schmutz oder andere unerwünschte Stoffe auf den Deckgläsern ablagern.
    1. Legen Sie die Deckgläser in ein Objektträgergestell. Verwenden Sie eine Pinzette, wenn Sie die Deckgläser/Substrate bewegen. Legen Sie das Objektträgergestell in einen Glasbehälter und füllen Sie ihn mit Aceton.
      ACHTUNG: Aceton ist leicht entzündlich und hat potenziell negative Auswirkungen auf die Gesundheit. Behandeln Sie es in einem gut belüfteten Bereich mit Handschuhen, Schutzbrille und einer Maske.
    2. Stellen Sie die Leistungsregelung des Ultraschallgenerators auf 8 ein und beschallen Sie den Glasbehälter 15 Minuten lang mit dem Objektträgergestell.
    3. Nehmen Sie das Objektträgergestell aus dem Behälter und spülen Sie das Objektträgergestell und die Deckgläser gründlich mit hochreinem Wasser (spezifischer Widerstand von 18,2 MΩ·cm) aus.
    4. Legen Sie das Objektträgergestell mit Deckgläsern in einen Glasbehälter und füllen Sie ihn mit Reinstwasser. Beschallen Sie den Glasbehälter mit dem Objektträgergestell für weitere 15 Minuten mit den gleichen Einstellungen.
    5. Nehmen Sie das Objektträgergestell aus dem Behälter und waschen Sie das Objektträgergestell und die Deckgläser gründlich mit Reinstwasser.
    6. Trocknen Sie die Deckgläser mit einer Spritzpistole mit einem Strahl aus hochreinemN2-Gas .
  2. Cu und Ag auf den gereinigten Deckgläsern ablagern. Verwenden Sie dazu das Elektronenstrahl-Dünnschichtabscheidungssystem nach Standardverfahren, wie vom Hersteller in der offiziellen Bedienungsanleitung empfohlen.
    HINWEIS: Für alle anderen Erklärungen befolgen Sie bitte die Anweisungen des Herstellers, wie sie in den Einrichtungen des Instituts53 zur Verfügung gestellt werden.
    1. Stellen Sie die Plattenposition auf 180° ein und entlüften Sie die Vakuumkammer.
    2. Ordnen Sie die sauberen Deckgläser nebeneinander in der Auflagefläche des Instruments an, damit sie sich nicht überlappen. Verwenden Sie hitzebeständiges Klebeband (Polyimidfolie), um die Deckgläser auf der Walze zu befestigen.
      Anmerkungen: Dadurch wird sichergestellt, dass sich die Deckgläser während des Vorgangs nicht bewegen oder herunterfallen.
    3. Füllen Sie einen Graphittiegel zur Hälfte mit Cu-Pellets und setzen Sie ihn in den Tiegelhalter ein. Machen Sie dasselbe für Ag in einem zweiten Tiegel. Schließen Sie die Vakuumkammer und beginnen Sie mit dem Abpumpen. der empfohlene Abscheidedruck liegt in der Größenordnung von 10−7 – 10−6 Torr.
    4. Laden Sie die Cu-Eigenschaften in die Anwendung des Sensors. Schalten Sie die Plattendrehung bei 20 U/min ein. Stellen Sie die Plattenposition auf 225° ein.
      Anmerkungen: Dadurch wird der Spiegel auf der Unterseite der Platte so positioniert, dass der Elektronenstrahl vom Sichtfenster aus gesehen werden kann.
    5. Schalten Sie den Unterbrecher an die Elektronenstrahlstromversorgung ein und warten Sie mindestens 2 Minuten. Schalten Sie den Elektronenstrahl ein und warten Sie weitere 2 Minuten. Öffnen Sie den Substratverschluss.
      Anmerkungen: Dadurch werden der Strahl und der Tiegel durch den Spiegel sichtbar.
    6. Erhöhen Sie den Emissionsstrom allmählich (bei ca. 10 mA/min), bis der Sensor eine Abscheiderate nahe 10 Å/s anzeigt. Schließen Sie den Verschluss und stellen Sie die Plattenposition auf 0° ein.
      Anmerkungen: Der Balken kann sich während dieses Vorgangs verformen. Es ist wichtig, es während dieses Schritts regelmäßig zu überprüfen und seine Position, Amplitude und Frequenz mit den entsprechenden Knöpfen zu korrigieren. Der Strahl muss den Inhalt des Tiegels gleichmäßig erwärmen. Durch das Schließen des Verschlusses an dieser Stelle wird sichergestellt, dass sich kein Metall auf den Proben ablagert, wenn sich die Walze dreht, um die Deckgläser im Weg des verdampften Metalls zu positionieren.
    7. Öffnen Sie den Verschluss, um die Abscheidung zu starten, und überwachen Sie die vom Sensor angezeigte Dicke. Schließen Sie den Verschluss, wenn die gewünschte Dicke (1 nm für Cu) erreicht ist, wie vom Abscheidungssensor bestimmt.
    8. Verringern Sie allmählich den Strom des Elektronenstrahls, bis der Sensor nahe 0 A anzeigt, der Strom jedoch hoch genug ist, dass der Tiegel sichtbar ist.
    9. Stellen Sie die Position der Walze auf 225° ein und öffnen Sie den Verschluss, um den Tiegel sehen zu können.
    10. Drehen Sie den Tiegelhalter mit dem Knopf so, dass der Strahl auf den Tiegel mit Ag-Pellets gerichtet ist.
    11. Laden Sie die Ag-Eigenschaften in die Anwendung des Sensors. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.6 – 1.2.7, verwenden Sie jedoch eine Abscheiderate von 20 Å/s und eine Dicke von 25 nm für Ag.
    12. Verringern Sie den Strom allmählich auf 0 A und schalten Sie den Elektronenstrahl und den Unterbrecher aus. Stellen Sie die Position der Walze auf 180° ein und entlüften Sie die Vakuumkammer. Öffnen Sie die Vakuumkammer.
    13. Die Deckgläser sollten sich an der gleichen Stelle wie zuvor befinden, frei von Fremdkörpern oder Staubpartikeln und mit dem Aussehen eines Spiegels. Entfernen Sie langsam und vorsichtig das hitzebeständige Klebeband.
      Anmerkungen: Ziehen Sie das Klebeband parallel zur Oberfläche der Walze zurück. Es besteht die Gefahr, dass die Deckgläser brechen. Die Folie sollte homogen und teilweise transparent sein (siehe Abbildung 2A).
  3. Inkubieren Sie den Ag-Dünnfilm mit einer Nilblau-Lösung, wie unten beschrieben.
    1. Geben Sie 500 μl 50 μM NB-Lösung auf die Oberfläche des Ag-Dünnfilms.
    2. Spülen Sie den Ag-Dünnfilm nach 15 Minuten gründlich mit Reinstwasser ab, um schwach adsorbierte NB-Moleküle zu entfernen. Trocknen Sie den Ag-Dünnfilm mitN2-Gas .
    3. Tropfengießen von Ag-Nanopartikeln auf den NB-inkubierten Ag-Dünnfilm. Geben Sie 500 μl einer 100-fachen Verdünnung des Ag-Nanopartikelkolloids auf denselben Bereich des Ag-Dünnfilms, in dem die NB-Lösung tropfengegossen und inkubiert wurde.
      VORSICHT: Metallnanopartikel sind giftig für den menschlichen Körper. Fassen Sie sie in einem gut belüfteten Bereich mit Handschuhen und Schutzbrille an.
    4. Spülen Sie nach 20 Minuten das Substrat (Gap-Mode SERS) mit Reinstwasser ab. Trocknen Sie den Untergrund mit N2 Gas.

2. Charakterisierung von Gap-Mode-SERS-Substraten

  1. Ultraviolett-sichtbare Spektroskopie
    1. Schalten Sie das Gerät ein, indem Sie die Ein-/Aus-Taste drücken. Starten Sie die Scan-Software, indem Sie auf die Verknüpfung auf dem Desktop doppelklicken.
    2. Klicken Sie auf Setup, um das Setup-Fenster zu öffnen. Klicken Sie unter Y-Modus auf das Dropdown-Menü Modus und wählen Sie %T aus, um die Durchlässigkeit zu messen. Ändern Sie im X-Modus Start auf 800 und Stop auf 200, um von 800 nm bis 200 nm zu scannen.
    3. Wählen Sie auf der Registerkarte Baseline das Optionsfeld Baseline-Korrektur aus, und schließen Sie das Setup-Fenster . Klicken Sie auf Grundlinie , um eine Hintergrundkorrektur mit atmosphärischer Luft durchzuführen.
    4. Öffnen Sie das Probenfach. Kleben Sie ein Ende der Ag-Folie senkrecht zum Strahlweg auf den Probenhalter.
    5. Klicken Sie auf Start , um ein Transmissionsspektrum aus der Probe zu erhalten.
  2. Rasterkraftmikroskopie (AFM) Messungen
    1. Schließen Sie das AFM an den Computer an (über einen USB-Anschluss), schalten Sie das AFM-Gerät ein und starten Sie Nanosurf Easyscan 2.
    2. Nehmen Sie den AFM-Kopf (mit dem sich der AFM-Ausleger an der Unterseite befindet) vorsichtig vom Probentisch ab und legen Sie ihn kopfüber beiseite.
    3. Befestigen Sie ein Ag-Dünnschichtsubstrat mit Klebeband auf dem Probentisch. Platzieren Sie den AFM-Kopf über dem Probentisch. Stellen Sie sicher, dass sich der AFM-Kopf parallel zum Probentisch befindet (Monitor mit der Füllstandsanzeige). Wenn der AFM-Kopf und der Probentisch nicht waagerecht sind, verwenden Sie die Nivellierschrauben, um den Tisch einzustellen und die Nivellierblase in der Füllstandsanzeige zu zentrieren.
    4. Bewegen Sie den Probentisch mithilfe der Seiten- und Draufsicht in der Software vorsichtig so nah wie möglich an den AFM-Kopf (AFM-Cantilever), ohne ihn zu berühren. Stellen Sie sicher, dass der Probentisch den AFM-Cantilever am AFM-Kopf nicht berührt.
    5. Wählen Sie auf der Registerkarte " Erfassung " die Option "Phasenkontrast " als Belichtungsmodus und " PPP-XYNCHR" als Cantilever-Typ aus. Klicken Sie auf Laser Align, um sicherzustellen, dass der Laser auf die Cantilever-Spitze fokussiert ist und der von der Spitze reflektierte Strahl auf die Mitte des Fotodiodendetektors trifft.
    6. Messen Sie die Resonanzschwingungsfrequenz des Cantilevers mit der AFM-Software, indem Sie auf die Schaltfläche Frequenz-Sweep klicken, und stellen Sie sicher, dass die Frequenzkurve eine Glockenform hat. Wenn Sie auf Annäherung klicken, landen Sie die Cantilever-Spitze auf der Oberfläche der Ag-Dünnschicht.
    7. Wählen Sie im Imaging-Assistenten eine Imaging-Größe von 10,8 μm x 10,8 μm und eine Scangeschwindigkeit von 0,5 s/Zeile aus. Verwenden Sie unter dem Z-Controller einen Sollwert von 50 %, eine P-Verstärkung von 2.500 und eine I-Verstärkung von 2.500. Verwenden Sie unter Moduseigenschaften eine freie Schwingungsamplitude von 300 mV.
    8. Klicken Sie auf Start , um ein Bild aufzunehmen. Speichern Sie das Bild, indem Sie mit der rechten Maustaste darauf klicken, Kopieren auswählen und es in den Bildprozessor einfügen.
    9. Wählen Sie in der AFM-Software das zu bearbeitende Bild aus, indem Sie darauf klicken. Führen Sie auf der Registerkarte Analyse eine Flächen- und Linienrauheitsanalyse durch, indem Sie auf Linienrauheit berechnen bzw. Fläche berechnen klicken.
    10. Ziehen Sie die Cantilever-Spitze von der Ag-Dünnschichtoberfläche ab, indem Sie auf Herausziehen klicken. Bewegen Sie den Probentisch von der Spitze weg, indem Sie die Bewegung in der Seiten- und Draufsicht überwachen. Entnehmen Sie die Probe.
  3. Rasterelektronenmikroskopie (REM)Messungen 54
    1. Gießen Sie 30 μl des erhaltenen Ag-Nanopartikel-Kolloids auf einen Si-Wafer und lassen Sie es vollständig an der Luft trocknen. Befestigen Sie den Si-Wafer mit doppelseitigem leitfähigem Klebeband auf einem Probenstummel.
    2. Entlüften Sie die REM-Kammer über die Benutzeroberfläche des Geräts. Schieben Sie die REM-Kammer auf und montieren Sie den Stummel an einem der Löcher im Tisch.
    3. Schließen Sie die REM-Kammer und pumpen Sie die REM-Kammer über die Benutzeroberfläche des Geräts ab.
    4. Positionieren Sie die Probe ca. 10 mm von der Elektronenstrahlkanone entfernt. Schalten Sie den Elektronenstrahl über die Benutzeroberfläche des Geräts ein.
    5. Bilden Sie die Probe mit einem Everhart-Thornley-Detektor mit einer Spotgröße von 6, einem Strahlstrom von 25 pA und einer Hochspannung von 5 kV ab.
    6. Doppelklicken Sie auf den gewünschten Bereich für die Elektronenkanone, um den Elektronenstrahl automatisch auszurichten. Führen Sie Bildgebungen mit einer 3.500-fachen Vergrößerung über die Benutzeroberfläche des Geräts durch (Abbildung 3A).
    7. Schalten Sie nach Abschluss der Bildgebung den Elektronenstrahl aus und bewegen Sie die Probe mindestens 20 mm von der Elektronenstrahlkanone weg.
    8. Entlüften Sie die REM-Kammer. Schieben Sie die REM-Kammer auf und entfernen Sie den Probenstummel aus dem Tisch. Schließen Sie die REM-Kammer und pumpen Sie sie über die Benutzeroberfläche des Geräts ab.

3. Vorbereitung der elektrochemischen Zelle

  1. Erhalten Sie eine 5 cm lange Glasmulde, indem Sie ein Glasrohr mit einem Glasrohrschneider schneiden, wie unten beschrieben.
    1. Wickeln Sie die Ketten des Glasrohrschneiders um das Rohr. Befestigen Sie das letzte Segment der Kette an der anderen Seite des Werkzeugs.
    2. Halten Sie das Werkzeug mit einer Hand am Griff. Halten Sie mit der anderen Hand das Glasröhrchen fest. Drehen Sie das Glasrohr kontinuierlich, so dass die Räder in der Kette beginnen, das Glas zu schneiden.
    3. Drücken Sie das Werkzeug vorsichtig zusammen, indem Sie nach und nach mehr Kraft auf die Griffe ausüben. Wenn sich das Geräusch von Gleiten zu Kratzen ändert, ist das der Zeitpunkt, an dem sich das Glasstück (Brunnen) vom Glasrohr löst.
    4. Glätten Sie das abgebrochene Ende der Glasmulde mit Schleifpapier der Körnung 120 (oder gröber). Mit Schleifpapier der Körnung 220 (oder feiner) polieren.
  2. Schneiden Sie das Gap-Mode-Substrat mit einem Diamantritzer ab, wie unten beschrieben.
    1. Legen Sie das Gap-Mode-Substrat auf eine ebene Fläche. Bewegen Sie den Diamantritzer in der Mitte des Gap-Mode-Substrats auf und ab, während Sie leichten Druck auf die Oberfläche des Substrats ausüben.
    2. Brechen Sie das Substrat manuell in zwei Teile, sobald ein Kratzer sichtbar ist.
  3. Befestigen Sie die geschliffene Glasmulde (aus Schritt 3.1) wie unten beschrieben an der Oberfläche des Substrats.
    1. Geben Sie zweikomponentiges Epoxidharz auf ein kleines Blatt Aluminiumfolie. Mischen Sie das Produkt mit einem Rührstäbchen oder einer Pipettenspitze.
    2. Tragen Sie die Mischung auf den unteren Rand der Glasmulde auf. Tragen Sie die kleinstmögliche Mischung auf, um den Rand des geschliffenen Glases gut zu bedecken, um die Ausbreitung des Harzes auf den inneren Teil der Zelle zu minimieren.
    3. Kleben Sie das Glas gut auf die Oberfläche des Gap-Mode-Substrats. Tragen Sie das verbleibende gemischte Produkt auf die Außenseiten der Vertiefung auf, wo es auf das Substrat trifft, um die Möglichkeit eines Auslaufens der in die Glasvertiefung gegossenen Lösung auszuschließen (siehe Abbildung 4A).
    4. Lassen Sie das Epoxidharz 5 Minuten lang ungestört aushärten.
  4. Schließen Sie den elektrischen Anschluss wie unten beschrieben an das SERS-Substrat im Gap-Mode an.
    1. Besorge dir einen 5 cm langen Kupferdraht. Verteilen Sie zweikomponentiges leitfähiges Epoxidharz auf ein kleines Blatt Aluminiumfolie. Mischen Sie die Produktkomponenten mit dem Kupferdraht.
    2. Befestigen Sie den Draht an der Oberfläche des Substrats (außerhalb der Vertiefung, aber an der leitfähigen Ag-Dünnschicht; siehe Abbildung 4A). Lassen Sie das leitfähige Epoxidharz für die empfohlene Zeit ungestört aushärten.
      Anmerkungen: Es wird empfohlen, das leitfähige Epoxidharz bei Raumtemperatur aushärten zu lassen, um das thermische Glühen des Ag-Filmsubstrats zu minimieren.

4. Zyklische Voltammetriemessungen

  1. 10 ml 0,5 mM NB und 0,1 M Phosphatpuffer (pH = 5) in ein 20-ml-Becherglas geben. Führen Sie eine mechanisch polierte Ag-Scheibenelektrode, einen Pt-Draht und eine Ag/AgCl-Elektrode (3 M KCl) in die Elektrolytlösung ein.
  2. Befestigen Sie jede Elektrode an der entsprechenden Potentiostatenklemme (vom Hersteller des Potentiostaten festgelegt). Achten Sie darauf, dass die Elektroden keinen Kontakt zueinander haben.
  3. Führen Sie eine zyklische Voltammetrie (CV) von 0 bis −0,6 V mit einer Abtastrate von 50 mV/s durch.

5. Elektrochemische Einzelnanopartikel-SERS-Mikroskopie- und Spektroskopiemessungen

  1. Platzieren Sie die elektrochemische Zelle, die mit dem Gap-Mode-SERS-Substrat präpariert wurde, auf den Tisch eines inversen Lichtmikroskops.
  2. Kleben Sie die Kanten des Substrats auf den Mikroskoptisch, damit es sich während der spektroelektrochemischen Messungen nicht aufgrund der Spannung der Drähte, die die Zelle mit dem Potentiostaten verbinden, bewegt (siehe Abbildung 4B).
  3. Setzen Sie die Ag/AgCl-Referenzelektrode (3 M KCl) in das selbstgebaute Stativ ein und fixieren Sie ihre Position, indem Sie die Schraube am Elektrodenhalterständer festziehen.
  4. Befestigen Sie die Referenzelektrode an der Referenzelektrode des Potentiostaten Krokodilklemme (weiße Farbe). Befestigen Sie die Pt-Draht-Gegenelektrode an der Krokodilklemme der Gegenelektrode des Potentiostaten (rote Farbe). Befestigen Sie den Cu-Draht, der an der Ag-Folie befestigt ist, an der Arbeitselektroden-Krokodilklemme des Potentiostaten (grüne Farbe).
  5. Stecken Sie den Pt-Draht zusammen mit der Krokodilklemme in den Elektrodenhalter und ziehen Sie die Schraube fest, um ihre Position zu fixieren.
  6. Platzieren Sie den Elektrodenhalter über der elektrochemischen Zelle, um die Elektroden in die Zelle einzuführen. Achten Sie darauf, dass die Elektroden die Ag-Folie nicht berühren. Dies führt nicht nur zu einem Kurzschluss, sondern beschädigt auch die Folie.
  7. Schalten Sie das Spektrometer und die EMCCD-Kamera ein und starten Sie die "LightField"-Software.
  8. Schalten Sie den 642-nm-Laser ein und stellen Sie den Laser auf eine Leistung von 500 μW ein.
    ACHTUNG: Die Einwirkung von Laserlicht kann zu dauerhaften Schäden an Augen und Haut führen. Konsultieren und befolgen Sie die Sicherheitsrichtlinien der zuständigen offiziellen Aufsichtsbehörde in Ihrem Land/Ihrer Region.
  9. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Objektiv. Bewegen Sie den Fokusknopf, um das Objektiv vorsichtig anzuheben, bis das Öl den Boden des Substrats berührt.
    Anmerkungen: Da die Zelle mit Klebeband verklebt ist, kann das Objektiv durch Aufdrücken gegen das Substrat die Zelle brechen und/oder das Objektiv beschädigen.
  10. Fokussieren Sie den Laser auf die Oberfläche des Gap-Mode-SERS-Substrats. Scannen Sie das Gap-Mode-SERS-Substrat (das von der Glasmulde bedeckt ist), um nach einem isolierten donutförmigen NB-SERS-Emissionsmuster zu suchen, indem Sie den Mikroskoptisch bewegen (siehe Abbildung 5A).
    HINWEIS: Je niedriger die Konzentration des NB ist, desto schwieriger wird es, donutförmige Emissionsmuster zu finden, aber desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass das letztendliche donutförmige Emissionsmuster isoliert wird. Kaffeeringe sind ein guter Anfang, und dann kann man sich in Bezug auf den Inkubationsbereich der NB- und Ag-Nanopartikel auf dem Gap-Mode-SERS-Substrat nach innen bewegen. Kameras (siehe nächster Schritt) sind dabei hilfreich, da sie beim Abtasten des Gap-Mode-SERS-Substrats lichtempfindlicher sind als das menschliche Auge.
  11. Schließen Sie ein Telefon an den Telefonadapter des Mikroskops an. Um die Kamera des Telefons auf das Objektiv des Adapters auszurichten, schalten Sie die Kameraanwendung auf dem Telefon ein und ändern Sie die Position des Geräts, um durch das Objektiv zu sehen.
  12. Entfernen Sie eines der Okulare des Mikroskops und setzen Sie den Adapter ein. Ändern Sie in der Kameraanwendung den Modus in Video und zoomen Sie so weit wie möglich hinein. Das donutförmige Emissionsmuster ist deutlich zu erkennen.
  13. Sobald das donutförmige Emissionsmuster deutlich lokalisiert ist, bewegen Sie den Lichtumlenkhebel des Mikroskops, um das emittierte Licht auf das Spektrometer zu lenken.
  14. Klicken Sie auf der Registerkarte "Experiment" von "LichtFeld" auf "Allgemeine Aufnahmeeinstellungen" und stellen Sie die Belichtungszeit auf 0,1 s und die zu speichernden Bilder auf 50 ein. Wählen Sie unter "Daten exportieren" die Option "Erfasste Daten exportieren" aus, und ändern Sie den Dateityp in CSV (.csv).
  15. Wählen Sie unter "Regions of Interest" das Optionsfeld "Benutzerdefinierte Regions of Interest" aus. Klicken Sie auf ROIs bearbeiten und erstellen Sie im neuen Fenster einen ROI von 25 x 25 Pixel um die donutförmige Emission, indem Sie die X-, Y-, B- und H-Werte ändern.
  16. Wählen Sie unter Spektrometer das 600 g/mm, 750 nm Blaze-Gitter aus. Ändern Sie die mittlere Wellenlänge auf 642 nm. Klicken Sie auf Erfassen , um die Messungen zu starten.
  17. Nachdem die Erfassung abgeschlossen ist, wechseln Sie zur Registerkarte Daten . Öffnen Sie das zuletzt durchgeführte Experiment und klicken Sie auf Prozesse und dann auf Frame-Kombination.
  18. Notieren Sie sich im kombinierten Spektrum die Laserwellenlänge, bei der die höchste Intensität beobachtet wird.
  19. Gehen Sie zurück zu Experiment und klicken Sie unter Spektrometer auf nm. Ändern Sie im Popup-Fenster den Messmodus in relative Wellenzahlen und geben Sie die gemessene Laserwellenlänge in das Feld ein. Ändern Sie die Gitterposition auf 1.000/cm, um die Stokes-verschobene Raman-Streuung von etwa 400/cm auf 1.600/cm zu erkennen.
  20. Erfassen und summieren Sie mindestens 50 Bilder von NB SERS-Spektren mit einer Belichtungszeit von 0,1 s (siehe Abbildung 5C). Achten Sie auf einen starken Peak bei 592/cm, um zu bestätigen, dass die Emission von NB stammt (siehe Abbildung 5C)52. Nehmen Sie ein SERS-Spektrum der Region, die an das donutförmige Emissionsmuster angrenzt (eine Region ohne Emission), um das Hintergrundsignal zu kompensieren.
  21. Halten Sie das Laserlicht auf das donutförmige Emissionsmuster fokussiert und geben Sie 3 ml der 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH = 5) mit einer einstellbaren 5-ml-Pipette in die elektrochemische Zelle.
    HINWEIS: Sobald die Elektrolytlösung hinzugefügt wird, kann das donutförmige Emissionsmuster verschwinden und ein festes Emissionsmuster erscheinen, da die Dipolmoden des einzelnen Nanopartikels außerhalb der optischen Achse SERS-Spektren der Elektrolyt- und Lösungsmittelmoleküle abstrahlen.
  22. Fokussieren Sie bei Bedarf neu und stellen Sie sicher, dass das Laserlicht immer noch auf das Emissionsmuster fokussiert ist.
  23. Bereiten Sie in der Software des Potentiostaten ein zyklisches Voltammogramm-Experiment mit mindestens drei Zyklen von 0 bis −0,6 V gegenüber Ag/AgCl (3 M KCl) und einer Abtastrate von 50 mV/s vor. Um die spektrale und elektrochemische Datenerfassung zu synchronisieren, konfigurieren Sie den Potentiostaten so, dass er durch die spektrale Erfassung des Spektrometers ausgelöst wird.
  24. Führen Sie die simultanen CV- und SERS-Experimente aus. Die NB-SERS-Spektren sollten durch das an das Gap-Mode-SERS-Substrat angelegte Potential moduliert werden (siehe Abbildung 6B).
  25. Bewegen Sie den Lichtumstellhebel so, dass das Licht auf die Telefonkamera gerichtet ist. Beginnen Sie mit der Aufnahme eines Videos und führen Sie das CV-Experiment wie beschrieben aus. Die SERS-Bildintensität sollte entsprechend dem auf das Gap-Mode-SERS-Substrat angelegten Potenzial moduliert werden (siehe die Einschübe in Abbildung 6A).

6. Bildgebende Analyse

  1. Verarbeiten Sie die gesammelten Bilder, um die Schärfe und den Kontrast zu verbessern, wie unten beschrieben.
    HINWEIS: Die Bildverarbeitung wurde mit der OpenCV-Bibliothek in Python durchgeführt, und das Skript ist auf GitHub (github.com/jvhemmer/jove_specsers) verfügbar.
    1. Schneiden Sie das Bild zu, um den größten Teil des Leerraums zu entfernen, und zentrieren Sie es um das Emissionsmuster.
    2. Löschen Sie die grünen und blauen Kanäle des Rahmens. Erhöhen Sie die Schärfe, indem Sie eine Gaußsche Unschärfemaske des Rahmens subtrahieren.
    3. Erhöhen Sie den Kontrast durch Dynamikbereichserweiterung mit einem Operator zur Leistungserhöhung.
  2. Fügen Sie den Bildern mit ImageJ Maßstabsleisten hinzu, wie unten beschrieben.
    1. Bilden Sie mit dem Telefonkameraadapter ein Objekt mit bekannten Abmessungen ab, z. B. einen Objektträger für die Mikroskopkalibrierung.
    2. Laden Sie mit ImageJ das gesammelte Bild. Zeichnen Sie ein Segment auf einen Bereich des abgebildeten Objekts mit bekannten Abmessungen.
    3. Stellen Sie die Skalierung (d. h. Pixel pro Entfernungseinheit) basierend auf der Länge des gezeichneten Segments mit der Funktion Skalierung festlegen ein. Fügen Sie die Skala mit dem Werkzeug Skalieren hinzu.

7. Analyse der Nanopartikelgröße

  1. Laden Sie das REM-Bild in ImageJ. Zeichnen Sie ein Segment auf der vom Instrument bereitgestellten Maßstabsleiste, und legen Sie es mit der Funktion " Skalierung festlegen" fest.
  2. Gehen Sie zu Bild > Geben Sie > 16-Bit ein. Gehen Sie zu Bild > Passen Sie > Auto-Schwellenwert an. Wählen Sie im Dropdown-Menü die Option Standard aus.
  3. Wählen Sie mit dem Werkzeug Rechteck die Features aus, bei denen es sich nicht um einzelne Nanopartikel handelt, und löschen Sie sie.
  4. Verwenden Sie das Werkzeug "Partikel analysieren ". Berechnen Sie den Durchmesser der Partikel mit den erhaltenen Flächen, indem Sie eine Kreisform annehmen.

8. Spektroelektrochemische Datenanalyse

  1. Führen Sie eine Hintergrundkorrektur der erfassten Spektraldaten durch. Durchführen von Datenverarbeitung und Plotten in MATLAB; Die Skripte sind wie zuvor erwähnt im selben GitHub-Repository verfügbar.
  2. Mittelung der Spektraldaten aus drei verschiedenen Hintergrundexperimenten (Spektraldaten, die zusammen mit dem SERS-Emissionsmuster gesammelt wurden). Subtrahieren Sie das durchschnittliche Hintergrundspektrum vom Spektrum der Stichprobe.
  3. Erstellen Sie ein Zeitarray von 0 bis zur Gesamtzeit des Experiments (zyklische Voltammetrie), in dem das Intervall die Summe der Belichtungszeit, der EMCCD-Auslesezeit und der Öffnungs- und Schließzeiten des Verschlusses ist.
  4. Wandeln Sie die Wellenlängenmessungen mithilfe der Laserwellenlänge in Raman-Verschiebung um.
  5. Generieren Sie ein Wasserfalldiagramm mit der Netzfunktion von MATLAB, wobei X die Raman-Verschiebung, Y die Zeit und Z die Intensität ist.

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Representative Results

Abbildung 2A zeigt Ag-Dünnschichtsubstrate, die mit einem Elektronenstrahl-Metallabscheidungssystem hergestellt wurden. Das in Abbildung 2A gezeigte "gute" Substrat weist eine homogene Bedeckung mit Ag-Metall über dem Glasdeckglas auf, während das "schlechte" Substrat eine ungleichmäßige Bedeckung mit Ag aufweist. Das ultraviolett-sichtbare Spektrum der "guten" Ag-Dünnschicht ist in Abbildung 2B dargestellt, die zeigt, dass die Schicht für den sichtbaren Teil des elektromagnetischen Spektrums teilweise transparent ist. Das "gute" Ag-Dünnschichtsubstrat hat eine optische Transparenz von 34% für das 642 nm Laserlicht, das für die spektroelektrochemischen Experimente im aktuellen Protokoll verwendet wird. Abbildung 2C zeigt ein repräsentatives AFM-Bild einer 10,8 μm x 10,8 μm großen Fläche des "guten" Substrats. Der mittlere quadratische Rauheitswert der repräsentativen Fläche beträgt 0,7 nm, was darauf hinweist, dass die Ag-Dünnschicht atomar glatt ist. Die Variation in der Höhe des Ag-Dünnschichtsubstrats wird durch das in Abbildung 2D gezeigte Linienprofil dargestellt, das die Gleichmäßigkeit und Glätte des Films weiter demonstriert.

Abbildung 3A zeigt eine repräsentative REM-Aufnahme von Ag-Nanopartikeln, die tropfengegossen und luftgetrocknet auf einem Si-Wafer wurden. Bei einer Analyse von 243 Nanopartikeln betrug der durchschnittliche Durchmesser der in diesem Protokoll verwendeten Ag-Nanopartikel 79,2 nm ± 8,4 nm. Es ist zu beachten, dass auch Gold- oder Ag-Nanopartikel unterschiedlicher Größe verwendet werden können55. Darüber hinaus verwendet dieses Protokoll hochgradig monodisperse Nanopartikel, aber es gibt keine Dispersitätsanforderung, da dieses Protokoll die Messung einzelner Nanopartikel ermöglicht. Um ein Gap-Mode-SERS-Substrat zu konstruieren, wurden in dieser Arbeit die Ag-Nanopartikel auf der Oberfläche eines Ag-Dünnschichtsubstrats abgeschieden, das zuvor mit NB inkubiert worden war (Abbildung 3B).

Ein Gap-Mode-SERS-Substrat wurde als Arbeitselektrode verwendet, um eine elektrochemische Zelle zu konstruieren, wie in Abbildung 4A gezeigt. Die elektrochemische Zelle wurde auf einem Mikroskoptisch immobilisiert und mit einem Potentiostaten verbunden, wie in Abbildung 4B dargestellt. Mit der elektrochemischen Zelle, die auf einem inversen Lichtmikroskop montiert war, wurde ein 642-nm-Laser auf die Gap-Mode-SERS-Substrat-Arbeitselektrode in einer Epi-Beleuchtungsgeometrie fokussiert. Einzelne Ag-Nanopartikel auf dem Ag-Dünnfilm in Luft können eindeutig durch ein donutförmiges Emissionsmuster identifiziert werden, wie in Abbildung 5A dargestellt. Diese donutförmigen Emissionsmuster können zuverlässig als Signatur zur Identifizierung einzelner Ag-Nanopartikel verwendet werden49. Wenn mehr als ein einzelnes Nanopartikel (Dimer, Trimer oder Multimer) im Beleuchtungsvolumen vorhanden ist, wird ein festes Emissionsmuster beobachtet, wie in Abbildung 5B dargestellt. Nach dem Einbringen der Elektrolytlösung wird das donutförmige Emissionsmuster typischerweise in ein festes Emissionsmuster umgewandelt. Der Grund dafür ist, dass die dipolaren Plasmonenmoden innerhalb des einzelnen Nanopartikels (nicht auf die optische Achse ausgerichtet) die Emission der Lösungsmittel- und Elektrolytmoleküle in alle Richtungen abstrahlen. Daher ist das Emissionsmuster eine Überlagerung der NB-SERS-Emission mit hohem Winkel aus dem Nanopartikel-Substrat-Spalt und der SERS-Emission mit niedrigem Winkel aus den Elektrolyt- und Lösungsmittelmolekülen. Durch die Entfernung der elektrolytischen Lösung werden die donutförmigen Emissionsmuster wiederhergestellt. In diesem Protokoll wird nach der Identifizierung eines einzelnen Nanopartikels durch SERS-Bildgebung die SERS-Spektroskopie verwendet, um das Redox-Sondenmolekül zu identifizieren. Das SERS-Spektrum in Abbildung 5C entspricht dem donutförmigen Emissionsmuster, das in Abbildung 5A dargestellt ist. Die Schwingungsmoden stellen einen Fingerabdruck für die NB-Moleküle dar.

Abbildung 6A zeigt repräsentative zyklische Voltammogramme von NB in Phosphatpuffer (pH = 5), die unter Verwendung einer Ag-Scheiben-Arbeitselektrode und einer Pt-Draht-Gegenelektrode erhalten wurden. Vor spektroelektrochemischen Messungen einzelner Nanopartikel wird ein zyklisches Voltammogramm erstellt, um das Ensemble-Redox-Verhalten der Sondenmoleküle – in diesem Fall NB – zu verstehen. In dieser Arbeit wurde ein kathodischer Peak bei −0,27 V im Vergleich zu Ag/AgCl (3 M KCl) beobachtet, da das angelegte Potential von 0 auf −0,6 V verschoben wurde. Als das Potential auf 0 V zurückgekehrt wurde, wurde ein anodischer Peak bei −0,21 V beobachtet. Für die spektroelektrochemischen Messungen wurde derselbe angelegte Potentialbereich verwendet, wie in Abbildung 6B dargestellt. Nach der Identifizierung eines einzelnen Ag-Nanopartikels, das ein Donut-förmiges Emissionsmuster aufwies, wurde die Elektrolytlösung in die elektrochemische Zelle pipettiert. Unter Laserbeleuchtung wurden die SERS-Spektren dann kontinuierlich erfasst, während das angelegte Potential zwischen 0 und −0,6 V bei einer Abtastrate von 50 mV/s geschwenkt wurde (Abbildung 6B). Die NB-Moleküle in und um die Lücke zwischen dem Ag-Nanopartikel und dem Ag-Film wurden elektrochemisch reduziert (ausgeschalteter Zustand) und die SERS-Intensität nahm ab, wie im Wasserfalldiagramm der SERS-Spektren gezeigt (auch ein Einschub in Abbildung 6A). Als das angelegte Potential von −0,6 auf 0 V geschwenkt wurde, stieg die SERS-Intensität an, da die NB-Moleküle elektrochemisch oxidiert wurden (im On-Zustand). Die Modulation in SERS-Signalen stellt eine Methode dar, um die Reduktions- und Oxidationspotentiale von NB an einem einzelnen Nanopartikel zu bestimmen. Die Voltammetrie kann durch andere elektrochemische Techniken ersetzt werden, um Redoxreaktionen weiter zu charakterisieren. Abbildung 7A zeigt die SERS-Antwort von NB, wenn das Potential der Arbeitselektrode auf −0,4 V (d. h. Chronoamperometrie) abgestuft wurde. Wenn das Elektrodenpotential auf −0,4 V geschritten wurde, fiel das SERS-Signal aufgrund der Reduzierung von NB ab. Diese spektroelektrochemische Technik ermöglicht es, das transiente Verhalten von Redoxreaktionen auf der Ebene einzelner Nanopartikel zu untersuchen. Abbildung 7B zeigt, wie die Reduktionskinetik durch die Größe der angelegten elektrischen Vorspannung verändert wurde, was durch den Zerfall der Fläche unter dem Peak von 592/cm belegt wird. Interessanterweise zeigen die starken Variationen im normalisierten Bereich, dass stochastische Ereignisse auf dieser Skala eine größere Rolle spielen. Wie mit der konventionellen Voltammetrie und Chronoamperometrie demonstriert, ermöglicht das in diesem Artikel beschriebene Protokoll den Forschern, die Schwingungsmoden von Molekülen zu verfolgen, wenn sie elektrochemisch reduziert oder an einem einzelnen Nanopartikel oxidiert werden. Darüber hinaus ermöglichen Schwingungsanalysen von Molekülen auf der Oberfläche einzelner Nanopartikel die Unterscheidung zwischen chemischen und elektrochemischen Schritten, was bei der Untersuchung von Reaktionsmechanismen nützlich ist.

Figure 1
Abbildung 1: Gap-Mode-SERS-Substrat. Schematische Darstellung eines Gap-Mode-Substrats, das durch Platzieren einzelner Metallnanopartikel auf einem Metallspiegel hergestellt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Charakterisierung von Ag-Dünnschichtsubstraten. (A) Digitale Fotografien eines guten und eines schlechten Ag-Dünnschichtsubstrats, die durch ein Elektronenstrahl-Metallverdampfungssystem präpariert wurden. (B) Ein ultraviolett-sichtbares Transmissionsspektrum eines guten Substrats. (C) Ein AFM-Bild einer repräsentativen Fläche von 10,8 μm x 10,8 μm eines guten Substrats. (D) Ein Linienprofil des AFM-Bildes, das durch die in (C) gezeigte schwarze gestrichelte Linie gekennzeichnet ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Charakterisierung von Ag-Nanopartikeln . (A) REM-Aufnahme eines wässrigen Ag-Nanopartikel-Kolloids, tropfengegossen und luftgetrocknet auf einem Si-Wafer. Der durchschnittliche Durchmesser der Nanopartikel beträgt 79,2 nm, mit einer Standardabweichung von 8,4 nm. (B) Schematische Darstellung des Gap-Mode-SERS-Substrats. Die blauen Sterne stellen NB-Moleküle dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Herstellung der spektroelektrochemischen Zelle . (A) Eine repräsentative spektroelektrochemische Zelle, die unter Verwendung eines Gap-Mode-SERS-Substrats als Arbeitselektrode hergestellt wurde. (B) Eine spektroelektrochemische Zelle, die auf einem inversen optischen Mikroskoptisch für elektrochemische Spektroskopie- und Mikroskopieexperimente mit Einzelnanopartikeln immobilisiert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Identifizierung eines einzelnen Ag-Nanopartikels auf dem Ag-Dünnschichtsubstrat . (A) Ein donutförmiges NB-SERS-Emissionsmuster, das anzeigt, dass das Signal von einem einzelnen Ag-Nanopartikel stammt. (B) Ein festes NB-SERS-Emissionsmuster, das anzeigt, dass das Signal von mehr als einem einzelnen Nanopartikel stammt. (C) Das in (A) gezeigte SERS-Spektrum der donutförmigen Emission zeigt den charakteristischen Peak bei 592/cm aus der Ringverformungsschwingungsmode von NB52. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Elektrochemie und Spektroelektrochemie von NB. (A) Zyklische Voltammogramme von 0,5 mM NB in 0,1 M Phosphatpuffer (pH = 5) unter Verwendung einer Ag-Scheiben-Arbeitselektrode. Die Einschübe zeigen elektrochemische SERS-Bilder von NB auf einem einzelnen Ag-Nanopartikel auf dem Gap-Mode-SERS-Substrat bei den NB-Oxidations- (unteres Bild) und Reduktionspotentialen (oberes Bild). Die Maßstabsbalken stellen 300 nm dar. (B) Elektrochemische Modulation des NB-SERS-Spektrums durch zyklische Voltammetrie an einem einzelnen Ag-Nanopartikel auf dem Gap-Mode-SERS-Substrat. Ein Pt-Draht und eine Ag/AgCl-Elektrode (3 M KCl) wurden als Gegen- bzw. Referenzelektroden verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Spektroelektrochemie des Potentialschritts von NB. (A) Elektrochemische Modulation des NB-SERS-Spektrums durch einen Potentialschritt von 0 bis −0,4 V (vs. Ag/AgCl), angelegt bei t = 0 (gestrichelte Linie). Die Intensität des Peaks bei 592/cm nimmt mit der Zeit ab, da die NB-Moleküle in der Nähe des Ag-Nanopartikels abnehmen. (B) Transientenprofil der normierten Fläche unter dem Peak von 592/cm in Abhängigkeit vom angelegten Potential: −0,2 V (blaue Kurve), −0,4 V (grüne Kurve) und −0,6 V (rote Kurve). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Das Abscheiden von dünnen Cu- und Ag-Metallfilmen auf sauberen Deckgläsern ist von entscheidender Bedeutung, um sicherzustellen, dass die endgültige Folie eine Rauheit von nicht mehr als zwei bis vier Atomlagen aufweist (oder eine mittlere quadratische Rauheit von weniger als oder gleich etwa 0,7 nm). Staub, Kratzer und Schmutz auf dem Deckglas vor der Metallabscheidung sind häufige Probleme, die die Herstellung der glatten Folie verhindern, die zur Erzeugung donutförmiger Emissionsmuster erforderlich ist. Daher empfiehlt es sich, die Deckgläser vor der Metallabscheidung in verschiedenen Lösungsmitteln zu beschallen und diesen Prozess nach Möglichkeit in einem Reinraum durchzuführen. Darüber hinaus sollte dem Hinterlegungsverfahren besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden. Es kann erforderlich sein, alle Oberflächen in der Vakuumkammer (einschließlich der Tiegelhalterschublade) und die Tiegel zu reinigen, da sich in diesen Teilen Staub und Schmutz ansammeln können.

Die hohen Abscheideraten, die während des Metallabscheidungsprozesses verwendet werden, ermöglichen es, dass der abgeschiedene Film atomar glatt ist, kann aber auch schwieriger zu kontrollieren sein. Das falsche Ablesen der Schichtdickensensoren kann zu inhomogenen, zu dicken oder zu dünnen Schichten führen. Wenn die Metallschichten zu dünn sind, können sich anstelle einer durchgehenden Oberfläche Materialinseln ablagern. Zu dicke Schichten führen zu undurchsichtigen Substraten, die verhindern, dass das Anregungslicht die NB-Moleküle effizient anregt und die Sammlung von Emissionslicht behindert. Dies wiederum verringert die Gesamtempfindlichkeit der Methode und liefert SERS-Bilder und -Spektren von schlechter Qualität mit geringem Signal-Rausch-Verhältnis. Die Abscheidung von Cu vor Ag ist entscheidend für die Adhäsion des letztgenannten Metalls, aber die Abscheidung von überschüssigem Cu verringert die optische Transparenz des Substrats, während eine unzureichende Menge an Cu zur Delamination des Ag aus den Glasdeckgläsern führt. Wenn die Abmessungen der Probenplatte größer sind als die des Verschlusses, kann sich außerdem verdampftes Metall auf den Deckgläsern ablagern, während der Verschluss geschlossen ist, was zu einer Inhomogenität des Substrats führt, wie in Abbildung 2A gezeigt.

Die Konzentrationen und Inkubationszeiten für die NB-Lösungen und Ag-Nanopartikelsuspensionen spielen eine Schlüsselrolle bei der Herstellung eines qualitativ hochwertigen Gap-Mode-SERS-Substrats. Die Verwendung von NB-Lösungen mit höheren Konzentrationen als im Protokoll empfohlen oder die Verwendung längerer Inkubationszeiten können zu hohen Hintergrundsignalen führen und damit die Lokalisierung einzelner Ag-Nanopartikel erschweren. Andererseits führen eine niedrige NB-Lösungskonzentration und eine kurze Inkubationszeit zu einer geringen Abdeckung der NB-Moleküle auf dem Ag-Dünnfilm, was die Identifizierung einzelner Ag-Nanopartikel zu einem zeitaufwändigen Prozess macht. In ähnlicher Weise führt die Verwendung einer Ag-Nanopartikelsuspension mit einer höheren Konzentration als im Protokoll empfohlen oder die Verwendung längerer Inkubationszeiten zu einer Agglomeration der Ag-Nanopartikel auf dem Ag-Dünnfilm; Diese Agglomeration wird somit zu SERS-Substraten führen, die einen hohen Prozentsatz an festen Emissionsmustern erzeugen, und zu einer Verringerung der Anzahl der Substratstellen, die als einzelne Nanopartikel identifiziert werden können. Im Gegensatz dazu führt die Verwendung einer weniger konzentrierten Ag-Nanopartikelsuspension oder einer kürzeren Inkubationszeit zu einer geringen Abdeckung von Ag-Nanopartikeln. In diesem Fall wird ein größerer Anteil der SERS-Emissionsmuster von einzelnen Ag-Nanopartikeln stammen, aber der Durchsatz des Experiments wird reduziert.

Für die erfolgreiche Implementierung der in dieser Arbeit beschriebenen elektrochemischen Einzelpartikel-SERS-Bildgebungs- und Spektroskopietechnik muss dem spektroelektrochemischen Versuchsaufbau besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden. Erstens ist die Identifizierung einzelner Ag-Nanopartikel auf dem Gap-Mode-SERS-Substrat unter Verwendung von Donut-förmigen Emissionsmustern von zentraler Bedeutung für den erfolgreichen Einsatz der beschriebenen Methode. Eine mehr als 100-fache Vergrößerung des optischen Bildes und ein Mikroskopobjektiv mit einer hohen numerischen Apertur (z. B. 1,45) sind in der Regel erforderlich, um die donutförmigen Emissionsmuster zu beobachten. Die hohe numerische Apertur ist besonders wichtig für die Erfassung von Emissionen mit hohem Winkel. Zweitens ist es wichtig, die Sammlung der SERS-Spektren mit dem elektrochemischen Programm zu synchronisieren. Bei diesem Protokoll wird ein Transistor-Transistor-Logikimpuls vom Spektrometerdetektor an den Potentiostaten gesendet, um die gleichzeitige Erfassung der SERS-Spektren und elektrochemischen Daten auszulösen. Darüber hinaus muss die Auslesezeit des Detektors berücksichtigt werden, um die angelegten Potentiale genau mit den SERS-Spektren in der Voltammetrie zu korrelieren.

Die Interpretation von Schwingungsmoden ist ein wichtiger Bestandteil der SERS-Spektroskopie. Ag neigt zur Bildung von Oxiden, die den elektrochemischen Prozess der Studie56 beeinflussen können. In diesem Protokoll wurden von SERS keine Oxidschichten detektiert, aber längere Lufteinwirkung oder Oxidationspotentiale verursachen die Bildung von Oxiden auf dem Ag-Spiegel und/oder Nanopartikeln. Die Oxidschichten können die Adsorption redoxaktiver Moleküle verändern und so Verschiebungen in den Schwingungsmoden induzieren. Im aktuellen Protokoll beobachteten wir keine Verschiebungen der Schwingungsmoden zwischen den NB-Molekülen, die an das Si, den Ag-Film oder die Ag-Nanopartikel adsorbiert wurden. Wir stellen auch fest, dass die Anregung von Plasmonenresonanzen, wie denen des Gap-Mode-Substrats, zur Erzeugung von heißen Elektronen und heißen Löchern führt, die nicht im Gleichgewicht sind und an Redoxreaktionen teilnehmen können57,58,59,60. Um Interferenzen durch lichtinduzierte heiße Ladungsträger zu minimieren, werden Fluenzen bei schwachem Licht gefördert.

Die hier beschriebene Technik kann die Einschränkungen anderer Einzelnanopartikeltechniken wie der kollisionsbasierten Elektrochemie 61,62,63, der elektrochemischen Rastermikroskopie 64,65,66 und der elektrochemischen Rasterzellmikroskopie67,68,69 überwinden. Mit diesen elektrochemischen Techniken ist es möglich, die elektrochemische Reaktion einzelner Nanopartikel zu messen. Es ist jedoch nicht möglich, die Identität und strukturelle Informationen über die Edukte, Zwischenprodukte und Produkte direkt zu erhalten. Die in diesem Protokoll beschriebene Technik ermöglicht es, elektrochemische Reaktionen an einzelnen Nanopartikeln zu verfolgen und chemische Informationen durch Schwingungsspektroskopie zu gewinnen. Diese elektrochemische Gap-Mode-SERS-Methode liefert jedoch die besten Ergebnisse, wenn die SERS-Substrate mit den SERS-aktivsten Metallen unter Anregung im sichtbaren Licht hergestellt werden: Ag und Au. Dies kann die Auswahl an Metallen, die in der Technik verwendet werden können, einschränken. Darüber hinaus liefert Gap-Mode-SERS zwar chemische Informationen über elektrochemische Prozesse, die an einzelnen Nanopartikeln ablaufen, aber nur ensemblegemittelte elektrochemische Informationen, da die Stromantwort über das gesamte Substrat gemessen wird. Nichtsdestotrotz ist die in dieser Arbeit demonstrierte Technik ein leistungsfähiges Werkzeug, mit dem grundlegende mechanistische Kenntnisse in verschiedenen Bereichen der Elektrochemie gewonnen werden können, einschließlich der elektrokatalytischen Reaktionen, die für die Energiespeicherung 70,71, die chemische Rohstoffsynthese 72,73 und die Sensoren 74,75 wichtig sind.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Anschubfinanzierungen der University of Louisville und durch Mittel der Oak Ridge Associated Universities durch einen Ralph E. Powe Junior Faculty Enhancement Award unterstützt. Die Autoren danken Dr. Ki-Hyun Cho für die Erstellung des Bildes in Abbildung 1. Die Metallabscheidung und das REM wurden am Micro/Nano Technology Center der University of Louisville durchgeführt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone, microelectronic grade J. T. Baker 9005-05
Adjustable pipette, Eppendorf Reference 2 5000 mL Eppendorf 4924000100
Analytical Balance, AB54-S/FACT Metter Toledo N.A.
Atomic Force Microscope, Easy scan 2 Nanosurf N.A.
AXXIS Electron Beam Thin Film Deposition System Kurt J. Lesker N.A.
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer Agilent N.A.
Conductive epoxy, two part Electron Microscopy Sciences 12642-14
Copper pellets, 99.99% pure Kurt J. Lesker EVMCU40EXE
Copper wire, bare, 18 AWG VWR 66248-040
Crucible, Graphite E-Beam Kurt J. Lesker EVCEB-23
Diamond Scriber Ted Pella 54484
EMCCD Camera, ProEM HS: 1024BX3 Teledyne Princeton Instruments N.A.
Epoxy, Clear Gorilla Glue N.A.
Glass Tube Cutter Wheeler-Rex 69012
Glass Tube, Borossilicate (OD 0.75", ID 0.62", L 12") McMaster-Carr 8729K45
Immersion oil, Type-F Olympus IMMOIL-F30CC
Inverted Microscope, IX73 Olympus N.A.
Laser, Excelsior One 642 nm Free space Spectra-Physics N.A.
LightField Teledyne Princeton Instruments N.A.
MATLAB 2022b MathWorks N.A.
Micro cover glass (coverslips), 24×60 mm No. 1 VWR 48404-455
Microscope Smartphone Camera Adapter qhma QHMC017A-S01
Nile Blue A, pure Acros Organics 415690100
Nitrogen, Ultra Pure, Compressed Specialty Gases N.A.
Objective, UPLanXApo 100× Oil Immersion Olympus 14-910
Polyimide Film, Kapton 3M 16089-4
Potassium Phosphate Monobasic VWR P285
Potentiostat, 660E  CH Instruments N.A.
Pt wire Alfa Aesar 10956-BS
Scanning Electron Microscope, Apreo C SEM Thermo Fischer Scientific N.A.
Si wafer Ted Pella 16006
Silver nanoparticles (nanospheres), NanoXact 0.02 mg/mL in 2 mM citrate nanoComposix AGCN60
Silver pellets, 99.99% pure Kurt J. Lesker EVMAG40EXE-A
Slide Rack, Wash-N-Dry Diversified Biotech WSDR-2000
Smartphone, iPhone 13 mini Apple N.A.
Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate VWR 0348
Spectrometer, IsoPlane SCT320 Teledyne Princeton Instruments N.A.
Tissue Wipers, Light-duty  VWR 82003-820
Tweezers, KS-04 Kaisi Hardware N.A.
Utrasonic Generator, sweepSONIK Blackstone-NEY Ultrasonics 809379
Water Ultrapurifier, Sartorius Arium mini Sartorius N.A.

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References

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Chemie Heft 195
Verfolgung der Elektrochemie an einzelnen Nanopartikeln mit oberflächenverstärkter Raman-Streuspektroskopie und -Mikroskopie
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Hemmer, J. V., Joshi, P. B., Wilson, … More

Hemmer, J. V., Joshi, P. B., Wilson, A. J. Tracking Electrochemistry on Single Nanoparticles with Surface-Enhanced Raman Scattering Spectroscopy and Microscopy. J. Vis. Exp. (195), e65486, doi:10.3791/65486 (2023).

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