Summary
Studien beskriver en enkel, rask og delvis automatisert protokoll for å isolere kjerner av høy kvalitet fra frosne pattedyrvev for nedstrøms enkeltkjerner RNA-sekvensering.
Abstract
Enkeltcelle- og enkeltkjerne-RNA-sekvensering har blitt vanlige laboratorieapplikasjoner på grunn av det vell av transkriptomisk informasjon de gir. Enkelt kjerne RNA-sekvensering, spesielt, er nyttig for å undersøke genuttrykk i vanskelig å dissosiere vev. Videre er denne tilnærmingen også kompatibel med frosset (arkiv) materiale. Her beskriver vi en protokoll for å isolere enkeltkjerner av høy kvalitet fra frosne pattedyrvev for nedstrøms enkelt kjerne-RNA-sekvensering på en delvis automatisert måte ved bruk av kommersielt tilgjengelige instrumenter og reagenser. Spesielt brukes en robotdissosiator til å automatisere og standardisere vevshomogenisering, etterfulgt av en optimalisert kjemisk gradient for å filtrere kjernene. Til slutt teller vi nøyaktig og automatisk kjernene ved hjelp av en automatisert fluorescerende celleteller. Ytelsen til denne protokollen er demonstrert på musehjerne, rottenyre og cynomolguslever og miltvev. Denne protokollen er enkel, rask og lett tilpasningsdyktig til forskjellige pattedyrvev uten å kreve omfattende optimalisering og gir kjerner av god kvalitet for nedstrøms enkeltkjerner RNA-sekvensering.
Introduction
Enkeltcelle (sc) og enkeltkjerne (sn) RNA-sekvensering har blitt vanlige protokoller i molekylær og cellulær biologi på grunn av økt oppløsning av genuttrykk sammenlignet med bulk RNA-sekvensering. Imidlertid er isolering av enkeltcelle- og enkeltkjernepreparater av god kvalitet fra faste vev fortsatt en utfordring og er ofte det hastighetsbegrensende trinnet i sc / sn-RNAseq-eksperimenter. Faktisk har en mengde protokoller blitt utviklet som bruker forskjellige kjemiske og mekaniske prosedyrer for å oppnå celle / kjerner suspensjoner 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Videre spenner strategier for å rydde opp slike preparater fra rusk / klumper, etc., fra strømningssortering til filtrering til vasking. Slike protokoller er ofte manuelle (fører til brukerrelatert variabilitet), kan være tidkrevende (fører til redusert celle / kjerne levedyktighet), og / eller kan kreve tilgang til et flowcytometer for celle / kjernesortering. Denne studien fokuserte på å utvikle en enkel, rask og delvis automatisert isolasjonsprotokoll for enkeltkjerner fra frosne pattedyrvev for nedstrøms RNA-sekvenseringsapplikasjoner. Vi fokuserte spesielt på kjerneisolering i motsetning til celleisolasjon, da det er kompatibelt med bruk av frosne vev, noe som gjør prøveinnsamling / prosessering mer praktisk og muliggjør objektiv batching av prøver, spesielt i tidskurseksperimenter. Videre, selv om nukleærtranskriptomet ikke fullt ut reflekterer det cellulære transkriptomet, har flere studier nå vist at enkeltkjerner RNA-sekvenseringsdata er sammenlignbare med enkeltcelle RNA-sekvenseringsdata for celletypeidentifikasjon, selv om proporsjonene av celletyper kan variere 6,16,17,18,19.
Kjerneisolering består av flere trinn: 1) mekanisk eller kjemisk forstyrrelse av vevet for å frigjøre kjernene, 2) opprydding av rusk og klumper, og 3) nøyaktig telling av kjerner for forberedelse for nedstrøms applikasjoner. I en rekke protokoller innebærer trinn 1 ofte bruk av en Dounce-homogenisator for å forstyrre vevet 3,20. Alternativt kan kjemiske metoder brukes, selv om disse ofte må optimaliseres for forskjellige vev 2,5,6. Vi har erfart at en manuell vevsforstyrrelsesprosedyre er utsatt for operatørassosiert variabilitet, noe som fører til variabel kvalitet og utbytte av kjerner. For å minimere teknisk variabilitet og å ha en mer konsistent og reproduserbar protokoll som fungerer på tvers av vev, ble det utviklet en protokoll som bruker en kommersielt tilgjengelig robotvevsdissosiator21. For trinn 2, selv om bufferutveksling vanligvis er den enkleste måten å vaske kjerner på, vedtok vi bruken av et relativt kort sukrosegradientsentrifugeringstrinn for å få en grundigere fjerning av rusk. For hjernevev spesifikt bruker vi en silikakolloidgradient i stedet for en sukrosegradient for mer effektiv myelinfjerning. Til slutt, for telling, er bruken av et hemocytometer gullstandarden for telling og visuell inspeksjon av kjernene. I vår protokoll kan dette trinnet automatiseres pålitelig ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig automatisert fluorescerende celleteller22. Denne protokollen er testet og er kompatibel med flere frosne pattedyrvev, inkludert hjerne, nyre, milt og lever, fra forskjellige pattedyrarter (rotte, mus og ikke-menneskelig primat) og gir kjerner av god kvalitet for nedstrøms enkeltkjerner RNA-sekvensering med en dråpebasert kommersiell plattform. Protokollen tar omtrent 75 minutter fra vevsforberedelse til starten av RNA-sekvenseringsarbeidsflyten med enkeltkjerner.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført med godkjenning fra den kantonale veterinærmyndigheten i Basel-Stadt i streng overholdelse av de sveitsiske føderale forskriftene om dyrevern eller med godkjenning fra Institutional Animal Care and Use Committee i samsvar med den tyske dyrevelferdsloven.
1. Vev og reagens / instrument forberedelse
- Rengjøring og klargjøring av instrument
- Rengjør benkeplater og pinsett med 70% etanol og RNase dekontamineringsløsning. Forkjøl sentrifugene til 4 °C.
- Forkjøl kjerneisolasjonspatronene i kjøleskapet ved 4 °C i minst 30 minutter.
- Start robotdissosiatoren og slå på kjølingen ved å sette glidebryteren øverst til høyre på skjermen til avkjøling og ved å klikke på den for å starte kjølingen slik at glidebryteren vises oransje. Kontroller at den vedlagte flasken med kjernelagringsreagens (NSR) og NIB-flasken (nuclei isolation buffer) har nok væske igjen og er riktig avkjølt.
- Forbered en isoporskumboks fylt med tørris og forkjølte petriskåler og skalpellblad på tørris.
- Buffer forberedelse
- Klargjør 1,5 M sukroseputeoppløsning (SCS) som vist i tabell 1. Fordel SCS i 500 μL alikoter i 2 ml DNase/RNase-rør for å oppnå fire 500 μL SCS-alikoter per prøve. Oppbevar alikotene på is inntil videre bruk.
- Ved behandling av hjernevev fremstilles i stedet en 18 % kolloidoppløsning av silika som beskrevet i tabell 2 ved å fortynne silikakolloidløsningen i NSR og tilsette RNase-hemmer. Klargjør 3 ml 18% silikakolloid oppløsning per prøve og hold den på is.
2. Vevshomogenisering og kjerneisolasjon
- Ta prøven ut av fryseren på -80 °C og legg den umiddelbart på tørris.
- Skjær prøven på en forkjølt petriskål eller metallplate på tørris med en forkjølt skalpell i et 15-50 mg stykke (hvis det ikke allerede er riktig størrelse). Sørg for å kutte prøven i riktig retning slik at prøven fortsatt er representativ for organstrukturene av interesse.
MERK: Med denne protokollen er 15-50 mg den optimale prøvestørrelsen for kjernefysisk ekstraksjon. For å oppnå et godt utbytte etter oppryddingen anbefales en prøvestørrelse på minst 25 mg. For mindre prøver er spesielle patroner tilgjengelige som er optimalisert for behandling av små innganger med robotdissosiatoren. Små inngangskjerper isolasjonspatroner ble brukt til å dissosiere vevsprøver som veier så lite som 4 mg med tilstrekkelig utbytte for nedstrøms enkeltkjerner RNA-sekvensering. Et eksempel på kjerneutbytte ved bruk av lav inngangspatron fra rottelevervev er vist i tabell 3. - Ta kjerneisolasjonspatronen ut av kjøleskapet, pakk den ut, fjern kvernen og pipetten 15 μL RNasehemmer (40 E/μL) til bunnen av sylinderampullen.
MERK: Under kjerneutvinningen vil robotdissosiatoren legge til NIB og NSR til kassetten til et totalt volum på 3 ml (med lavvolumkjerneekstraksjonsprotokollen). Ved å tilsette 15 μL RNasehemmer (40 E/μL) til sylinderampullen før ekstraksjonen, vil suspensjonen ha den ønskede RNAsehemmerkonsentrasjonen på 0,2 U/μL. - Plasser vevsprøven på bunnen av sylinderampullen ved hjelp av pinsett. Ikke plasser prøven nøyaktig i midten av sylinderampullen for å oppnå optimal avbruddseffektivitet.
- Velg Kjør en protokoll på instrumentet og klikk på Nuclei-alternativet i øvre venstre hjørne.
- Fra menyen velger du Low Volume Nuclei Isolation-protokollen og bekrefter at avbruddshastigheten er satt til rask ved å klikke på Endre. Legg kassetten på instrumentet ved å åpne døren og skyve ut scenen ved å løfte den røde knappen.
- Sett kassetten inn på angitt sted, drei kassettlåsen og skyv inn trinnet til den røde knappen klikker på plass. Lukk døren og start kjerneekstraksjonskjøringen på instrumentet ved å klikke på Neste. Løpeturen varer ca 7 min.
- Når løpet er ferdig, fjerner du kassetten fra instrumentet ved å løfte den røde knappen og trekke ut scenen. Legg umiddelbart sylinderampullen på is.
- For alle vev unntatt hjernen, gå videre til trinn 3.1. For hjerneprøver, gå direkte til trinn 3.2.
3. Opprydding av kjerner
- Sukrose gradient opprydding
MERK: For hjernevev, hopp over dette trinnet og gå direkte til trinn 3.2. Alle oppryddingstrinnene utføres på is for å minimere RNA-nedbrytning. Buffere og rør samt sentrifuger må forkjøles. Alle trinn for resuspensjon og blanding utføres kun ved forsiktig pipettering, da virveldannelse kan kompromittere kvaliteten og integriteten til kjernene.- Stikk forsiktig hull på den runde folien på dissosiatorkassetten med en pipettespiss.
MERK: Etter dissosiasjon har den resulterende kjernesuspensjonen et omtrentlig volum på 2 ml. For å lette opprydding av sukrosegradient, del kjernesuspensjonen i to 900 μL-alikoter, noe som resulterer i et totalt volum på 1,8 ml kjernesuspensjon som brukes under opprydding. - Fjern den første 900 μL alikoten av kjernesuspensjonen fra kassetten og tilsett den til en 500 μL SCS-alikot som tidligere er tilberedt i et 2 ml rør. Bland godt ved pipettering til blandingen er homogen.
- Fjern 1400 μL av kjernesuspensjon - SCS-blanding og legg den forsiktig på en ny 500 μL SCS-alikot ved å holde røret i vinkel og tilsette blandingen dråpevis, noe som skaper en tydelig synlig faseseparasjon (se figur 1A).
- Lukk forsiktig røret og legg det tilbake på is uten å forstyrre faseseparasjonen.
- Gjenta trinn 3.1.2-3.1.4 med den andre 900 μL alikoten med suspensjon og en ny SCS-alikot for å ha to 2 ml rør per prøve med en tydelig synlig faseseparasjon for gradientsentrifugering.
- Tilsett rørene forsiktig i en forkjølt sentrifuge og sentrifugerer ved 13 000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
- I mellomtiden forbereder du NSR beskrevet i tabell 4 ved å legge til RNase-hemmeren til en alikot av NSR. Klargjør 1 ml NSR per prøve.
MERK: På dette tidspunktet kan enkeltcellegenuttrykksreagensgelperlene fjernes fra fryseren på -80 °C, slik at de kan balanseres til romtemperatur (RT), og malbryteren kan resuspenderes i lav TE-buffer. - Etter sentrifugering, fjern supernatanten fra begge rørene uten å forstyrre pelleten og resuspender pelleten forsiktig i 50 μL iskald NSR i henhold til produsentens anbefaling. Samle de to pelletsene av samme prøve i et nytt 1,5 ml rør og tilsett 900 μL iskald NSR til et totalt volum på 1 ml. Bland godt ved pipettering.
- Sentrifuger prøven ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C med en svingbøtte rotorsentrifuge.
MERK: Det anbefales sterkt å bruke en svingende bøtte rotor for å minimere kjernetap, spesielt når kjerneutbyttet forventes å være lavt eller når du starter med små mengder vev. - I mellomtiden skal du forberede 500 μL per prøve med 1x PBS (uten Ca2+ og Mg2+) med 0,04 % bovint serumalbumin (BSA) og 0,2 U/μL RNasehemmer som beskrevet i tabell 5.
- Fjern forsiktig supernatanten uten å kaste pelleten og resuspender pelleten i 100 mikrol PBS-oppløsning som tilberedt ovenfor (1x PBS + 0,04 % BSA + RNasehemmer ved 0,2 E/μl).
MERK: For små vevsprøver kan kjernekonsentrasjonen være lav, og det anbefales derfor å resuspendere pelleten i bare 50 μL PBS-løsning for å sikre tilstrekkelig høye konsentrasjoner for enkeltkjerner RNA-sekvensering. - Gå videre til trinn 4.
- Stikk forsiktig hull på den runde folien på dissosiatorkassetten med en pipettespiss.
- Opprydding av silikakolloid gradient
MERK: For hjernevev er en silikakolloidgradient mer egnet enn en sukrosegradient for å fjerne myelin og rusk fra kjernesuspensjonen. Alle oppryddingstrinnene utføres på is for å minimere RNA-nedbrytning. Buffere og rør, samt sentrifuger, må forkjøles. Alle trinn for resuspensjon og blanding utføres kun ved forsiktig pipettering, da virveldannelse kan kompromittere kvaliteten og integriteten til kjernene.- Stikk forsiktig hull på den runde folien på dissosiatorkassetten med en pipettespiss.
- Fjern kjernesuspensjonen fra kassetten og legg den til et 5 ml rør.
- Sentrifuge ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C i en forkjølt sentrifuge.
- Fjern forsiktig supernatanten uten å forstyrre pelleten og resuspender pelleten i 1 ml iskald 18% silikakolloidoppløsning.
- Tilsett ytterligere 2 ml 18% silikakolloidoppløsning for å ha et totalt volum på 3 ml og bland godt ved pipettering.
- Sentrifuger prøven ved 700 x g i 5 minutter ved 4 °C i en svingbøtte rotor med bremsen satt av.
- I mellomtiden forbereder du NSR beskrevet i tabell 4 ved å legge til RNase-hemmeren til en alikot av NSR. Klargjør 1 ml NSR per prøve.
MERK: På dette tidspunktet kan enkeltcellegenuttrykksreagensgelperlene fjernes fra fryseren på -80 °C, slik at den kan balanseres til RT og malbryteren oligo kan resuspenderes i lav TE-buffer. - Fjern prøven forsiktig fra sentrifugen uten å forstyrre myelinlaget som flyter på toppen.
- Fjern først myelinlaget fra toppen og kast; Fjern deretter forsiktig hele supernatanten uten å forstyrre pelleten.
MERK: Myelinlaget kan enkelt fjernes ved å pakke en steril lofri våtserviett rundt en 1 ml pipettespiss for å aspirere myelinlaget sammen med 1-2 ml av supernatanten. - Oppløs pelleten i 1 ml iskald NSR i henhold til produsentens anbefaling.
- Sentrifuger prøven ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C i en sentrifuge med en svingbøtte rotor.
MERK: Det anbefales sterkt å bruke en svingende bøtte rotor for å minimere kjernetap, spesielt når kjerneutbyttet forventes å være lavt eller når du starter med små mengder vev. - I mellomtiden skal du forberede 500 μL per prøve med 1x PBS (uten Ca2+ og Mg2+) med 0,04 % bovint serumalbumin (BSA) og 0,2 U/μL RNasehemmer som beskrevet i tabell 5.
- Fjern supernatanten forsiktig uten å forstyrre pelleten og resuspender prøven i 100 mikrol PBS-oppløsning som fremstilt ovenfor (1x PBS + 0,04 % BSA + RNasehemmer ved 0,2 E/μl).
MERK: For små vevsprøver kan kjernekonsentrasjonen være lav, og det anbefales derfor å resuspendere pelleten i bare 50 μL PBS-løsning for å sikre tilstrekkelig høye konsentrasjoner for enkeltkjerner RNA-sekvensering.
4. Opptelling
- For hver prøve som skal telles, fortynn 10 μL kjernesuspensjon i 20 mikrol PBS-oppløsning for å oppnå en 1:3-fortynning.
- For telling, tilsett 25 μL propidiumjodid (PI) fargeløsning til en blandebrønn på den fluorescerende telleplaten. Tilsett 25 μL av den fortynnede kjernesuspensjonen og bland godt ved pipettering. Overfør den 50 μL fargede prøven fra blandebrønnen til lastebrønnen.
- Legg telleplaten på celletelleren og start tellingen.
MERK: Kjerneantallet hentes fra den røde fluorescerende kanalen med en eksponeringstid på 700 ms. Denne kanalen ble optimalisert for å få en nøyaktig kjernetelling ved å krysssammenligne med manuell telling med et Neubauer-kammer og Trypan Blue-farging under mikroskopet. Ved høye konsentrasjoner er kjernene svært tett sammen, noe som gjør det vanskelig for programvaren å skille dem. I dette tilfellet anbefales det å telle prøven i en egnet fortynning. Integriteten til kjernene, så vel som renheten, kan vurderes fra det lyse feltbildet eller under et mikroskop. - Fortynn prøvene med PBS (1x PBS + 0,04% BSA + RNase-hemmer ved 0,2 U / μL) til ønsket konsentrasjon for enkeltkjerner RNA-sekvensering.
MERK: Konsentrasjoner mellom 700-1,200 kjerner / μL anses som optimale for enkeltkjerner RNA-sekvensering. Lavere cellekonsentrasjoner, for eksempel 700 kjerner / μL, kan føre til redusert bakgrunnsforurensning fra omgivende RNA.
5. Forberedelse av bibliotek
- Utfør enkeltkjerner RNA-sekvensering med enkeltcellegenuttrykksreagensene ved hjelp av produsentens protokoll rettet mot en kjerneutvinning på 8000-10.000 kjerner per prøve.
6. Sekvens av handlinger
- Sekvenser bibliotekene med ønsket sekvenseringsdybde med sammenkoblet, dobbel indeksering, og følgende sekvensering leser: Les 1: 28 sykluser, i7 Indeks: 10 sykluser, i5 Indeks: 10 sykluser og Les 2: 90 sykluser.
Representative Results
Ytelsen og allsidigheten til denne protokollen er demonstrert ved å utføre enkeltkjerner RNA-sekvensering på ferskt frosset hjerneoccipitalt cortexvev fra tre B6-mus, ferskt frosset tverrgående kuttet nyrevev fra tre Wistar-rotter, arkiv (11 år gammel) lever og miltvev fra tre mauritiske cynomolgsmakaker. Alle dyrene var ikke-perfunderte.
Som vist i figur 1B,C ble det oppnådd kjerner av god kvalitet som var fri for tegn på blebbing, rusk og klumping. Den sukrosegradientbaserte filtreringen ble optimalisert for å fjerne flertallet av rusk ved å teste forskjellige tettheter, spinnhastigheter og tider, og vurdere kjernefysisk renhet / integritet under et mikroskop, samt vurdere kjernestørrelsesfordeling og utbytte (figur 1D). Dette tillot oss å velge en sukrose gradienttetthet på 1,5 M og å bruke en kort spinntid på 15 min. For å vurdere kvaliteten på kjernene ytterligere, ble dataene forhåndsbehandlet ved hjelp av 10X Cell Ranger, og videre nedstrøms dataanalyse ble utført ved hjelp av Besca23. Kjerner med >5% prosent mitokondrieinnhold (da disse har en tendens til å være skadede/stressede kjerner) ble filtrert ut, og kjerner med 500-7000 gener (for å minimere tomme dråper og multipler) ble beholdt. Vi inkluderte bare gener som fantes i minst 30 kjerner. Vi målrettet 8,000 kjerner per hjernebarkprøve og 10,000 kjerner per nyre-, lever- og miltprøve. Etter filtrering ble det oppnådd 10.644 høykvalitetskjerner fra de tre hjerneprøvene, 14.960 høykvalitetskjerner fra de tre nyreprøvene, 18.795 høykvalitetskjerner fra de tre leverprøvene og 13.882 høykvalitetskjerner fra de tre miltprøvene. Figur 2A, D, G, J viser fiolinplott som representerer fordelingen av UMI-tall, gentall og mitokondrielt innhold i hver prøve. Median antall tellinger på tvers av alle hjerneprøver var 7,563 UMI / kjerne og 3,208 gener / kjerne. Median antall tellinger på tvers av alle nyreprøver var 3,841 UMI / kjerne og 1,915 gener / kjerne. Median antall tellinger på tvers av alle leverprøver var 2,649 UMI / kjerner og 1,676 gener / kjerner. Median antall tellinger på tvers av alle miltprøver var 1,609 UMI / kjerner og 1,138 gener / kjerner. Vi genererte deretter klynger ved hjelp av svært variable gener og kommenterte dem ved hjelp av kjente markørgener 17,24,25,26. Som vist i figur 2B, E, H, K, var vi i stand til å identifisere de forventede celletyper fra hvert vev. Videre, som vist i figur 2B, E, H, K, bidro alle dyr til alle klynger, noe som indikerer generelt lav teknisk variabilitet introdusert av protokollen. Videre var celleproporsjonene sammenlignbare i alle tre prøvene per vevstype, det samme var UMI og gentall (figur 2A, C, D, F, G, I, J, L). Et bemerkelsesverdig unntak er leveren, hvor hepatocyttpopulasjonene blant de tre leverprøvene var forskjellige i proporsjoner og profil. Dette skyldes mest sannsynlig biologiske forskjeller mellom dyrene (kjønn, alder, metabolsk status).
Figur 1: Vurdering av kjernekvalitet og optimalisering av sukrosegradient . (A) Den forventede faseseparasjonen under sukrosegradientsentrifugering vises med en pil. (B) Representative fluorescerende bilder av propidiumjodidfarget rottenyre (øverst) og cynomolgmilt (nederst) kjerner oppnådd med protokollen. (C) Representative lysfeltmikroskopibilder av kjerner isolert fra muselever (øverst) og musehjerne (nederst), skalastang 500 μm. Legg merke til den vanlige glatte overflaten av kjerner som indikerer god kjernefysisk kvalitet. (D) Sukrose gradient optimalisering. Flere sukrosetettheter, spinnhastigheter og spinntider ble testet. Lysfeltmikroskopibilder av kjerner, kjernestørrelsesfordeling og kjerneutbytte vises for hver tilstand. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative data fra snRNAseq på mus hjerne occipital cortex, rotte nyre (cortex og medulla), og cynomolgus macaque lever og milt. (A) Fiolinplott som viser fordelingen av gener/kjerne, UMI/kjerne og prosent mitokondrieinnhold per hjerneprøve. (B) Venstre panel: UMAP-plott som viser bidraget fra hver prøve til klyngene identifisert i hjernen. Høyre panel: UMAP som viser identiteten til klyngene kommentert basert på markørgener i hjernevev. (C) Cellulære proporsjoner observert i de 3 hjerneprøvene. (D) Fiolinplott som viser fordelingen av gener/kjerne, UMI/kjerne og prosent mitokondrieinnhold per nyreprøve. (E) Venstre panel: UMAP-plott som viser bidraget fra hver prøve til klyngene identifisert i nyrene. Høyre panel: UMAP som viser identiteten til klyngene kommentert basert på markørgener i nyrevev. (F) Cellulære proporsjoner observert i de 3 nyreprøvene. (G) Fiolinplott som viser fordelingen av gener/kjerne, UMI/kjerne og prosent mitokondrieinnhold per leverprøve. (H) Venstre panel: UMAP-plott som viser bidraget fra hver prøve til klyngene identifisert i leveren. Høyre panel: UMAP som viser identiteten til klyngene kommentert basert på markørgener i levervev. (I) Cellulære proporsjoner observert i de 3 leverprøvene. (J) Fiolinplott som viser fordelingen av gener/kjerne, UMI/kjerne og prosent mitokondrieinnhold per miltprøve. (K) Venstre panel: UMAP-plott som viser bidraget fra hver prøve til klyngene identifisert i milten. Høyre panel: UMAP som viser identiteten til klyngene kommentert basert på markørgener i miltvev. (L) Cellulære proporsjoner observert i de 3 miltprøvene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Komponenter | Konsentrasjon av aksjer | Volum per prøve | Endelig konsentrasjon |
| Sukrose pute løsning | 2 M | 1500 μL | 1,5 M |
| Sukrose pute buffer | - | 500 μL | - |
| Dithiothreitol (DTT) | 1 M | 2 μL | 1 mM |
| RNAse-hemmer | 40 U/μL | 10 μL | 0,2 E/μL |
Tabell 1: Tilberedning av 1,5 M sukroseputeløsning (SCS). Denne løsningen brukes til sentrifugeringen av sukrosegradienten under oppryddingen i trinn 3.1 og bør tilberedes på nytt hver gang før protokollen startes. Hold alltid SCS på is under protokollen. Løsningene som er nevnt i denne tabellen, refereres til i materialfortegnelsen.
| Komponenter | Konsentrasjon av aksjer | Volum per prøve | Endelig konsentrasjon |
| Silica kolloid stamløsning | 90% | 600 μL | 18% |
| Kjernelagringsreagens (S2-genomikk) | - | 2400 μL | - |
| RNAse-hemmer | 40 U/μL | 15 μL | 0,2 E/μL |
Tabell 2: Fremstilling av 18% silikakolloidoppløsning. Denne løsningen brukes til sentrifugering av silikakolloid gradient under opprydding i trinn 3.2 og bør tilberedes på nytt hver gang før protokollen startes. Hold alltid 18% silikakolloidoppløsningen på is under protokollen.
| Vev | Vekt på prøve | Patron | Utbytte |
| Rottelever | 25 mg | Kjerner isolasjon kassett | 65 000 kjerner per mg vev |
| Rottelever | 4 mg | Isolasjonskassett med små inngangskjerper | 32 000 kjerner per mg vev |
Tabell 3: Kjerneutbytte fra isolasjonspatronen med lav inngangskassett kontra kjerneisolasjonspatronen etter opprydding av sukrosegradient.
| Komponenter | Konsentrasjon av aksjer | Volum per prøve | Endelig konsentrasjon |
| Kjerner lagring reagens | - | 1000 μL | - |
| RNAse-hemmer | 40 U/μL | 5 μL | 0,2 E/μL |
Tabell 4: Fremstilling av kjernelagringsreagens (NSR). Denne løsningen brukes under kjerneisolering i trinn 3-5 samt under oppryddingen i trinn 3.1.8. Den kan oppbevares ved 4 °C i opptil 4 måneder. Forbered en fersk alikot med RNase-hemmer under sentrifugeringstrinnet i oppryddingstrinn 6. Løsningene som er nevnt i denne tabellen, refereres til i materialfortegnelsen.
| 1x PBS + 0,04% BSA-lagerløsning | |||
| Komponenter | Konsentrasjon av aksjer | Volum for lager | Endelig konsentrasjon |
| PBS (ingen Ca 2+, ingen Mg2+) | 1x | 30 ml | - |
| Bovint serumalbumin (BSA) | 30% | 40 μL | 0.04% |
| 1x PBS + 0,04% BSA + 0,2 U/μL RNAse-hemmer | |||
| Komponenter | Konsentrasjon av aksjer | Volum per prøve | Endelig konsentrasjon |
| 1x PBS + 0,04% BSA-aksjeløsning | - | 500 μL | - |
| RNAse-hemmer | 40 U/μL | 2,5 μL | 0,2 E/μL |
Tabell 5: Tilberedning av PBS + 0,04% BSA. Denne løsningen brukes på slutten av oppryddingen i trinn 3.1.10 og etter telling for å fortynne kjernesuspensjonen til ønsket konsentrasjon for 10X enkeltkjerner RNA-sekvensering (teller trinn 4.4). Stamløsningen kan oppbevares ved 4 °C i opptil 1 måned. Forbered en fersk alikot med RNase-hemmer under sentrifugeringstrinnet i oppryddingstrinn 6.
Discussion
Vi har utviklet en allsidig og delvis automatisert protokoll for å oppnå enkeltkjerner av høy kvalitet fra frosne pattedyrvev og demonstrert protokollen på musehjerne, rottenyre og cynomolglever og miltvev.
Når vi sammenligner ytelsen til denne protokollen med andre publiserte protokoller for RNA-sekvensering med enkeltkjerne i hjerne-, nyre-, milt- og levervev 6,7,20,24,25,26, observerer vi at vi er i stand til å oppdage et tilsvarende antall gener og UMI-teller per kjerne og er i stand til å gjenopprette de forventede celletypene. Sammenlignet med eksisterende metoder er det flere fordeler med denne protokollen. For det første automatiserer protokollen i denne studien vevshomogenisering og isolering av enkeltkjerner. Dette oppnås ved bruk av en robotvevsforstyrrer21. I de fleste protokoller homogeniseres vev med en Dounce-homogenisator for å frigjøre enkeltkjerner 3,20. Vi har imidlertid lagt merke til at dette manuelle trinnet kan føre til eksperimentell variabilitet i kjerneutbytte og integritet avhengig av mengden kraft som utøves under homogenisering, noe som kompromitterer reproduserbarheten av forsøkene. Her, ved å bruke en automatisert vevskvern med faste innstillinger, ble det oppnådd god kjernekvalitet og utbytte med større konsistens på tvers av eksperimenter. Videre reduserer automatisering av dette trinnet også protokollens praktiske tid (vevsforstyrrelsestrinnet tar omtrent 7 minutter), slik at brukeren kan forberede seg på de påfølgende trinnene. For det andre er protokollen beskrevet i denne studien allsidig, det vil si at den er kompatibel med forskjellige vev fra forskjellige arter. Dette gjør at vi kan unngå langvarig protokolloptimalisering, for eksempel for å identifisere homogeniseringsbuffere / vaskemidler for forskjellige vev 2,5,6. For det tredje er denne protokollen ikke avhengig av tilgang til en strømningssorterer for å oppnå rene kjerner, og gjør den dermed mer tilgjengelig for laboratorier som ikke har nødvendig utstyr/kompetanse for strømningssortering. I stedet optimaliserte vi den sukrosegradientbaserte filtreringen for å fjerne det meste av rusk. For hjernevev anbefales det imidlertid å bruke en silikakolloidgradient i stedet for en sukrosegradient for mer effektiv myelinfjerning. Vi har også funnet at bruken av en svingende bøtte rotor på slutten av sukrose / silica kolloid gradient sentrifugering trinn minimerer kjerner tap. Derfor anbefales bruk av en slik rotor på det sterkeste. For det fjerde, etter å ha testet flere metoder for å telle kjerner (manuell telling under mikroskopet, bruk av flere automatiserte tellere), anbefales bruk av en automatisert fluorescerende celleteller22. Bruken av et DNA-interkalerende fargestoff, slik som propidiumjodid, øker nøyaktigheten av kjernetelling. For det femte tar denne protokollen omtrent 75 minutter fra start til lasting av mikrofluidbrikken. Dette bidrar til å sikre at kjerneintegriteten forblir høy ved behandling av flere prøver. Til slutt har vi funnet at protokollen også er kompatibel med optimalt skjæretemperaturforbindelse (OCT)-innebygd vev. Ved bruk av slikt materiale kan vevet fjernes fra OCT-blokken ved hjelp av en skalpell før homogenisering.
En hyppig utfordring i enkeltkjerner RNA-sekvenseringsdatasett er tilstedeværelsen av omgivende RNA, som kan være ikke-nukleær (f.eks. mitokondriell) så vel som kjernefysisk avledet27,28. I vår protokoll er mitokondrielt RNA (en proxy for ikke-nukleært omgivende RNA) lav selv før filtrering (0,1-1,6% for vevene vist). Imidlertid, i likhet med andre protokoller og datasett, er omgivende RNA-forurensning fra høyt uttrykte gener i kjernene av rikelig celletyper (som hepatocytter i leveren, nevroner i hjerner, etc.) fortsatt tilstede27. Det finnes flere bioinformatikkverktøy, som CellBender, SoupX, etc., som kan fjerne slik omgivende RNA-forurensning før kjerneannotasjon 29,30,31. En annen begrensning av denne protokollen er at selv om vevsforstyrrelsen og kjerneisolasjonstrinnene er automatiserte, er gjennomstrømningen av dette trinnet fortsatt begrensende ettersom bare én prøve kan behandles om gangen. Men siden dette trinnet bare tar omtrent 7 minutter per stykke vev, kan flere prøver fortsatt behandles i en batch. Vi behandler vanligvis fire prøver per batch, men har gjort opptil seks prøver per batch med gode resultater. Nylige forbedringer i robotdissosiatoren for å tillate parallell behandling av to prøver samtidig, vil muliggjøre behandling av 8-12 prøver per batch, noe som er kompatibelt med gjennomstrømningen av mikrofluidbrikken som brukes til enkeltkjerneinnkapsling.
Selv om vi ikke har brukt kjernene isolert av denne protokollen for andre nedstrømsapplikasjoner som ATAC-seq eller snRNAseq ved bruk av andre plattformer, basert på kvaliteten på data oppnådd med genuttrykksreagensene som brukes her, mener vi at protokollen vår skal være kompatibel med flere nedstrømsapplikasjoner. Imidlertid vil fremtidig arbeid innebære å teste denne protokollen med andre nedstrømsapplikasjoner, for eksempel ATAC-seq.
Avslutningsvis har vi utviklet en rask, enkel og delvis automatisert kjerneisolasjonsprotokoll for nedstrøms enkelt kjerne-RNA-sekvensering som har vist seg å være kompatibel med forskjellige typer frosne pattedyrvev.
Disclosures
Alle forfatterne er/var ansatte hos F. Hoffmann-La Roche under gjennomføringen av studien.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Filip Bochner, Marion Richardson, Petra Staeuble og Matthias Selhausen for å gi dyrevevet som ble analysert i dette manuskriptet. Vi vil også takke Petra Schwalie, Klas Hatje, Roland Schmucki og Martin Ebeling for deres bioinformatikkstøtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M DTT | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| 10x Magnetic Separator | 10x genomics | PN-120250 | |
| 10x Vortex Adapter | 10x genomics | PN-120251 | |
| 1x DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | stored at 4°C |
| 30% Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9576_50ML | |
| 400 mM Tris-HCl, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| 40U/μl RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | Stored at -20 °C |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Cellaca MX High-throughput Automated Cell Counter | Nexcelom Bioscience | CELMXSYSF2 | Automated fluorescent cell counter |
| Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10x genomics | PN-1000127 | Single cell gene expression reagent, stored at room temperature |
| Chromium Next GEM Secondary Holder | 10x genomics | PN-1000195 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns | 10x genomics | PN-1000129 | Single cell gene expression reagent, stored at -80 °C |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns | 10x genomics | PN-1000128 | Single cell gene expression reagent |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Library Kit v3.1 4 rxns | 10x genomics | PN-1000158 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
| Chromium Next GEM Single Cell 3'GEM Kit v3.1 4 rxns | 10x genomics | PN-1000130 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
| Divided Polystyrene Reservoirs | VWR | 41428-958 | |
| DNA LoBind Tubes 1.5ml Eppendorf | Sigma-Aldrich | EP0030108051 | |
| DNA LoBind Tubes 2ml Eppendorf | Sigma-Aldrich | EP0030108078 | |
| Dry ice | - | - | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10x genomics | PN-2000048 | Single cell gene expression reagent, stored at 4 °C |
| Ethanol Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-16 | |
| Heatblock | |||
| High-Throughput Nexcelom Counting Plates | Nexcelom Bioscience | CHM24-A100-001 | Cell counter counting plate |
| Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Mini Centrifuge | - | - | |
| NovaSeq 6000 SP Reagent Kit v1.5 (100 cycles) | Illumina | 2002840 | |
| Nuclei Isolation Buffer | S2 Genomics | 100-063-396 | Stored at 4 °C |
| Nuclei Isolation Cartridge | S2 Genomics | 100-063-287 | Precooled at 4 °C before use |
| Nuclei PURE 2 M Sucrose Cushion Solution | Sigma-Aldrich | NUC201-1KT | Sucrose cushion solution |
| Nuclei PURE Sucrose Cushion Buffer | Sigma-Aldrich | NUC201-1KT | |
| Nuclei Storage Reagent | S2 Genomics | 100-063-405 | Stored at 4 °C |
| PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 30124359 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | Silica colloid solution |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| Refrigerated Centrifuge (Eppendorf 5804R) | Eppendorf | 5805000010 | |
| Refrigerated Centrifuge with Swinging-Bucket Rotor (Eppendorf 5810R) | Eppendorf | 5811000015 | |
| RNAseZap | Ambion | AM9780 | RNAse decontamination solution |
| Round cell culture petri dish | SPL | 330005 | |
| Scalpel disposable | Aesculap AG | BA210 | pre-cooled on dry ice before use |
| Single Index Kit T Set A, 96 rxns | 10x genomics | PN-1000213 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
| Singulator 100 System | S2 Genomics | - | Commercially available robotic tissue dissociator |
| Sodium Hydroxide 1M | Sigma-Aldrich | 72068 | |
| SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | b23318 | |
| Sterile tweezers | - | - | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977049 | |
| ViaStain PI Staining Solution | Nexcelom Bioscience | CS1-0109-5mL | Propidium iodide staining solution |
| Vortex Mixer+A2:D44 | VWR | - |
References
- Burja, B., et al. An Optimized Tissue Dissociation Protocol for Single-Cell RNA Sequencing Analysis of Fresh and Cultured Human Skin Biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 872688 (2022).
- Kimbley, L. M., et al. Comparison of optimized methodologies for isolating nuclei from esophageal tissue. Biotechniques. 72 (3), 104-109 (2022).
- Maitra, M., et al. Extraction of nuclei from archived postmortem tissues for single-nucleus sequencing applications. Nature Protocols. 16 (6), 2788-2801 (2021).
- Nadelmann, E. R., et al. Isolation of nuclei from mammalian cells and tissues for single-nucleus molecular profiling. Current Protocols. 1 (5), e132 (2021).
- Rousselle, T. V., et al. An optimized protocol for single nuclei isolation from clinical biopsies for RNA-seq. Scientific Reports. 12, 9851 (2022).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).
- Leiz, J., et al. Nuclei isolation from adult mouse kidney for single-nucleus RNA-sequencing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (175), 62901 (2021).
- Alvarez, M., et al. Isolation of nuclei from human snap-frozen liver tissue for single-nucleus RNA sequencing. Bio-Protocol. 13 (3), e4601 (2023).
- Ayhan, F., Douglas, C., Lega, B. C., Konopka, G. Nuclei isolation from surgically resected human hippocampus. STAR Protocols. 2 (4), 100844 (2021).
- Joshi, N., Misharin, A. Single-nucleus isolation from frozen human lung tissue for single-nucleus RNA-seq. Protocols.io. , https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.zu8f6zw (2019).
- Martelotto, L. G., Luciano Martelotto, L. 'Frankenstein' protocol for nuclei isolation from fresh and frozen tissue for snRNAseq. Protocols.io. , https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.3fkgjkw (2020).
- Masilionis, I., Chaudhary, O., Chaligne, R., Mazutis, L. Nuclei extraction for single-cell RNAseq from frozen tissue using Singulator™ 100. Protocols.io. , https://www.protocols.io/view/nuclei-extraction-for-single-cell-rnaseq-from-froz-q26g74xzqgwz/v1 (2022).
- Matson, K. J. E., et al. Isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus RNA sequencing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), 58413 (2018).
- Mendelev, N., et al. Multi-omics profiling of single nuclei from frozen archived postmortem human pituitary tissue. STAR Protocols. 3 (2), 101446 (2022).
- Soule, T. G., et al. A protocol for single nucleus RNA-seq from frozen skeletal muscle. Life Science Alliance. 6 (5), e202201806 (2023).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), e0209648 (2018).
- Ding, J., et al. Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods. Nature Biotechnology. 38, 737-746 (2020).
- Hu, P., et al. Single-nucleus transcriptomic survey of cell diversity and functional maturation in postnatal mammalian hearts. Genes & Development. 32 (19-20), 1344-1357 (2018).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7, 6031 (2017).
- Narayanan, A., et al. Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), 61542 (2020).
- Jovanovich, S., et al. Automated processing of solid tissues into single cells or nuclei for genomics and cell biology applications with the Singulator™ 100 and 200 systems. , S2 Genomics, Livermore, CA. https://s2genomics.com/poster-download-automated-processing-of-solid-tissues-into-single-cells-or-nuclei-with-the-singulator-100-system-scrna-seq-and-atac-seq-data-on-human-and-mouse-tissues-agbt-2022 (2022).
- Bell, J., et al. Characterization of a novel high-throughput, high-speed and high-precision plate-based image cytometric cell counting method. Cell & Gene Therapy Insights. 7 (4), 427-447 (2021).
- Madler, S. C., et al. Besca, a single-cell transcriptomics analysis toolkit to accelerate translational research. NAR Genomics and Bioinformatics. 3 (4), lqab102 (2021).
- Wu, H., et al. Mapping the single-cell transcriptomic response of murine diabetic kidney disease to therapies. Cell Metabolism. 34 (7), 1064-1078 (2022).
- Han, L., et al. Cell transcriptomic atlas of the non-human primate Macaca fascicularis. Nature. 604 (7907), 723-731 (2022).
- Madissoon, E., et al. scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation. Genome Biology. 21 (1), 1 (2019).
- Caglayan, E., Liu, Y., Konopka, G. Neuronal ambient RNA contamination causes misinterpreted and masked cell types in brain single-nuclei datasets. Neuron. 110 (24), 4043-4056 (2022).
- Luecken, M. D., Theis, F. J. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Molecular Systems Biology. 15 (6), e8746 (2019).
- Fleming, S. J., et al. Unsupervised removal of systematic background noise from droplet-based single-cell experiments using CellBender. bioRxiv. , (2022).
- Yang, S., et al. Decontamination of ambient RNA in single-cell RNA-seq with DecontX. Genome Biology. 21 (1), 57 (2020).
- Young, M. D., Behjati, S. SoupX removes ambient RNA contamination from droplet-based single-cell RNA sequencing data. Gigascience. 9 (12), giaa151 (2020).
