Summary
Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro facile da seguire per condurre la purificazione dell'RNA poli(A), la conversione del bisolfito e la preparazione della libreria utilizzando apparecchiature standardizzate per un campione biologico di interesse.
Abstract
Le modificazioni post-trascrizionali dell'RNA in vari tipi di trascritti di RNA sono associate a diverse regolazioni dell'RNA nelle cellule eucariotiche. È stato dimostrato che le modificazioni aberranti dell'RNA 5-metilcitosina e l'espressione disregolata delle metiltransferasi dell'RNA sono associate a varie malattie, compresi i tumori. Il sequenziamento del bisolfito a livello di trascrittoma è stato sviluppato per caratterizzare le posizioni e i livelli quantitativi di metilazione della citosina nell'RNA convertito in bisolfito alla risoluzione della coppia di basi. In questo documento, questo protocollo presenta in dettaglio le procedure di due cicli di purificazione del poli(A) RNA, tre cicli di reazione del bisolfito e la preparazione della libreria per consentire la mappatura a livello di trascrittoma dei siti di modificazione dell'mRNA 5-metilcitosina. La valutazione della quantità e della qualità dell'RNA dopo la reazione principale è essenziale per monitorare l'integrità dell'RNA ed è un passaggio fondamentale per garantire librerie di sequenziamento di alta qualità. Idealmente, le procedure possono essere completate entro tre giorni. Con questo protocollo, l'utilizzo di RNA totale di alta qualità come input può praticamente costruire robuste librerie di bisolfito-mRNA per il sequenziamento di nuova generazione dal campione di interesse.
Introduction
Tra oltre 150 tipi di modificazioni post-trascrizionali1, la modificazione della 5-metilcitosina (m5C) è stata identificata in vari tipi di RNA, tra cui l'RNA ribosomiale, l'RNA di trasferimento, l'RNA messaggero, il micro RNA, l'RNA lungo non codificante, l'RNA del vault, l'RNA enhancer e i piccoli RNA specifici del corpo cajal2. L'RNA m 5 C è associato a diversi meccanismi biologici e patologici come la regolazione dello sviluppo delle radici delle piante3, l'espressione genica virale4 e la progressione del cancro5. Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire pipeline semplificate per caratterizzare il profilo di modificazione dell'mRNA m5C a livello di trascrittoma di campioni biologici in diversi stadi di sviluppo o nel contesto della malattia. Il sequenziamento del bisolfito a livello di trascrittoma è stato sviluppato per caratterizzare le posizioni e i livelli quantitativi di metilazione della citosina nell'RNA convertito in bisolfito alla risoluzionedella coppia di basi 6,7,8,9. Ciò è particolarmente utile quando si studia l'associazione dim5C con l'espressione genica e il destino dell'RNA che è coinvolto nei meccanismi di regolazione biologica nelle cellule. Nella cellula di mammifero, ci sono due lettori noti di m 5 C: ALYREF può riconoscere m 5 C nel nucleo e funge da trasportatore da nucleo mRNA a citosol10, mentre YBX1 può riconoscere m5C nel citoplasma e aumentare la stabilizzazione dell'mRNA11. Nelle cellule T CD4+ CD4+ del lupus eritematososistemico sono stati riportati mRNA m5C aberranti correlati alle vie immunitarie 12. Gli studi hanno rivelato un'associazione tra la modificazione dell'mRNA m5C e la modulazione dell'immunità del cancro e la progressione del cancro13,14. Pertanto, la mappatura del profilo di modificazione di m5C sull'mRNA può fornire informazioni cruciali per chiarire il potenziale meccanismo regolatorio.
Per studiare i ruoli funzionali della modificazione dell'RNA m 5 C in determinate condizioni biologiche, gli approcci basati sulla conversione del bisolfito (bsRNA-seq) e sull'arricchimento dell'affinità anticorpale come m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq e 5-Aza-seq possono essere combinati con la piattaforma di sequenziamento ad alto rendimento per fornire un rilevamento efficiente di regioni e sequenze mirate con le modifiche m5C su una scala a livello di trascrittoma15, Ore 16. Il vantaggio di questo protocollo fornisce il panorama completo dell'RNA m 5 C con una risoluzione a base singola, poiché l'approccio basato sull'arricchimento dell'affinità anticorpale si basa sulla disponibilità di anticorpi di alta qualità e potrebbe raggiungere la risoluzionea singolo frammento del paesaggio di metilazione m5C17.
Tutti i campioni di RNA saranno processati con due cicli di arricchimento di mRNA utilizzando perle oligo(dT), tre cicli di reazione con bisolfito e la preparazione della libreria di sequenziamento. Per monitorare la qualità dell'RNA, ogni campione di RNA sarà esaminato mediante elettroforesi su gel capillare prima e dopo le procedure di purificazione dell'mRNA e reazione del bisolfito per valutare la distribuzione dei frammenti. Le librerie purificate saranno esaminate in base alle loro qualità di ampliconi PCR, ai frammenti di distribuzione dimensionale del DNA mediante elettroforesi su gel capillare e alle loro quantità complessive esaminate mediante saggi quantitativi basati su coloranti a fluorescenza prima del sequenziamento. Il sistema può anche essere utilizzato per analizzare un ampio spettro di campioni biologici come prodotti agricoli, virioni isolati, linee cellulari, organismi modello e campioni patologici.
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Protocol
1. Purificazione dell'RNA di poli(A)
NOTA: Utilizzare l'RNA totale trattato con DNasi I ed esaminare la qualità e l'integrità dell'RNA totale mediante valutazione dell'elettroforesi capillare o su gel convenzionale prima di procedere alla purificazione dell'RNA poli(A). I ricercatori dovrebbero essere in grado di identificare le bande ribosomiali dell'rRNA 28S e 18S nel campo ad alto peso molecolare e la banda dell'rRNA 5,8S nel campo a basso peso molecolare senza bande di striscio significative nell'elettroferogramma. Le fasi di purificazione seguono essenzialmente le istruzioni del produttore con piccole modifiche indicate nelle fasi specifiche. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.
- Preparazione
- Riscaldare il reagente, il tampone di lavaggio, le perle di oligo(dT) e il tampone di lisi a temperatura ambiente per 30 minuti prima di eseguire le seguenti procedure.
- Per l'isolamento di RNA arricchito di poli(A), preparare 10-20 μg di un'aliquota di RNA totale di alta qualità come materiale di partenza trasferendo una quantità adeguata di RNA in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL priva di nucleasi. Incubare nel blocco termico a 70 °C per 5 min, quindi tenere in ghiaccio per 2 min.
NOTA: Le quantità di RNA totale come materiale di partenza devono essere opportunamente regolate in base alla quantità desiderata di mRNA e alla natura delle cellule utilizzate. Empiricamente, l'RNA arricchito di poli(A) può rappresentare l'1-5% di abbondanza nell'RNA totale. Un'aliquota di 10 μg di RNA totale di alta qualità dovrebbe fornire RNA arricchito di poli(A) di alta qualità nell'intervallo 100-500 ng per la conversione del bisolfito a valle. - Nel frattempo, risospendere completamente le perle di oligo(dT). Trasferire le quantità necessarie di sospensione di microsfere in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL, quindi posizionare sul magnete per 3 minuti fino a quando le perle magnetiche formano una pallina.
NOTA: Utilizzare 50 μL di microsfere di oligo(dT) per 10 μg di RNA totale in ingresso. Il volume delle perline in questa fase potrebbe essere ulteriormente ottimizzato a seconda delle celle utilizzate. - Rimuovere il surnatante e risospendere le perle di oligo(dT) con quantità uguali (il volume della sospensione di microsfere utilizzate al punto 1.1.3.) di tampone di lisi e posizionarle sul magnete per 3 minuti prima di rimuovere il surnatante.
NOTA: Non asciugare eccessivamente le perline; L'utente deve procedere rapidamente al passaggio 1.2.1.
- Il primo ciclo di purificazione
- Aggiungere il tampone di lisi alla provetta del campione di RNA (rapporto di volume 4:1) e mescolare accuratamente prima di trasferire alle perle di oligo (dT).
NOTA: Se il volume del campione di RNA è di 20 μL, aggiungere 80 μL di tampone di lisi. - Risospendere completamente l'RNA: la miscela tampone di lisi e le microsfere di oligo(dT) pipettano almeno 10 volte.
- Lasciare incubare i campioni con rotazione continua per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Posizionare il campione sul magnete per 5 minuti o fino a quando il surnatante non è limpido; Scartare il surnatante.
- Aggiungere 600 μL di tampone di lavaggio 1 alle perle e mescolare con cura per risospendere le perle.
- Posizionare il tubo sul magnete per 5 minuti o fino a quando il surnatante non è chiaro, gettare il surnatante e ripetere una volta il passaggio di lavaggio 1.2.5.
- Lavare le perline aggiungendo 300 μL di Wash Buffer 2 e risospendere delicatamente le perline.
- Posizionare il tubo sul magnete per 5 minuti o fino a quando il surnatante non è limpido, gettare il surnatante e ripetere una volta il passaggio di lavaggio 1.2.7.
- Aggiungere 30 μL di Tris-HCl (tampone di eluizione) freddo da 10 mM alla provetta del campione e incubare a 70 °C per 5 min.
- Trasferire rapidamente la provetta sul magnete e, quando la sospensione è limpida dopo 20 secondi o più, trasferire il surnatante contenente RNA arricchito di poli(A) eluito nella nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
- Aggiungere il tampone di lisi alla provetta del campione di RNA (rapporto di volume 4:1) e mescolare accuratamente prima di trasferire alle perle di oligo (dT).
- Il secondo ciclo di purificazione
- Aggiungere 120 μL (4 volte il volume del campione eluito) tampone di lisi al campione di RNA eluito e mescolare accuratamente.
- Lavare le perle utilizzate nel primo ciclo di purificazione con una quantità uguale di tampone di lisi come al punto 1.1.4, pipettare 10 volte per risospendere le perle, quindi posizionarle sul magnete per 5 minuti prima di scartare il surnatante.
- Trasferire la miscela di RNA: tampone di lisi sulle microsfere lavate e miscelare accuratamente pipettando almeno 10 volte.
- Incubare il campione con rotazione continua per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Ripetere i passaggi da 1.2.4 a 1.2.8 per rimuovere il sale e altri sottotipi di RNA.
NOTA: Il volume del tampone di lavaggio può essere ridotto a 300 μL di tampone di lavaggio 1 e 150 μL di tampone di lavaggio 2. - Aggiungere 25 μL (volume desiderato) di Tris-HCl (tampone di eluizione) freddo da 10 mM alla provetta del campione e incubare a 70 °C per 5 minuti.
- Trasferire rapidamente la provetta sul magnete e, quando la sospensione è limpida dopo 20 secondi o più, trasferire il surnatante contenente RNA arricchito di poli(A) eluito in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
- Trasferimento di 2,2 μL in provette a 8 strisce per la valutazione della qualità della quantità e della qualità dell'RNA utilizzando saggi ad alta sensibilità dell'RNA.
- Conservare il campione a -20 °C per brevi periodi e a -70 °C per un periodo più lungo.
NOTA: questo può essere un punto di pausa nel protocollo.
2. Conversione del bisolfito
NOTA: Le fasi di centrifugazione sono state tutte eseguite a temperatura ambiente. Le procedure sono essenzialmente eseguite secondo le istruzioni del produttore, ma con un ulteriore passaggio 2.2 per aggiungere la sequenza o le sequenze di mRNA di controllo spike-in prima del passaggio 2.3 della reazione al bisolfito.
- Trasferire 19 μL di campione di RNA arricchito di poli(A) purificato in una provetta da 0,2 mL a 8 strisce.
- Aggiungere 1,0 μL di controllo spike-in, che è esente da qualsiasi modifica al rapporto di quantità 1:10.000 predeterminato (cioè 0,1 ng di mRNA luciferasi: 1 μg di RNA arricchito di poli(A) purificato) nel campione di RNA del passaggio 2.1.
NOTA: La sequenza di controllo spike-in può essere l'RNA luciferasi Firefly, la Renilla luciferasi o la sequenza di RNA trascritta in vitro senza citosine metilate. - Aggiungere 130 μL di reggente di conversione alla provetta e capovolgere delicatamente più volte per una miscelazione accurata.
- Posizionare la provetta nella macchina PCR ed eseguire tre cicli di riscaldamento a 70 °C per 10 minuti, seguiti da un'incubazione a 64 °C per 45 minuti ciascuno e quindi da un ultimo passaggio per raffreddare a 4 °C.
- Posizionare la colonna sulla provetta di raccolta e trasferire 250 μL di tampone legante l'RNA alla colonna.
- Trasferire il campione dal passaggio 2.4 alla colonna dal passaggio 2.5 e pipettare accuratamente.
- Aggiungere 400 μL di etanolo al 95-100% nella colonna, chiudere rapidamente il tappo e capovolgere più volte.
- Centrifugare a 10.000 × g per 30 s a 25 °C ed eliminare il flusso.
- Aggiungere 200 μL di tampone di lavaggio dell'RNA alla colonna.
- Centrifugare a 10.000 × g per 30 s a 25 °C ed eliminare il flusso.
- Aggiungere 200 μL di tampone desolfonazione e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Centrifugare a 10.000 × g per 30 s a 25 °C ed eliminare il flusso.
- Aggiungere 400 μL di tampone di lavaggio dell'RNA e centrifugare a 10.000 × g per 30 s a 25 °C ed eliminare il flusso. Ripeti questo passaggio una volta.
- Centrifugare nuovamente a 10.000 × g per 2 minuti a 25 °C per rimuovere completamente il tampone di lavaggio residuo.
NOTA: L'altra fase di centrifugazione 2.14 per 2 minuti prima dell'eluizione consiste nel rimuovere completamente il tampone di lavaggio. La fase di lavaggio viene eseguita due volte per eliminare il componente ad alto contenuto di sale dal reagente bisolfito e dal tampone di desolfonazione sulla colonna. - Trasferire la colonna in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
- Aggiungere 20-30 μL di H2O senza nucleasi alla colonna e lasciare riposare a temperatura ambiente per 1 minuto.
- Centrifugare a 10.000 × g per 30 s a 25 °C.
- Trasferimento di 2,2 μL in provette a 8 strisce per la valutazione della quantità e della qualità dell'RNA.
- Conservare il campione di RNA trattato con bisolfito a -20 °C per brevi periodi e a -70 °C per un periodo più lungo.
NOTA: questo può essere un punto di pausa nel protocollo.
3. Preparazione della libreria di mRNA trattata con bisolfito
NOTA: Seguire la sezione 4 del protocollo di istruzioni per la preparazione della libreria per l'uso con mRNA purificato o RNA impoverito di rRNA. La prima fase di priming dovrebbe seguire il protocollo FFPE RNA poiché il trattamento con bisolfito frammenta l'RNA. Eseguire ogni passaggio nella cappa a flusso laminare e aggiungere la miscela di reazione su una griglia di raffreddamento ghiacciata.
- Adescamento dell'RNA in ingresso
- Trasferire la quantità desiderata di campione di mRNA trattato con bisolfito in un massimo totale di 5 μL o aggiungere H2O senza nucleasi per un totale di 5 μL.
NOTA: Si raccomanda un minimo di 10 ng di mRNA trattato con bisolfito come input per questo tipo di preparazione della libreria di RNA e per generare la molarità finale del prodotto della libreria 4nM. - Aggiungere 1 μL di primer casuale (lilla) al campione e miscelare mediante pipettaggio.
- Posizionare la provetta del campione nella macchina PCR preimpostata a 65 °C e il coperchio a 105 °C per 5 minuti e tenere a 4 °C.
- Trasferire la quantità desiderata di campione di mRNA trattato con bisolfito in un massimo totale di 5 μL o aggiungere H2O senza nucleasi per un totale di 5 μL.
- Sintesi di cDNA a primo filamento
- Aggiungere 4 μL di tampone per la reazione di sintesi (lillà), 8 μL di reagente per la specificità del filamento (marrone) e 2 μL di miscela di enzimi di sintesi (marrone) al campione, per un volume totale di 20 μL. Miscelare accuratamente pipettando almeno 10 volte e centrifugare rapidamente.
- Posizionare la provetta nella macchina PCR preimpostata a 25 °C per 10 min, 42 °C per 50 min, 70 °C per 15 min e tenere a 4 °C.
NOTA: Per inserti superiori a 200 basi, si consiglia un periodo di incubazione di 42 °C di 50 min; per inserti di dimensioni inferiori a 200 basi, si consiglia un periodo di incubazione di 15 minuti a 42 °C.
- Sintesi di cDNA a secondo filamento
- Aggiungere 8 μL di tampone di reazione di sintesi con miscela dUTP (arancione), 4 μL di miscela di enzimi di sintesi (arancione) e 48 μL di H2O senza nucleasi. Miscelare accuratamente pipettando almeno 10 volte e centrifugare rapidamente.
- Posizionare la provetta nella macchina PCR preimpostata a 16 °C per 1 ora con il coperchio spento o ≤40 °C.
- Purificazione di cDNA a doppio filamento con microsfere di purificazione del DNA
- Preriscaldare le perle di purificazione del DNA 30 minuti prima di eseguire la purificazione e il vortice per risospendere le perle.
- Aggiungere 144 μL di microsfere di purificazione del DNA in sospensione al campione di cDNA del passaggio 3.3.2 e mescolare accuratamente pipettando almeno 10 volte.
- Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Posizionare la provetta su una griglia magnetica per 5 minuti fino a quando la soluzione non è limpida, quindi rimuovere il surnatante e conservare le perle che contengono DNA.
- Aggiungere 200 μL di etanolo all'80% appena prodotto nella provetta con le perle mantenendo il campione sul rack magnetico e incubare a temperatura ambiente per 30 secondi.
- Rimuovere il surnatante e ripetere il passaggio 3.4.5 una volta, ma questa volta rimuovere con cautela tutto il surnatante residuo.
- Asciugare all'aria le perline per 1-5 minuti mantenendo il campione sul magnete.
NOTA: Non asciugare eccessivamente le perline; Il colore dovrebbe essere marrone scuro. - Rimuovere il campione dal rack magnetico ed eluire il DNA aggiungendo 53 μL di tampone 0,1x TE (10 mM Tris-HCl e 1 mM EDTA, pH 8,0) alle microsfere. Mescolare accuratamente pipettando almeno 10 volte e incubare a temperatura ambiente per 2 minuti.
- Posizionare la provetta sulla griglia magnetica per 5 minuti o fino a quando la soluzione non è limpida.
- Trasferire 50 μL di surnatante contenente cDNA a doppio filamento in una nuova provetta a 8 strisce.
NOTA: A questo punto il protocollo può essere interrotto e il campione può essere conservato a -30 °C.
- Preparazione finale della libreria di cDNA
- Aggiungere 7 μL di tampone di reazione di lucidatura (verde) e 3 μL di miscela enzimatica di lucidatura (verde) al campione di cDNA a doppio filamento eluito.
- Miscelare la miscela pipettando 10 volte con un volume di 50 μL senza creare bolle, quindi centrifugare rapidamente il campione.
- Mettere il campione in una macchina PCR e incubare a 20 °C per 30 minuti, 65 °C per 30 minuti e conservare a 4 °C.
- Legatura dell'adattatore
- Diluire l'adattatore (rosso) secondo le istruzioni del produttore.
- Aggiungere al campione 2,5 μL dell'adattatore diluito, 1 μL di potenziatore di legatura (rosso) e 30 μL di Ligation Master Mix (rosso).
- Miscelare la miscela pipettando 10 volte con un'impostazione del volume di 80 μL senza creare bolle, quindi centrifugare rapidamente il campione.
- Porre il campione in una macchina PCR e incubare a 20 °C per 15 minuti.
- Aggiungere 3 μL della miscela di uracile DNA glicosilasi e DNA glicosilasi-liasi endonucleasi VIII (blu) al campione e pipettare accuratamente.
- Rimettere il campione nella macchina PCR e incubare a 37 °C per 15 minuti con il coperchio impostato a 75 °C.
- Purificazione dei cDNA trattati con reazione di legatura
NOTA: A questo scopo è possibile utilizzare la selezione delle dimensioni con le perline SPRIselect o, opzionalmente, con le perline AMpure XP18.- Preriscaldare le perle 30 minuti prima di eseguire la purificazione e il vortice per risospenderle.
- Trasferire 25 μL di microsfere risospese sul campione di cDNA della fase 3.6.6 e miscelare accuratamente pipettando almeno 10 volte.
- Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Posizionare la provetta su una griglia magnetica per 5 minuti fino a quando la soluzione non è limpida, quindi trasferire il surnatante in una nuova provetta da 8 strisce e scartare le perline.
- Aggiungere 10 μL di microsfere risospese al surnatante e miscelare accuratamente pipettando almeno 10 volte.
- Posizionare la provetta su una griglia magnetica per 5 minuti fino a quando la soluzione non è limpida, quindi scartare il surnatante e non disturbare le perle.
- Aggiungere 200 μL di etanolo all'80% appena prodotto nella provetta con le perle mantenendo il campione sul rack magnetico e incubare a temperatura ambiente per 30 secondi.
- Rimuovere il surnatante e ripetere il passaggio 3.7.7 una volta, ma questa volta rimuovere con cautela tutto il surnatante residuo.
- Asciugare le perline all'aria per 1-5 minuti mantenendo il campione sul magnete.
NOTA: Non asciugare eccessivamente le perline; Il colore dovrebbe essere marrone scuro. - Rimuovere il campione dal rack magnetico ed eluire il DNA aggiungendo 17 μL di tampone TE 0,1x alle microsfere. Mescolare accuratamente pipettando almeno 10 volte e incubare a temperatura ambiente per 2 minuti.
- Posizionare la provetta sulla griglia magnetica per 5 minuti fino a quando la soluzione non è limpida.
- Trasferire 15 μL di surnatante, che contiene il dsDNA preparato all'estremità del bersaglio, in una nuova provetta a 8 strisce.
- Arricchimento PCR del DNA legato all'adattatore
- Aggiungere 25 μL di master mix (blu), 5 μL di primer adattatore 5' e 5 μL di primer adattatore 3' al campione di DNA legato all'adattatore. Mescolare accuratamente pipettando almeno 10 volte.
- Posizionare il campione nella macchina PCR ed eseguire l'amplificazione PCR utilizzando i seguenti passaggi: (1) 98 °C per 30 s, (2) 98 °C per 10 s, (3) 65 °C per 75 s, (4) 65 °C per 5 min e (5) mantenere a 4 °C; in cui i passaggi (2) e (3) devono essere ripetuti per un numero di ciclo N+2 in cui N è uguale alla quantità di RNA in ingresso nel manuale di istruzioni. Ciò significa che sono necessari 2 cicli aggiuntivi a causa della selezione delle dimensioni su entrambi i lati dei campioni eseguita nel passaggio 3.7.
NOTA: Ad esempio, 8 ng dell'ingresso di mRNA purificato sarebbero raccomandati con 9-10 cicli di PCR; ma con il cDNA a doppia faccia, selezionato per dimensione e legato nella fase 3.7, il ciclo PCR raccomandato sarebbe di 11-12 cicli.
- Purificazione di librerie amplificate con PCR
- Preriscaldare le perle di purificazione del DNA per 30 minuti prima di eseguire la purificazione e il vortice per risospendere le perle.
- Trasferire 45 μL (0,9x) di microsfere risospese al prodotto PCR della fase 3.8.2 e miscelare accuratamente pipettando almeno 10x.
- Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Posizionare la provetta su una griglia magnetica per 5 minuti fino a quando la soluzione non è limpida, quindi rimuovere il surnatante e conservare le perle che contengono DNA.
- Aggiungere 200 μL di etanolo all'80% appena prodotto nella provetta con le perline, lasciare il campione sul rack magnetico e lasciarlo riposare a temperatura ambiente per 30 secondi.
- Rimuovere il surnatante e ripetere il passaggio 3.9.5 una volta, ma questa volta rimuovere con cautela tutto il surnatante residuo.
- Asciugare le perline all'aria per 1-5 minuti mantenendo il campione sul magnete.
NOTA: Non asciugare eccessivamente le perline; Il colore dovrebbe essere marrone scuro. - Prelevare il campione dal rack magnetico e aggiungere 22 μL di tampone TE 0,1x alle perle per eluire il DNA. Mescolare accuratamente pipettando almeno 10 volte e incubare a temperatura ambiente per 2 minuti.
- Posizionare la provetta sulla griglia magnetica e lasciarla riposare per 5 minuti o fino a quando la soluzione non è limpida a temperatura ambiente.
- Trasferire 20 μL di surnatante in una nuova provetta a 8 strisce.
- Trasferimento di provette da 2,2 μL a 8 strisce per la valutazione della qualità della quantità e della qualità della libreria.
NOTA: La quantità della libreria può essere rilevata anche mediante qPCR (vedere l'Indice dei materiali). - Conservare il campione della libreria bsRNA-seq a -20 °C.
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Representative Results
Una serie di librerie bsRNA-seq da linee cellulari19 sono state generate seguendo le procedure descritte in questo rapporto (Figura 1). Dopo la purificazione totale dell'RNA accompagnata dal trattamento DNase eseguito su campioni di linee cellulari e la qualità controllata mediante elettroforesi su gel e spettrofotometria UV-Vis (A260/A280), il campione di RNA può procedere all'arricchimento di poli(A) RNA. Per determinare se la doppia purificazione potesse rimuovere la maggior parte dell'RNA ribosomiale, l'efficienza di purificazione del poli(A) RNA è stata valutata mediante test di elettroforesi capillare dell'RNA totale in grado di calcolare automaticamente la percentuale di contaminazione dell'rRNA (Figura 2). Dal modello di picco del frammento di RNA e dalla percentuale di contaminazione da rRNA, i campioni di RNA con doppia purificazione hanno infatti mostrato una diminuzione della contaminazione dell'RNA ribosomiale dal 6,5% al 2,2% e dal 2,6% all'1,1% rispettivamente in AsPC-1 e BxPC-3. Con le linee cellulari di cancro al pancreas umano, due cicli di purificazione delle microsfere potrebbero raggiungere una media del 2,8 ± dell'1% di abbondanze di RNA arricchito di poli (A) dai campioni totali di RNA. Pertanto, l'arricchimento di poli(A) RNA mediante perle di oligo(dT) con doppie fasi di purificazione ha ridotto al minimo l'RNA ribosomiale e rappresenta un possibile arricchimento del campione di mRNA per gli esperimenti a valle.
I protocolli di conversione del bisolfito sono stati riportati in diversi studi sulla modificazione dell'RNA 5-metilcitosina (Tabella 1). La reazione del bisolfito può essere eseguita con una miscela di reazione ricostituita dall'utente costituita da bisolfito di sodio al 40% e idrochinone 600 mM nella soluzione acquosa (pH 5.1) a 75 °C per 4 ore10,20,21. In alternativa, un trattamento più rigoroso con bisolfito del campione di RNA può anche essere eseguito con un kit commerciale; che in una serie di studi di altri e dei nostri 6,22,23,24 ha esteso il tempo di reazione del bisolfito a tre cicli di incubazione. Poiché la fase di incubazione a tre cicli converte in modo efficiente la citosina non metilata nel segmento8 dell'rRNA di Escherichia coli 16S trascritto in vitro e strutturalmente più ripiegato, in questo protocollo è stata applicata anche la fase di incubazione a tre cicli.
Con un doppio arricchimento di poli(A) e la conversione del bisolfito a tre cicli, la qualità dell'RNA prima e dopo la reazione è stata valutata mediante elettroforesi capillare. La distribuzione dimensionale dell'RNA dopo il trattamento con bisolfito ha mostrato un picco di ~200-500 nucleotidi a causa della frammentazione causata dalla reazione del bisolfito (Figura 3). Inoltre, il bsRNA frammentato è ideale per la preparazione della libreria senza la necessità di eseguire un'altra fase di frammentazione. Un totale di 8-10 ng di bsRNA come input è stato utilizzato per costruire la libreria secondo questo protocollo utilizzando da 9 a 11 cicli nell'amplificazione PCR finale del DNA legato all'adattatore. L'elettroforesi capillare dell'amplicone ha mostrato una preparazione della libreria abbastanza efficace, con solo una piccola porzione di primer rimanente e nessun picco di sovraamplificazione (Figura 4). Per verificare l'efficienza di conversione in ciascuna libreria di campioni, l'RNA della luciferasi lucciola non metilato come sequenza di controllo spike-in è stato aggiunto al campione prima di condurre il trattamento con bisolfito. Dopo che le letture di sequenziamento si sono allineate alla sequenza di riferimento utilizzando i kit di strumenti meRanTK25, la media di 2.440 (0,006%) delle letture totali è stata mappata sulla sequenza di spike-in e il tasso di conversione C-to-T totale analizzato ha raggiunto una media del 99,81%; lo stato può essere visualizzato in Integrated Genomics Viewer (Figura 5).
Figura 1: Diagramma del flusso di lavoro del sequenziamento dell'mRNA del bisolfito. La pipeline è costituita da tre protocolli principali, tra cui l'arricchimento dell'mRNA, la conversione del bisolfito e la preparazione della libreria. Abbreviazione: bsRNA = mRNA bisolfito; QC. = controllo di qualità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Risultati del controllo di qualità di campioni di RNA arricchiti di poli(A) con elettroforesi capillare. (A) Il profilo rappresentativo dell'elettroforesi capillare dell'RNA totale delle cellule BxPC-3. (B ) I profili rappresentativi di elettroforesi capillare di campioni processati con purificazione oligo(dT) da cellule AsPC-1 e BxPC-3. mRNA E1, eluizione dell'mRNA da purificazione una tantum; mRNA E2, eluizione dell'mRNA da purificazione a due volte. Le stime di contaminazione dell'rRNA sono state calcolate dal sistema operativo di elettroforesi che controlla il test di analisi dell'RNA totale. (C) Il profilo di elettroforesi capillare dei marcatori Ladder è stato ottenuto nella stessa corsa con i campioni presentati nel pannello B. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Valutazione della qualità dei campioni di RNA mediante elettroforesi capillare. I profili rappresentativi dell'elettroforesi capillare di (A) l'RNA totale, (B) l'mRNA arricchito di poli (A) da due volte la purificazione e (C) l'mRNA trattato con bisolfito dalle cellule BxPC-3. Abbreviazioni: B_empty = cellule BxPC-3 trasdotte con vettore vuoto; B_shScr = cellule BxPC-3 trasdotte con le sequenze di scramble. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Valutazione della qualità delle librerie bsRNA-seq. (A-C) Tre serie di profili rappresentativi di elettroforesi capillare di librerie bsRNA-seq costruite amplificate mediante PCR a diversi numeri di ciclo PCR di 9 e 11 cicli utilizzando bsRNA da un set di cellule BxPC-3. La quantità stimata in ingresso dell'RNA trattato con bisolfito è stata determinata mediante un saggio di quantificazione dell'RNA ad alta sensibilità. Un totale di 8, 8,4 e 9,6 ng bsRNA sono stati utilizzati rispettivamente nei campioni ( A ) BxPC-3 mock, ( B) BxPC-3 vuoti e (C) BxPC-3 shN2UN2. Il marcatore ladder raggiunge i picchi a 35 bp e i 10.380 bp rappresentano gli standard interni del limite inferiore e superiore nel profilo di elettroforesi di ciascun campione. Un picco prominente di circa 100 bp e un picco oscuro di circa 127 bp, rispettivamente, indicano i primer PCR (<100 bp) e l'adattatore-dimero (~127 bp), che sono rimasti nell'eluato dopo la pulizia della PCR. Abbreviazioni: BxPC-3 mock = cellule BxPC-3 non trasdotte; BxPC-3 vuote = celle BxPC-3 trasdotte con il controllo vettoriale vuoto; BxPC-3 shN2UN2 = Cellule BxPC-3 trasdotte con i costrutti shNSUN2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: I profili di allineamento della sequenza di ciascuna libreria bsRNA-seq mappata alla sequenza di riferimento spike-in-control. I profili di allineamento rappresentativi delle librerie bsRNA-seq bxPC-3 mock, empty, scramble e shNSUN2 alla sequenza di riferimento di controllo spike-in della luciferasi della lucciola (indicata come gene "Z"); Sono state mostrate 2 regioni rappresentative. Le barre grigie indicano tutte le letture che presentano nucleotidi consenso corrispondenti alla posizione di base indicata rispetto alla sequenza di riferimento. Le barre rosse evidenziano l'identità della timidina (T) nella posizione di base delle letture; le barre blu indicano quelle letture che hanno l'identità della citosina (C) nella posizione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Confronto tra i protocolli di reazione al bisolfito e il tasso di conversione. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
In questo protocollo, è stata ottenuta una pipeline dettagliata di arricchimento di poli(A), conversione di bisolfito e preparazione della libreria utilizzando componenti standardizzati. Ulteriori analisi di sequenziamento hanno fornito l'identificazione dell'mRNA 5-metilcitosina nei campioni di interesse.
Il passaggio critico è la qualità del materiale di partenza, l'RNA totale, poiché la degradazione dell'RNA avrebbe un impatto sul tasso di recupero della purificazione dell'RNA poli(A). Il campione deve essere maneggiato con cura ed evitare la contaminazione da RNasi prima di eseguire la fase di purificazione del poli(A) RNA. Un'altra parte cruciale della procedura è il numero di cicli di PCR nella preparazione della libreria. La decisione del numero di ciclo dipende dalla quantità di mRNA trattato con bisolfito utilizzata per la preparazione della libreria e dall'uso della selezione di una o due dimensioni nella fase precedente alla PCR. I numeri di ciclo adatti per il campione di interesse richiederebbero quindi una prova e la valutazione della distribuzione dimensionale del prodotto PCR mediante elettroforesi capillare per determinare il numero di ciclo ottimale per la stessa linea cellulare o tessuto.
In questo protocollo, sono stati utilizzati due cicli di purificazione di microsfere di oligo(dT) per arricchire e purificare il poli(A) RNA ed eliminare la maggior parte degli RNA ribosomiali e di altri RNA. Esistono altri metodi per rimuovere l'RNA ribosomiale e mantenere altri tipi di RNA nel campione, come la deplezione oligo-based dell'rRNA26. Quindi, la modificazione della 5-metilcitosina presente in altri tipi di RNA può anche essere presa in considerazione ed estendere la comprensione delle caratteristiche della 5-metilcitosina nell'mRNA e in altri RNA.
La reazione del bisolfito è nota per non essere in grado didistinguere m 5 C da altre modificazioni, tra cui la 5-idrossimetilcitosina (hm5C), la 3-metilcitidina (m3C) e la N4-metilcitidina (m4C)27. Tuttavia, il disegno sperimentale che include il knockdown o il knockout della metiltransferasi dell'RNA m 5 C dovrebbe fornire proveinformative di siti m5C regolati ad alta confidenza. Inoltre, la convalida utilizzando metodi diversi, come l'arricchimento basato su anticorpi seguito da sequenziamento o metodi basati su PCR o LC-MS/MS, potrebbe essenzialmente autenticare i siti candidati m5C16. La tecnica emergente del sequenziamento diretto dell'RNA di Nanopore fornisce anche una potenziale identificazione della modifica dell'RNA attraverso l'analisi computazionale del segnale corrente o delle caratteristiche di "errore" chiamate "errore"28,29,30.
Un recente studio di Johnson et al. ha dimostrato che l'aggiunta della fase di frammentazione nei campioni di RNA dei mitocondri dopo tre cicli di conversione del bisolfito ha effettivamente mostrato un tasso di conversione più elevato e ha aumentato la resa del prodotto della libreria di cDNA31. Questo documento ha analizzato in modo specifico il tasso di conversione e legge la qualità mappata sul genoma dei mitocondri, non sul trascrittoma dell'mRNA. Pertanto, l'uso della fase di frammentazione è stato aggiornato nella Tabella 1 per evidenziare se i rapporti pubblicati includevano una fase di frammentazione dell'RNA in modo che i visualizzatori possano facilmente replicare il protocollo. Un altro studio di Zhang et al. ha dimostrato che l'utilizzo di una libreria di RNA senza modifiche trascritta in vitro come controllo negativo è efficiente per eliminare il segnale falso positivo dal trattamento con bisolfito32. Recenti studi hanno messo a confronto diversi protocolli utilizzati per la costruzione di biblioteche33. L'utente può inoltre scegliere di condurre una pipeline bsRNA-seq con o senza un'ulteriore fase di frammentazione e una libreria di RNA senza modifiche trascritta in vitro per personalizzare il flusso di lavoro adatto.
L'identificazione a livello di trascrittoma di m5C da parte di diversi principi potrebbe rafforzare i risultati dei paesaggi di modificazione e fornire una maggiore comprensione dei meccanismi regolatori delle modificazioni dell'RNA in modelli sani o malati.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio Nazionale per la Scienza e la Tecnologia di Taiwan. [NSTC 111-2314-B-006-003]
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System | Agilent, Santa Clara, CA | RNA quality detection | |
| AMpure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | purify DNA |
| Bioanalyzer DNA high sensitivity kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-4626 | DNA quality detection |
| Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-1513 | RNA quality detection |
| DiaMag02 - magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000001 | assist library preparation |
| DiaMag1.5 - magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000003 | assist poly(A) RNA purificaion |
| Dynabeads mRNA DIRECT purification kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 61011 | poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2 |
| Ethanol | J.T.Baker | 64-17-5 | |
| EZ RNA methylation kit | Zymo, Irvine, CA | R5002 | bisulfite treatment |
| Firefly luciferase mRNA | Promega, Madison, WI, USA | L4561 | spike in control seqeunce |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche, Switzerland | KK4824 | library quantification |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Total RNA quantity detection | |
| NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7335S | library preparation |
NEBNext Ultra  Directional RNA Library Prep Kit for Illumina |
New England Biolabs, Ipswich, MA | E7760S | library preparation |
| Nuclease-free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| P2 pipetman | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4641010 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | RNA quantity detection | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32854 | DNA quantity detection |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32852 | RNA quantity detection |
References
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2021 update. Nucleic Acids Research. 50, D231-D235 (2022).
- Bohnsack, K. E., Höbartner, C., Bohnsack, M. T. Eukaryotic 5-methylcytosine (m5C) RNA Methyltransferases: Mechanisms, Cellular Functions, and Links to Disease. Genes. 10 (2), 102 (2019).
- Shinde, H., Dudhate, A., Kadam, U. S., Hong, J. C. RNA methylation in plants: An overview. Frontiers in Plant Science. 14, 1132959 (2023).
- Courtney, D. G., et al. Epitranscriptomic addition of m5C to HIV-1 transcripts regulates viral gene expression. Cell Host & Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).
- Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. RNA. 23 (12), 1754-1769 (2017).
- Legrand, C., et al. Statistically robust methylation calling for whole-transcriptome bisulfite sequencing reveals distinct methylation patterns for mouse RNAs. Genome Research. 27 (9), 1589-1596 (2017).
- Schaefer, M. RNA 5-methylcytosine analysis by bisulfite sequencing. Methods in Enzymology. 560, 297-329 (2015).
- Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1 (2017).
- Schumann, U., et al. Multiple links between 5-methylcytosine content of mRNA and translation. BMC Biology. 18 (1), 40 (2020).
- Yang, X., et al. 5-Methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27, 606 (2017).
- Chen, X., et al. 5-Methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs. Nature Cell Biology. 21 (8), 978-990 (2019).
- Guo, G., et al. Disease activity-associated alteration of mRNA m(5) C methylation in CD4(+) T cells of systemic lupus erythematosus. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8 (5), 430 (2020).
- Song, H., et al. Biological roles of RNA m5C modification and its implications in cancer immunotherapy. Biomarker Research. 10 (1), 15 (2022).
- Xue, C., Zhao, Y., Li, L. Advances in RNA cytosine-5 methylation: detection, regulatory mechanisms, biological functions and links to cancer. Biomarker Research. 8 (1), 43 (2020).
- Helm, M., Motorin, Y. Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate. Nature Reviews Genetics. 18 (5), 275-291 (2017).
- Guo, G., et al. Advances in mRNA 5-methylcytosine modifications: Detection, effectors, biological functions, and clinical relevance. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 26, 575-593 (2021).
- Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (159), e61231 (2020).
- Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current Protocols in Human Genetics. , Chapter 18, Unit 18.12 (2009).
- Chen, S. -Y., et al. RNA bisulfite sequencing reveals NSUN2-mediated suppression of epithelial differentiation in pancreatic cancer. Oncogene. 41 (22), 3162-3176 (2022).
- Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
- Han, X., et al. Dynamic DNA 5-hydroxylmethylcytosine and RNA 5-methycytosine reprogramming during early human development. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. , (2022).
- Amort, T., et al. Long non-coding RNAs as targets for cytosine methylation. RNA biology. 10 (6), 1003-1008 (2013).
- Sun, Z., et al. Effects of NSUN2 deficiency on the mRNA 5-methylcytosine modification and gene expression profile in HEK293 cells. Epigenomics. 11 (4), 439-453 (2019).
- Huang, T., Chen, W., Liu, J., Gu, N., Zhang, R. Genome-wide identification of mRNA 5-methylcytosine in mammals. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (5), 380-388 (2019).
- Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit. Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).
- Kraus, A. J., Brink, B. G., Siegel, T. N. Efficient and specific oligo-based depletion of rRNA. Scientific Reports. 9 (1), 12281 (2019).
- Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m(5)C within archaeal mRNAs. PLoS Genetics. 9 (5), e1003602 (2013).
- Furlan, M., et al. Computational methods for RNA modification detection from nanopore direct RNA sequencing data. RNA Biology. 18, 31-40 (2021).
- Leger, A., et al. RNA modifications detection by comparative Nanopore direct RNA sequencing. Nature Communications. 12 (1), 7198 (2021).
- Mateos, P. A., et al. Identification of m6A and m5C RNA modifications at single-molecule resolution from Nanopore sequencing. bioRxiv. , (2022).
- Johnson, Z., Xu, X., Pacholec, C., Xie, H. Systematic evaluation of parameters in RNA bisulfite sequencing data generation and analysis. NAR Genomics and Bioinformatics. 4 (2), 045 (2022).
- Zhang, Z., et al. Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library. Nature Methods. 18 (10), 1213-1222 (2021).
- Chao, H. -P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
