Summary
Hier wordt een nieuwe versie van expansiemicroscopie (ExM) gepresenteerd, Magnify, die is aangepast voor maximaal 11-voudige expansie, met behoud van een uitgebreide reeks biomolecuulklassen en compatibel is met een breed scala aan weefseltypen. Het maakt de ondervraging van de nanoschaalconfiguratie van biomoleculen mogelijk met behulp van conventionele diffractie-beperkte microscopen.
Abstract
De beeldvorming op nanoschaal van biologische specimens kan het begrip van ziektepathogenese verbeteren. In de afgelopen jaren is aangetoond dat expansiemicroscopie (ExM) een effectief en goedkoop alternatief is voor optische superresolutiemicroscopie. Het is echter beperkt door de behoefte aan specifieke en vaak aangepaste verankeringsmiddelen om verschillende biomolecuulklassen in de gel te behouden en door problemen met het uitbreiden van standaard klinische monsterformaten, zoals formaline-gefixeerd paraffine-ingebed weefsel, vooral als grotere expansiefactoren of geconserveerde eiwit-epitopen gewenst zijn. Hier beschrijven we Magnify, een nieuwe ExM-methode voor robuuste expansie tot 11-voudig in een breed scala aan weefseltypen. Door methacroleïne te gebruiken als het chemische anker tussen het weefsel en de gel, behoudt Magnify meerdere biomoleculen, zoals eiwitten, lipiden en nucleïnezuren, in de gel, waardoor de brede beeldvorming op nanoschaal van weefsels op conventionele optische microscopen mogelijk wordt. Dit protocol beschrijft best practices om robuuste en scheurvrije weefselexpansie te garanderen, evenals tips voor het hanteren en afbeelden van sterk uitgebreide gels.
Introduction
Biologische systemen vertonen structurele heterogeniteit, van de ledematen en de organen tot de niveaus van eiwitten op nanoschaal. Daarom vereist een volledig begrip van de werking van deze systemen visueel onderzoek op deze grootteschalen. De diffractielimiet van licht veroorzaakt echter uitdagingen bij het visualiseren van structuren kleiner dan ~ 200-300 nm op een conventionele fluorescentiemicroscoop. Bovendien vormen optische superresolutiemethoden 1,2,3, zoals gestimuleerde emissiedepletie (STED), foto-geactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM), stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM) en gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM), hoewel krachtig, hun eigen uitdagingen, omdat ze dure hardware en reagentia vereisen en vaak trage acquisitietijden hebben en een slecht vermogen om grote volumes in 3D in beeld te brengen.
Expansiemicroscopie4 (ExM) biedt een alternatieve manier om de diffractielimiet van licht te omzeilen door biomoleculen covalent te verankeren in een wateropzwellende polymeergel en ze fysiek uit elkaar te trekken, waardoor ze oplosbaar worden op conventionele optische microscopen. Een groot aantal ExM-protocolvarianten zijn ontwikkeld sinds de oorspronkelijke publicatie van ExM minder dan tien jaar geleden, en deze protocollen maken de directe opname van eiwitten 5,6,7, RNA 8,9,10 of lipiden11,12,13 mogelijk in het gelnetwerk door het chemische anker te veranderen of het monster verder uit te breiden (waardoor de effectieve resolutie wordt verbeterd), hetzij in een enkele stap14 of meerdere iteratieve stappen15,16. Tot voor kort kon geen enkel ExM-protocol deze drie biomolecuulklassen behouden met een enkel commercieel verkrijgbaar chemisch anker, terwijl het een mechanisch stevige gel leverde die ~ 10-voudig kon uitzetten in een enkele uitbreidingsronde.
Hier presenteren we Magnify17, een recente toevoeging aan het ExM-arsenaal dat methacroleïne gebruikt als het biomolecuulanker. Methacroleïne vormt covalente bindingen met weefsel zoals dat van paraformaldehyde, waardoor meerdere klassen biomoleculen in het gelnetwerk kunnen worden gehouden zonder dat verschillende specifieke of aangepaste verankeringsmiddelen nodig zijn. Bovendien kan deze techniek een breed spectrum van weefsels tot 11-voudig uitbreiden, inclusief notoir uitdagende monsters zoals formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde (FFPE) klinische monsters. Eerdere methoden voor het uitbreiden van dergelijke mechanisch stijve monsters vereisten een harde proteasevertering, waardoor de antilichaametikettering van eiwitten van belang onmogelijk werd nadat het monster was uitgebreid. Deze techniek daarentegen bereikt de uitbreiding van FFPE klinische monsters met behulp van een hete denatureringsoplossing, waardoor hele eiwit-epitopen in de gel behouden blijven, die kunnen worden gericht op beeldvorming na uitbreiding (figuur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures met dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health (NIH) en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Carnegie Mellon University. Menselijke weefselmonsters werden commercieel verkregen.
1. Bereiding van de voorraadreagentia en -oplossingen
OPMERKING: Raadpleeg de materiaaltabel voor een lijst van de gebruikte reagentia.
- Bereid de geleerbouillonoplossingen voor. Deze worden direct voor de geleerstap gecombineerd.
- Bereid de monomeer-stockoplossing (4 g/100 ml N,N- dimethylacrylamidezuur [DMAA], 50 g/100 ml natriumacrylaat [SA], 66,7 g/100 ml acrylamide [AA], 0,10 g/100 ml N,N′-methyleenbisacrylamide [Bis], 33 g/100 ml natriumchloride [NaCl], 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing; PBS) met behulp van de in tabel 1 vermelde componenten. Los alle stamoplossingen op of verdun ze in water. De monomeer-stamoplossing kan gedurende ten minste 3 maanden bij 4 °C worden bewaard.
- Maak de volgende stamoplossingen afzonderlijk in water: 0,5% (w / w) 4-Hydroxy-TEMPO (4HT), dat gelatie remt tijdens monomeerdiffusie in de weefsels, en 10% (w / w) tetramethylethyleendiamine (TEMED), dat de radicale generatie versnelt die wordt geïnitieerd door ammoniumpersulfaat (APS) en wordt bereid bij 10% (w / w).
OPMERKING: De stamoplossingen kunnen worden verdeeld in aliquots van 1-2 ml en gedurende maximaal 3 maanden bij 4 °C worden bewaard; APS wordt echter onmiddellijk vóór het bereiden van de geleeroplossing gemaakt.
- Bereid de homogenisatiebuffer (1% m/v S.D.S., 8 M ureum, 25 mM EDTA, 2x PBS, pH 8, bij kamertemperatuur [R.T.]) door 1 g SDS, 48,048 g ureum, 5 ml EDTA (0,5 M, pH 8), 20 ml 10x PBS, 25 ml Tris (2 M) en 0,75 g glycine te combineren. Voeg water toe voor een totaal volume van 100 ml. De oplossing kan naar behoefte omhoog of omlaag worden geschaald en kan bij R.T. worden opgeslagen.
2. Weefselvoorbereiding voor gearchiveerde en vers bereide klinische weefselglaasjes
OPMERKING: De weefselvoorbewerkingsstappen verschillen afhankelijk van hoe de monsters worden bereid.
- Volg de onderstaande stappen voor klinische monsters met formaldehyde-gefixeerde paraffine (FFPE).
- Plaats de monsters in een opeenvolgende reeks oplossingen (een glazen plaatkleurpot of een conische buis van 50 ml kan worden gebruikt): xyleen, 95% ethanol, 70% ethanol en 50% ethanol, gevolgd door dubbel gedeïoniseerd water. Gebruik elke oplossing twee keer gedurende ten minste 3 minuten elke keer. Gebruik een tang om de dia in de container te plaatsen en voeg 15 ml van de betreffende oplossing toe (genoeg om het monster te bedekken). Plaats de afgedekte conische buis horizontaal op een schudder bij kamertemperatuur.
- Volg de onderstaande stappen voor monsters die zijn gekleurd en gemonteerd op permanente dia's.
- Plaats de dia kort in xyleen en verwijder de afdekstroken voorzichtig met een geschikt gereedschap, zoals een scheermesje. Als de dekslip vast blijft zitten, brengt u de dia's in xyleen terug naar kamertemperatuur totdat de dekplaat loskomt.
- Verwerk de monsters vervolgens als FFPE-monsters (stap 2.1.1).
OPMERKING: Voor hematoxyline en eosine (H &E) -gekleurde dia's gaat de hematoxyline- en eosinekleuring verloren tijdens het expansieproces.
- Voor niet-gefixeerde bevroren weefselglaasjes in een optimale snijtemperatuur (OCT)-oplossing, fixeert u de weefsels in aceton gedurende 10 minuten bij −20 °C voordat u de monsters driemaal wast met 1x PBS-oplossing gedurende 10 minuten telkens bij kamertemperatuur.
- Voor eerder gefixeerde bevroren klinische weefselglaasjes, smelt u de OCT door de dia's gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur te incuberen en wast u vervolgens drie keer met 1x PBS-oplossing gedurende 5 minuten telkens op kamertemperatuur.
3. Weefselvoorbereiding voor paraformaldehyde-gefixeerde muizenhersenen
- Volg dit protocol voor hersensecties van muizen die 30-50 μm dik zijn.
OPMERKING: Succes kan worden gevonden met grotere secties, maar langere tijden kunnen nodig zijn voor monomeeroplossingsdiffusie en homogenisatie. - Als de secties momenteel niet worden opgeslagen in een 1x PBS-oplossing (bijvoorbeeld in een 30% [v/v] glycerol en 30% [v/v] ethyleenglycoloplossing in 1x PBS), was dan drie keer gedurende ten minste 10 minuten elke keer op kamertemperatuur in 1x PBS in een 6-tot-24-putplaat.
- Verkrijg een ongecoate glasmicroscopiedia. Als één kant van de glasplaat is gecoat, gebruik dan een natte kwast om te controleren op de ongecoate kant (vaak is het label van de gecoate kant gemaakt van geslepen glas en wordt het minder ondoorzichtig als het nat is).
- Gebruik een penseel om de ongecoate dia nat te maken. Verwijder het hersenweefsel van de muis uit de putplaat met de kwast en plaats het voorzichtig op de dia, met behulp van een rollende beweging om ervoor te zorgen dat het weefsel plat is. Laat overtollige PBS op het weefsel blijven totdat alle secties zijn gemonteerd.
OPMERKING: Hoewel een enkele glasplaat voor meerdere weefselsecties kan worden gebruikt, moet er meer zorg worden besteed aan het feit dat ze niet volledig uitdrogen wanneer meer weefselsecties tegelijk worden gelled (zelfs op afzonderlijke dia's). - Verwijder met een papieren laboratoriumdoek het grootste deel van de overtollige PBS van de dia. Laat een kleine vloeibare ring rond elk weefselgedeelte, maar laat de rest van de dia grotendeels droog. Deze resterende vloeistof bedekt het weefsel terwijl de gelmonomeeroplossing wordt bereid.
4. Geleer
OPMERKING: Dit protocol is geschikt voor alle weefseltypen die zijn voorbereid voor gebruik met deze techniek.
- Breng afstandhouders aan weerszijden van het weefselgedeelte aan (figuur 2A) om weefselcompressie te voorkomen. Om dit te doen, maakt u de afstandhouders door stukken afdekglas dun te snijden met een pen met diamantpunt en ze vervolgens aan de dia te bevestigen met kleine hoeveelheden water of 1x PBS, of bevestig ze met een kleine hoeveelheid secondelijm. Plaats vervolgens de afstandhouders voorzichtig aan weerszijden van het weefsel.
- Bereid de uiteindelijke geleeroplossing. Over het algemeen is ~ 200 μL voldoende per weefselsectie, maar het volume mag niet hoger zijn dan 800 μL per dia. Elke meer geleeroplossing zal resulteren in spillover.
OPMERKING: Methacroleïne wordt gebruikt om biomoleculen in de gel te verankeren. Er is echter geen afzonderlijke verankeringsstap vereist en methacroleïne kan rechtstreeks aan de uiteindelijke geleeroplossing worden toegevoegd.- Combineer per sectie het volgende in volgorde: 200 μL monomeeroplossing, 0,5 μL 0,5% 4HT-stamoplossing (1:400 verdunning), 0,2-0,5 μL methacroleïne (1:400-1:1.000 verdunning, afhankelijk van het weefseltype; gebruik in het algemeen een verdunning van 1:1.000 voor paraformaldehyde [PFA]-vaste monsters en 1:400 voor klinische FFPE-monsters), 2 μL 10% TEMED-stamoplossing (1:100 verdunning), en 5 μL 10% A.P.S. stockoplossing (1:40 verdunning).
OPMERKING: Bereid de uiteindelijke geleeroplossing onmiddellijk voor gebruik. Om voortijdig geleer te voorkomen, voegt u de APS-oplossing als laatste toe.
- Combineer per sectie het volgende in volgorde: 200 μL monomeeroplossing, 0,5 μL 0,5% 4HT-stamoplossing (1:400 verdunning), 0,2-0,5 μL methacroleïne (1:400-1:1.000 verdunning, afhankelijk van het weefseltype; gebruik in het algemeen een verdunning van 1:1.000 voor paraformaldehyde [PFA]-vaste monsters en 1:400 voor klinische FFPE-monsters), 2 μL 10% TEMED-stamoplossing (1:100 verdunning), en 5 μL 10% A.P.S. stockoplossing (1:40 verdunning).
- Verwijder de overtollige oplossing uit het weefselgedeelte en plaats de dia in een petrischaal. Voeg alle vers bereide, koude geleeroplossing toe aan het monster en incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij 4 °C op het weefsel om diffusie in het weefsel mogelijk te maken.
- Plaats een tweede ongecoate glasplaat voorzichtig over het weefsel en de geloplossing. Luchtbellen moeten worden vermeden (figuur 2B).
OPMERKING: Als luchtbellen vast komen te zitten boven het weefsel, kan het glazen deksel voorzichtig worden opgetild en weer naar beneden worden geplaatst. Bovendien kan elke monomeeroplossing die uitlekt na polymerisatie worden afgesneden en geen problemen voor het weefsel veroorzaken. - Zorg ervoor dat de polymerisatie is voltooid. Deze polymerisatie kan op twee manieren worden uitgevoerd, elk met vergelijkbare resultaten. Incubeer de monsters eerst bij 37 °C in een bevochtigde omgeving (zoals een gesloten petrischaaltje met een vochtige papieren handdoek) gedurende een nacht. Als alternatief, voor een snellere polymerisatie, incubeer de monsters in de bevochtigde atmosfeer gedurende 2 uur bij 37 ° C gevolgd door 1 uur bij 60 ° C.
5. Monstervertering en weefselexpansie
OPMERKING: Dit protocol is geschikt voor alle weefseltypen.
- Draag oogbescherming en schuif een scheermesje tussen de twee glazen dia's van de geleerkamer om ze te scheiden.
OPMERKING: De glasplaten moeten heel gemakkelijk kunnen worden gescheiden. Als verschillende delen van de gel op beide dia's zijn geplakt, kan een penseel worden gebruikt om de gel naar de ene of de andere te leiden. Als de gel bijzonder droog is geworden tijdens polymerisatie, kan 1x PBS worden aangebracht op de buitenkant van de gelkamer, maar dompel de gel niet volledig onder, omdat dit ervoor zorgt dat deze uitzet voordat het weefsel wordt gehomogeniseerd, wat zal resulteren in scheuren. - Knip de blanco gel rond het weefsel om het volume te minimaliseren. Door de gel asymmetrisch te snijden, kan de oriëntatie van de gel na homogenisatie worden gevolgd, omdat het monster volledig transparant is.
- Til de weefselbevattende gel voorzichtig van de dia met een scheermesje en breng deze voorzichtig over in een centrifugebuis van 2 ml met een penseel.
- Vul de buis tot aan de bovenkant met homogenisatiebuffer (tabel 2) voorverwarmd tot 80 °C.
- Incubeer het monster met schudden bij 80 °C gedurende 8 uur (voor PFA-gefixeerde muizenhersenen) of 60 uur (de meeste klinische FFPE-monsters; zie tabel 3).
OPMERKING: De homogenisatietijd is afhankelijk van het weefseltype en de fixatiemethode. Veel van deze voorwaarden zijn al gevalideerd, maar voor anderen kan optimalisatie nodig zijn. - Giet de inhoud van de centrifugebuis in een enkele put van een 6-well plastic celkweekplaat.
- Verwijder de denaturatiebuffer met een transferpipet.
- Om het resterende SDS volledig uit de hydrogel te verwijderen, wast u het monster als volgt in een 1% niet-ionische oppervlakteactieve stof (C12E 10)-oplossing: ten minste driemaal gedurende10 minuten telkens bij kamertemperatuur; gedurende 60 minuten bij 60 °C; en dan nog eens drie wasbeurten gedurende 10 minuten telkens op kamertemperatuur.
- Bewaar het monster in 1x PBS + 0,02% natriumazide bij 4 °C totdat na expansiekleuring en beeldvorming moeten worden uitgevoerd.
OPMERKING: Op dit punt moet het monster ~ 3-4,5 keer groter zijn in elke dimensie, afhankelijk van het weefseltype.
6. Post-expansie biomolecuul profilering
- Antilichaamkleuring
OPMERKING: Dit volgt een typisch immunofluorescentie (IF) / immunohistochemie (I.H.C.) kleuringsprotocol. De gebruikte hoeveelheden primaire en secundaire antilichamen zijn afhankelijk van de concentraties die door de fabrikant worden voorgesteld of door optimalisatie voor het specifieke experiment. Individuele buffers kunnen naar goeddunken van de gebruiker worden vervangen.- Was het monster met het monster in een enkel putje van een celkweekplaat met 6 putten de geëxpandeerde monsters drie keer gedurende 10 minuten, telkens in 1x PBS bij R.T., waarbij de vloeistof met een pipet wordt overgebracht.
- Voer een optionele blokkeringsstap uit (bijvoorbeeld 3% runderserumalbumine/0,1% Triton-X100 in 1x PBS) gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C.
- Incubeer met de primaire antilichamen in kleuringsbuffer (bijvoorbeeld 0,1% Triton-X100 1x PBS of 9x PBS/1% TritonX/10 mg/L heparine) 's nachts bij 37 °C. Afhankelijk van de monstergrootte moet 0,5-2 ml de gel voldoende bedekken.
- Was het monster drie keer gedurende ten minste 10 minuten, telkens in 1x PBS op kamertemperatuur.
- Incubeer in de overeenkomstige secundaire antilichamen gedurende 3 uur bij 37 °C in de kleuringsbuffer van uw keuze.
- Was het monster drie keer gedurende ten minste 10 minuten, telkens in 1x PBS op kamertemperatuur.
- NHS-ester pan-eiwitkleuring
- Giet met het monster in een plaat met 6 putten 1-2 ml polyethyleenglycol (PEG 200) op het monster (genoeg om het volledig te bedekken).
OPMERKING: Het weefsel moet krimpen en terugkeren naar de oorspronkelijke pre-expansiegrootte (of er dicht bij). - Kleuring met fluorofoor-geconjugeerde NHS-ester verdund tot 13,3-80 μg / ml gedurende 3 uur bij R.T. in 1-2 ml kleuringsbuffer (bijvoorbeeld 1x PBS, 2x SSC of 100 mM natriumbicarbonaatoplossing).
- Was het monster drie keer gedurende ten minste 10 minuten, telkens in 1x PBS op kamertemperatuur.
- Giet met het monster in een plaat met 6 putten 1-2 ml polyethyleenglycol (PEG 200) op het monster (genoeg om het volledig te bedekken).
- Lipidekleuring
OPMERKING: Post-expansie lipidekleuring is niet effectief op FFPE klinische monsters, omdat lipiden verloren gaan tijdens het fixatieproces.- Was het monster drie keer gedurende ten minste 10 minuten, telkens in 1x PBS op kamertemperatuur.
- Breng een conventionele lipofiele kleurstof (DiO, DiI of DiD) 200-voudig verdund in 2 ml 0,1% TritonX-100 / 1x PBS aan gedurende 72-96 uur bij kamertemperatuur.
- Minstens drie keer wassen met 1x PBS
- Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)
- Plaats gehomogeniseerde gelmonsters in hybridisatiebuffer voorverwarmd tot 60 °C gedurende 30 minuten.
- Bereid de hybridisatiebuffer voor FISH voor: Combineer 2x S.S.C. (300 mM NaCl, 30 mM natriumcitraat, pH 7,0), 10% (v/v) dextransulfaat, 20% (v/v) ethyleencarbonaat en 0,1% (v/v) Tween20.
- Incubeer de gelmonsters met een hybridisatiebuffer met 10 pM (per oligo) FISH-sondes tegen het doelgen (ten minste 20 sondes per 10 kb) bij 45 °C gedurende de nacht.
- Wassen met een strenge wasbuffer (2x S.S.C. en 0,1% Tween20) twee keer gedurende 15 min telkens op 45 °C.
- Was met een strenge wasbuffer nog eens twee keer gedurende 10 minuten, telkens op 37 °C.
- Was tot slot met 1x PBS minstens drie keer gedurende 10 min telkens op kamertemperatuur.
- De monsters zijn klaar voor beeldvorming of opslag in 1x PBS + 0,02% natriumazide bij 4 °C.
- Volledige weefselexpansie en fluorescentiebeeldvorming
OPMERKING: De expansiefactor die met Magnify kan worden bereikt, varieert afhankelijk van het weefseltype en de expansiemethode (een volledige samenvatting is te vinden in tabel 3). Als algemene schatting zal een Magnify-monster echter 3-4,5-voudig uitzetten in 1x PBS, 5-7-voudig in PBS verdund tot 1:50 in ddH 2 Oen 8-11-voudig in ddH2O. De optimale expansiefactor voor beeldvorming hangt af van de behoeften van elk experiment. De expansiefactor is zeer instelbaar, zodat een enkel monster vele malen kan worden uitgebreid en verkleind voor beeldvorming op verschillende schalen.- Verplaats de monsters die 4-voudig zijn uitgebreid in PBS naar een beeldvormingsplaat met een glazen bodem met 6 putten met behulp van een penseel. Verplaats elk monster verder uitgebreid door het in kleinere stukken te snijden of voorzichtig in een grote beeldvormingsplaat met glazen bodem te plaatsen met een dun stuk flexibel plastic.
- Voer fluorescentiebeeldvorming uit met behulp van een conventionele breedveldmicroscoop, een confocale microscoop of een ander beeldvormingssysteem naar keuze. Het verwijderen van overtollige vloeistof rond de gel met een papieren laboratoriumdoek kan gelbeweging tijdens beeldvorming voorkomen. De gels kunnen ook worden geïmmobiliseerd door 0,1% poly-L-lysine op het glasoppervlak aan te brengen voordat ze worden afgebeeld.
OPMERKING: De toepassing van poly-L-lysine maakt de gel volledig onbeweeglijk bij contact. Om deze reden moet erop worden gelet dat de gel op het glas wordt aangebracht zonder te vouwen of uit te rekken. Bovendien mag de gel niet volledig drogen op poly-L-lysine-gecoat glas, omdat dit de verwijdering moeilijk kan maken, en de gel mag niet worden gekrompen in PBS terwijl deze nog steeds aan het glas is bevestigd met poly-L-lysine, omdat dit gel- of weefselschade kan veroorzaken. - Na beeldvorming krimpt u de monsters in 1x PBS met ten minste drie wasbeurten gedurende 10 minuten per keer, omdat het niet wordt aanbevolen om de monsters langdurig in ddH2O op te slaan vanwege de degradatie van het fluorescentiesignaal. In het bijzonder moeten volledig uitgebreide monsters gekleurd met lipofiele kleurstoffen zo dicht mogelijk bij het tijdstip van uitzetting worden afgebeeld om dissociatie van de kleurstof in water te voorkomen.
- Bewaar de monsters in 1x PBS + 0,02% natriumazide bij 4 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als het protocol met succes is voltooid (figuur 1), ziet het monster er na warmtedenaturering helder en vlak uit; Elke vouwing of rimpeling duidt op onvolledige homogenisatie. Een succesvol uitgebreid monster zal 3-4,5-voudig groter zijn dan vóór expansie in 1x PBS en 8-11-voudig groter wanneer volledig uitgebreid in ddH2O. Figuur 3 toont voorbeeldbeelden voor en na de expansie van 5 μm dik FFPE menselijk niermonster verwerkt met behulp van dit protocol en met succes uitgebreid over 8-voudig. Het weefsel werd eerst gekleurd met antilichamen voor ACTN4 samen met DAPI om het nucleaire DNA te visualiseren. Het monster werd vervolgens in beeld gebracht met behulp van een confocale microscoop met een draaiende schijf (figuur 3A). Het weefsel werd behandeld volgens het bovenstaande protocol, inclusief de post-expansiekleuring van dezelfde doelen, en volledig uitgebreid in water (figuur 3B) voordat het opnieuw in beeld werd gebracht. Na warmtedenaturering kunnen ook andere biomoleculen dan eiwitten worden gekleurd en afgebeeld, zoals weergegeven in figuur 4. Lipofiele kleurstoffen kunnen worden toegepast om de cel- en mitochondriale membraanstructuren in het muizenbrein te onthullen (figuur 4A). Bovendien kunnen nucleïnezuren worden afgebeeld via FISH, zoals in het FFPE normale menselijke lymfeklierweefsel weergegeven in figuur 4B, C.
Figuur 5 toont een waarschijnlijke uitkomst als de steekproef niet goed is gehomogeniseerd. Na uitbreiding werd het weefsel gekleurd met antilichamen voor ACTN4 en vimentine, samen met DAPI om het nucleaire DNA en tarwekiemagglutinine (WGA) te visualiseren om de koolhydraten te labelen. Het weefsel werd 3,5-voudig uitgebreid in PBS voordat het in beeld werd gebracht met behulp van een confocale microscoop met draaiende schijf. In één niersectie (figuur 5A,C) is de scheurvrije uitzetting van een glomerulus te zien. In een aparte sectie (figuur 5B,D) zijn scheuren duidelijk te zien in het weefsel.
Afbeelding 1: Schema van de vergrotingsworkflow. De voorbewerking van klinisch gearchiveerde weefselglaasjes wordt eerst uitgevoerd op basis van het opslagformaat. Vrij zwevende paraformaldehyde-vaste secties hoeven alleen in PBS te worden gewassen. De monsters worden vervolgens geïncubeerd in een gelmonomeeroplossing, inclusief methacroleïne om de biomoleculen aan de hydrogel te verankeren. In situ polymerisatie wordt uitgevoerd voorafgaand aan warmtedenaturatie met ureum, SDS en EDTA. De monsters worden vervolgens grondig gewassen en gekleurd met behulp van conventionele immunostainingprotocollen, FISH-protocollen of lipofiele kleurstoffen. De monsters worden vervolgens uitgebreid in zuiver water voordat ze in beeld worden gebracht. Dit cijfer is aangepast van Klimas et al.17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Weefselmonster gelatiekamer . (A) Aan elke kant van het weefsel worden twee afstandhouders, zoals twee stukken #1.0 dekglas, geplaatst voordat de gelmonomeeroplossing bij 4 °C mag diffunderen. Om compressie te voorkomen, moeten de afstandhouders dikker zijn dan de weefselplakken. (B) Een deksel, zoals een tweede glasplaat, wordt gebruikt om het monster te bedekken vóór polymerisatie bij 37 °C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Voorbeeld van pre-expansiebeelden van een menselijke nierweefselsectie. (A) Een opname genomen met 60x vergroting (1,4 NA) vergeleken met (B) een afbeelding van hetzelfde gezichtsveld na expansie met Magnify genomen met 40x vergroting (1,15 NA, expansiefactor: 8,15x). Magenta, DAPI; Geel, ACTN4. De maximale intensiteit van de post-expansiebeelden wordt geprojecteerd over 25 frames. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Alternatieve biomolecuulkleuringsstrategieën met Magnify . (A) (i en iv) NHS-ester pan-eiwitetikettering van volledig uitgebreid hersenweefsel van muizen. (ii en v) Lifofiele kleurstof (DiD) etikettering van hetzelfde hersenweefsel van muizen. iii en vi) De kanalen zijn samengevoegd. (B) DNA FISH met Magnify met behulp van FFPE normaal menselijk lymfeklierweefsel. Uitbreidingsfactor: 3,5x in 1x PBS. Wit, DAPI; Magenta, serine/threonine kinase 1 gen; Blauw, APC / C activator eiwit CDH1 gen; Gele, menselijke satellietsequentie S4. (C) Afzonderlijke kanalen die verband houden met B. Alle beelden werden verkregen met behulp van een draaiende schijf confocale microscoop bij 40x vergroting (1,15 NA). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve resultaten van 5 μm dikke FFPE-niermonsters. (A) Scheurvrije expansie. Wit, DAPI; Geel, vimentin; Cyaan, alfa-actinine 4; Magenta, tarwekiemen agglutinine. (B) Uitgebreide niersectie die scheuren vertoont. Scheurvorming, vervormingen en het verlies van gelabelde doelen kunnen het gevolg zijn van onvoldoende verankering en/of homogenisatie. (C,D) Ingezoomde afbeeldingen van de kadergebieden in respectievelijk A en B. Alle beelden werden verkregen met behulp van een draaiende schijf confocale microscoop bij 10x (A,B; 0,45 NA) of 60x (C,D; 1,2 NA) vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Samenstelling van de gelmonomeeroplossing. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Samenstelling homogenisatiebuffer. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 3: Samenvatting van de methacroleïne- en homogenisatiecondities voor gevalideerde weefsels. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we het Magnify-protocol17, een ExM-variant die meerdere biomoleculen kan vasthouden met een enkel chemisch anker en uitdagende FFPE-klinische monsters tot 11-voudig kan uitbreiden met warmtedenaturatie. De belangrijkste veranderingen in dit protocol die het onderscheiden van andere ExM-protocollen zijn het gebruik van een geherformuleerde gel die mechanisch robuust blijft, zelfs wanneer het volledig is uitgebreid, evenals het gebruik van methacroleïne als het biomolecuulanker. De meest kritieke stappen in dit protocol zijn als volgt: 1) de samenstelling van de uiteindelijke geloplossing; 2) de timing van de gelatiestappen; 3) de opstelling van de gelatiekamer; 4) de parameters voor monsterhomogenisatie; en 5) het voldoende wassen van SDS uit het monster vóór de postexpansiekleuring.
De meest kritische parameter voor dit protocol is de samenstelling van de uiteindelijke geleeroplossing, met name de concentratie van het biomolecuul ankermethacroleïne. Er zijn verschillende methacroleïneconcentraties nodig om verschillende weefseltypen uit te zetten (tabel 3) en er moet voor worden gezorgd dat deze waarde goed is afgestemd op het uit te breiden monster. Oververankering met methacroleïne kan resulteren in een verminderde expansiefactor en een verlies van epitopen die beschikbaar zijn voor post-expansiekleuring, terwijl onderverankering, vooral in FFPE klinische monsters, kan leiden tot weefselscheuren of vervorming. Daarom moet de methacroleïneconcentratie worden geoptimaliseerd voor niet-gevalideerde weefseltypen, hoewel de optimale concentratie waarschijnlijk in de buurt van of binnen het hier gepresenteerde bereik zal vallen. Hoewel we verwachten dat dit protocol zal werken voor de meeste weefseltypen, zelfs voor degenen die we nog niet hebben gevalideerd, is het bekend dat het niet werkt voor monsters die bot bevatten.
Naast methacroleïne kan het gebruik van een onjuiste concentratie van een kritisch gelingrediënt (4HT of TEMED) resulteren in het volledig mislukken van het experiment, hetzij als gevolg van onvolledige of geen geleering (overmatige 4HT) of voortijdige gelatie (overmatige TEMED, verminderde 4HT of het toevoegen van APS vóór de andere componenten). Om voortijdige gelatie te voorkomen, is het ook noodzakelijk om het monster en de gel gedurende 30 minuten op 4 °C te houden en aan lucht te worden blootgesteld en het monster pas af te dekken en bij 37 °C in een bevochtigde kamer te plaatsen nadat het diffusieproces is voltooid.
Bij het construeren van de gelkamer is het van cruciaal belang om afstandhouders tussen de twee ongecoate glasglaasjes op te nemen, vooral voor dikkere weefselsecties zoals PFA-gefixeerde muizenhersenen. Een gebrek aan afstandhouders kan weefselcompressie veroorzaken, wat resulteert in vervormde beelden en onnauwkeurige gegevens.
De homogenisatie van het monster is afhankelijk van de verteringstijd met de digestiebuffer, evenals de temperatuur en samenstelling van de digestiebuffer. Onvoldoende homogenisatie kan vervormingen en verminderde expansiefactoren veroorzaken in vergelijking met de gerapporteerde waarde voor een bepaald weefseltype. Als onvolledige homogenisatie wordt vermoed, kan de verteringstijd worden verlengd, vooral in het geval van dikkere weefsels.
Een eenvoudige maar cruciale stap is het adequaat uitwassen van het SDS uit het monster met een niet-ionische oppervlakteactieve stof (zoals C12E10) na de homogenisatiestap. Eventuele overgebleven SDS kan resulteren in suboptimale of volledig gehinderde antilichaambinding. Gelukkig, als dit wordt vermoed, zal verder wassen en het opnieuw aanbrengen van de antilichamen vaak een bevredigende oplossing zijn.
Het protocol biedt een kosteneffectief alternatief voor de huidige superresolutiebeeldvormings- en elektronenmicroscopietechnieken om nanoschaalstructuren in verschillende weefselmonsters te ondervragen, waaronder in klinische FFPE-monsters. Het gebruik van methacroleïne en warmte-denaturatie maakt het mogelijk om na expansie biomoleculen te profileren die tijdens weefselfixatie worden bewaard (dit sluit bijvoorbeeld de beeldvorming van lipiden in FFPE-monsters uit). Ons protocol, als uitbreiding van het ExM-framework, is modulair en waarschijnlijk compatibel met andere technieken zoals optische superresolutiemethoden (STED18, STORM 19) of iteratieve expansiemicroscopie (iExM)15. Deze moeten echter nog worden getest met het gepresenteerde protocol en de grote expansiefactoren kunnen uitdagingen opleveren, vooral met fluorofoorverdunning. Bovendien vereist de grote omvang van de monsters na volledige expansie in water zorg bij het hanteren (hoewel de gel die hier wordt gebruikt veerkrachtiger is dan eerdere ExM-gelformuleringen met een hoge expansiefactor, zoals tienvoudige robuuste expansiemicroscopie (TREx), voor het hanteren van miscues17), en creatieve oplossingen zijn af en toe nodig om deze volledig uitgebreide gels over te brengen en af te beelden. Bijvoorbeeld het gebruik van brede werktuigen zoals een dun vel plastic om de volledig uitgevouwen gels over te brengen in plaats van een penseel, of het gebruik van op maat gemaakte grote beeldvormingsplaten (in onze handen betekent dit lasergesneden of 3D-geprinte platen met grote stukken # 1.5 coverglass aan de onderkant geplakt; deze zijn te zien in de bijbehorende video). Het belangrijkste is dat deze methode de toepasbaarheid van beeldvorming op nanoschaal verbreedt door beeldvorming op nanoschaal van gemeenschappelijke biologische en pathologische monsterpreparaten op conventionele breedveld- of confocale microscopen mogelijk te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren de volgende concurrerende financiële belangen te hebben: Y.Z., A.K., Z.C., en B.R.G. hebben verschillende uitvindingen uitgevonden met betrekking tot Magnify en ExM.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Carnegie Mellon University en de D.S.F. Charitable Foundation (Y.Z. en X.R.), de National Institutes of Health (N.I.H.) Director's New Innovator Award DP2 OD025926-01, en de Kauffman Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
- Hell, S. W.
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S.
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), 165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 4847 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nature Methods. 18, 107-113 (2021).
- White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M.
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Chang, J. -B., et al.
- Park, J., et al. Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP). Science Advances. 7 (46), (2021).
- Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nature Biotechnology. , (2023).
- Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
- Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nature Communications. 11, 3388 (2020).
