Summary
Questo protocollo descrive un metodo per indurre una lesione alcalina corneale e limbare accurata e riproducibile in un modello murino. Il protocollo è vantaggioso in quanto consente una lesione uniformemente distribuita alla cornea e al limbus del topo altamente curvi.
Abstract
La cornea è fondamentale per la vista e la guarigione corneale dopo un trauma è fondamentale per mantenerne la trasparenza e la funzione. Attraverso lo studio di modelli di lesioni corneali, i ricercatori mirano a migliorare la loro comprensione di come la cornea guarisce e sviluppare strategie per prevenire e gestire le opacità corneali. Il danno chimico è uno dei modelli di lesione più popolari che è stato ampiamente studiato sui topi. La maggior parte dei ricercatori precedenti ha usato una carta piatta imbevuta di idrossido di sodio per indurre lesioni corneali. Tuttavia, l'induzione di lesioni corneali e limbari utilizzando carta da filtro piatta non è affidabile, poiché la cornea del topo è altamente curva. Qui, presentiamo un nuovo strumento, un punzone da biopsia modificato, che consente ai ricercatori di creare una lesione alcalina ben circoscritta, localizzata e uniformemente distribuita alla cornea e al limbus murino. Questo metodo punch-trephine consente ai ricercatori di indurre un'ustione chimica accurata e riproducibile all'intera cornea murina e al limbus, lasciando altre strutture, come le palpebre, inalterate dalla sostanza chimica. Inoltre, questo studio introduce una tecnica di enucleazione che preserva la caruncola mediale come punto di riferimento per l'identificazione del lato nasale del globo. Anche la congiuntiva bulbare e palpebrale e la ghiandola lacrimale vengono mantenute intatte con questa tecnica. Gli esami oftalmologici sono stati eseguiti tramite biomicroscopio con lampada a fessura e colorazione con fluoresceina nei giorni 0, 1, 2, 6, 8 e 14 dopo l'infortunio. I risultati clinici, istologici e immunoistochimici hanno confermato il deficit di cellule staminali limbari e il fallimento della rigenerazione della superficie oculare in tutti i topi sperimentali. Il modello di lesione corneale alcalina presentato è ideale per studiare il deficit di cellule staminali limbari, l'infiammazione corneale e la fibrosi. Questo metodo è adatto anche per studiare l'efficacia preclinica e clinica dei farmaci oftalmologici topici sulla superficie corneale murina.
Introduction
La cornea è fondamentale per la visione e presenta caratteristiche uniche, tra cui la trasparenza, che è un prerequisito per una visione chiara. Oltre a svolgere un importante ruolo protettivo, la cornea rappresenta i 2/3 del potere refrattivo dell'occhio1. A causa del suo ruolo significativo nella vista, le lesioni corneali e l'opacità causano un significativo declino visivo e sono responsabili della seconda causa di cecità prevenibile in tutto il mondo 2,3. Nelle lesioni corneali con grave disfunzione limbare, la funzione barriera del limbus diminuisce, con conseguente migrazione delle cellule congiuntivali verso la superficie corneale e la congiuntivalizzazione corneale 4,5, che compromette drammaticamente la vista. Sono quindi necessarie strategie preventive e terapeutiche efficaci per affrontare l'onere globale della cecità corneale e della disabilità correlata.
L'attuale comprensione del processo di guarigione delle ferite corneali umane si basa su studi precedenti che hanno indagato le risposte corneali a varie lesioni. Diverse tecniche e modelli animali sono stati impiegati per indurre varie lesioni corneali chimiche o meccaniche 6,7,8,9 e per indagare vari aspetti del processo di guarigione delle ferite corneali.
Il modello di ustione alcalina è un modello di lesione ben consolidato che viene eseguito applicando idrossido di sodio (NaOH) direttamente sulla superficie corneale o utilizzando carta da filtro piatta10. Una lesione alcalina provoca il rilascio di mediatori pro-infiammatori e l'infiltrazione di cellule polimorfonucleate non solo nella cornea e nella camera anteriore dell'occhio, ma anche nella retina. Ciò induce l'apoptosi involontaria delle cellule gangliari retiniche e l'attivazione delle cellule CD45+ 11. Pertanto, è fondamentale localizzare con precisione il sito della lesione per evitare lesioni involontarie eccessive utilizzando un modello di lesione alcalina.
La lunghezza assiale del bulbo oculare murino è di circa 3 mm12. A causa di questa breve distanza tra la cornea e la retina, esiste una curvatura corneale ripida per fornire un elevato potere di rifrazione per focalizzare la luce sulla retina (Figura 1A). Come abbiamo riportato in precedenza13, indurre lesioni chimiche a questa superficie altamente curva utilizzando una carta da filtro piatta è difficile, in particolare al limbus (Figura 1B). L'induzione di lesioni al limbus richiede l'inclinazione della carta da filtro, che ha il potenziale per causare lesioni involontarie al fornice e alla congiuntiva adiacente14. Un altro approccio prevede l'applicazione diretta dell'agente chimico sotto forma di gocce sulla superficie corneale. Tuttavia, questo metodo manca di controllo sul tempo di esposizione e c'è un potenziale rischio di indurre lesioni alla congiuntiva, al fornice e alle palpebre a causa della diffusione del liquido in queste aree.
Per superare queste limitazioni, questo studio presenta un nuovo metodo punch-trephine per indurre lesioni. Questa tecnica presenta diversi vantaggi, tra cui (i) l'induzione di un'efficace lesione chimica all'intera superficie corneale e al limbus nel modello murino, (ii) l'induzione di una lesione localizzata e ben circoscritta alla cornea, (iii) la possibilità di applicare qualsiasi liquido di interesse per una durata predeterminata e (iv) la capacità di indurre lesioni corneali di diverse dimensioni selezionando punzoni bioptici appropriati. Questo metodo è fattibile anche per i modelli di lesioni di ratto e coniglio, che presentano anche una superficie corneale curva e sono modelli animali comuni utilizzati per studiare la guarigione delle ferite della superficie oculare.
Protocol
Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con il numero APLAC 33420 per la cura degli animali da laboratorio di Stanford, l'uso di animali per scopi scientifici e la dichiarazione ARVO per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva. Un totale di 10 topi C57BL/6 maschi e femmine di età compresa tra 8 e 12 settimane sono stati generosamente forniti dal laboratorio Irving L. Weissman. Gli animali sono stati acclimatati a un ciclo luce-buio di 12 ore e sono stati nutriti con acqua e mangime ad libitum. La ferita è stata indotta a un occhio dell'animale.
1. Preparazione per l'esperimento
- Preparazione dei materiali
NOTA: Tutti i reagenti devono essere mantenuti a temperatura ambiente.- Preparare il punzone-trefina: preparare un punzone per biopsia con un diametro di 3,5 mm e segnare l'asta del punzone a 5 mm di distanza dal bordo distale. Fissare saldamente il punzone e tagliare la parte distale contrassegnata del suo albero utilizzando un utensile rotante a due velocità. Indossare una protezione oculare durante questo processo. Tagliare l'albero a 3,5 mm di profondità e lasciare attaccati gli ultimi 1,5 mm. Piegare la punta di 90°, come mostrato nella Figura 1.
- Preparare una soluzione 0,5 M di NaOH sciogliendo 1 g di NaOH in 50 mL di acqua distillata.
- Preparare 10 mL di cocktail anestetico combinando 2 mL di ketamina 100 mg/mL e 1 mL di xilazina 20 mg/mL. Prima dell'iniezione, diluire questa miscela con 7 mL di NaCl allo 0,9% (soluzione fisiologica normale).
- Preparare una soluzione di fluoresceina sodica allo 0,1% aggiungendo 0,1 mL di liquido fluorescente AK-Fluor al 10% in 9,9 mL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (1x PBS).
- Preparare il PBS (1x) sciogliendo 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4 e 0,23 g di NaH2PO4in 900 ml di acqua distillata. Regolare il pH della soluzione a 7,4. Portare la soluzione ad un volume finale di 1 L aggiungendo acqua distillata.
- Preparare una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4% per il fissaggio. Sotto una cappa chimica, sciogliere 2 g di PFA in 45 mL di PBS. Riscaldare la miscela a 65 °C e titolare il pH a 7,4. Una volta che il PFA si è sciolto, portare la soluzione ad un volume finale di 50 mL.
2. Preparazione dell'animale
- Pesare il topo per determinare il volume appropriato di cocktail anestetico iniettabile per l'iniezione. Dopo aver maneggiato e trattenuto correttamente il topo come descritto in Machholz et al.15, somministrare il cocktail anestetico per via intraperitoneale (IP) alla dose di 0,01 mL/g16,17. Colpire i quadranti addominali inferiori per l'iniezione IP per prevenire danni agli organi.
- Iniettare buprenorfina sospensione iniettabile a rilascio prolungato (3,25 mg/kg) per via sottocutanea per ulteriore analgesia durante e dopo l'intervento chirurgico, poiché la lesione alcalina corneale è estremamente dolorosa.
- Attendere fino a quando non si ottiene un piano profondo di anestesia. Verificare la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi come indicazione di un piano di anestesia profondo riuscito. Applicare un semplice unguento per gli occhi per l'occhio controlaterale per evitare che si secchi prima di iniziare l'intervento chirurgico.
- Dopo l'anestesia, posizionare il topo sul tavolo operatorio preparato secondo i principi standard della chirurgia dei roditori18. Posizionare un cuscino alto 5 mm sotto la testa del roditore, posizionato in posizione di decubito laterale. Il cuscino aiuta a sostenere la testa del roditore durante l'intervento chirurgico.
- Somministrare tetracaina cloridrato (0,5%) collirio per un'ulteriore anestesia. Asciugare adeguatamente la superficie oculare con una lancia chirurgica e tagliare le ciglia.
3. Induzione di lesioni alcaline
- Prima di iniziare l'intervento chirurgico, organizzare il tavolo operatorio secondo i principi standarddella chirurgia dei roditori 18,19 e mantenere il campo operatorio sterile durante l'intervento. Posizionare il microscopio operatorio per visualizzare correttamente il topo anestetizzato e regolare il timer a 30 s. Metti un tovagliolo di carta attorcigliato sul muso dell'animale per evitare l'aspirazione nasale involontaria durante il processo di risciacquo.
- Determinare la circonferenza dell'area limbare utilizzando il microscopio operatorio assicurandosi che le palpebre del topo siano spalancate utilizzando il pollice e l'indice. Tenere delicatamente il punch-trephine pulito parallelo all'asse dell'occhio, senza esercitare alcuna pressione verso il basso. Evitare di far roteare lo strumento e mantenere l'asse del punch-trephine parallelo all'asse del globo.
- Chiedere all'assistente chirurgico di far cadere 3 gocce di soluzione di NaOH (pari a 40 μL) nel foro del punch-trephine per riempire lo strumento e coprire la superficie corneale in modo appropriato. La tensione superficiale del liquido impedisce qualsiasi fuoriuscita dallo strumento (Figura 1).
NOTA: Abbiamo utilizzato una siringa da 1 mm con un ago da 27G con una punta appiattita angolata a 50° per far cadere con cautela la soluzione di NaOH. - Dopo 30 s, sciacquare immediatamente la cornea e il fornice con 5 mL di PBS (1x). Il video 1 mostra la procedura per indurre lesioni chimiche.
- Utilizzare una carta indicatrice di pH universale per garantire un pH di 7 - 7,5 sulla superficie corneale dell'occhio ferito. Quindi, applicare l'unguento oftalmico triplo antibiotico sulla superficie oculare danneggiata chimicamente.
NOTA: Il movimento della coda durante l'intervento chirurgico è un segno di bassa profondità dell'anestetico. Applicare un ulteriore cocktail anestetico (ketamina + xilazina) iniettando un anestetico [bolo IP (50% del volume iniziale)]. - Dopo l'intervento chirurgico, verificare che il topo sia in condizioni stabili. Somministrare una seconda buprenorfina se l'animale soffre. Utilizzare la stessa tecnica di manipolazione di cui al punto 2.2. Iniziare l'esame postoperatorio mentre l'animale è sotto anestesia.
- Dopo la procedura, lavare, asciugare e igienizzare il punch-trephine e il tavolo operatorio con etanolo al 70%.
4. Valutazione clinica
- Per l'esame, anestetizzare il topo come descritto in precedenza al punto 2.1.
- Esaminare gli occhi (feriti e non feriti) con un biomicroscopio con lampada a fessura. Utilizzare una fotocamera per scattare foto (in questo studio è stata utilizzata la fotocamera di un telefono in modalità Cinema).
- Punteggio dell'opacità corneale secondo il sistema di classificazione Yoeruek20: 0 = cornea normale e chiara; 1 = opacità lieve; 2 = maggiore opacità, ma l'iride e la pupilla sono facilmente distinguibili; 3 = l'iride e la pupilla sono appena distinguibili; 4 = la cornea è completamente opaca con una pupilla invisibile.
- Applicare collirio fluoresceina allo 0,1%. Asciugare il liquido fluorescente in eccesso con un applicatore di cotone e valutare la presenza di difetti epiteliali corneali utilizzando il filtro blu cobalto. Scatta foto.
- Monitorare l'animale fino a quando non riacquista una coscienza sufficiente per mantenere il decubito sternale. Non reintrodurre l'animale ad altri animali fino a quando non si è completamente ripreso.
5. Enucleazione
- Eutanasiare i topi 2 settimane dopo l'induzione del danno chimico mediante lussazione cervicale in 3-5 s21.
- Enucleare l'occhio preservando la caruncola mediale e l'intera congiuntiva palpebrale nel seguente ordine, come mostrato nel Video 2.
- Sotto il microscopio operatorio, sezionare attentamente la giunzione della caruncola e della pelle. Usando una pinza dentale, ritrarre la caruncola e guidare la punta delle forbici chirurgiche sotto la congiuntiva palpebrale verso la sua giunzione con la placca tarsale.
- Tagliare la congiuntiva lungo la linea di adesione verso il canto laterale. Quindi, ruotare le forbici chirurgiche sulla giunzione della congiuntiva e della placca tarsale inferiore sul piano sottocongiuntivale.
- Dopo aver completato la dissezione congiuntivale, ritrarre le palpebre superiori e inferiori dal lato nasale con il pollice e l'indice. Mentre si ritrae, guidare la punta di una pinzetta a punta curva dietro il gladio lacrimale sporgente verso il nervo ottico. Afferrare saldamente il nervo ottico ed estrarre il globo (Figura 2).
- Sciacquare il globo con PBS (1x) e trasferirlo nella soluzione di fissaggio.
6. Ematossilina ed eosina (H&E) e colorazione periodica acido-Schiff (PAS)
- Fissare i globi in una soluzione di formalina al 10% per una notte a temperatura ambiente.
- Disidratare i tessuti utilizzando una serie sequenziale di alcol graduato con concentrazioni di etanolo al 70%, etanolo all'80%, etanolo al 90% e etanolo al 100%, ciascuno per 10-15 minuti. Successivamente, immergere gli occhi nello xilene per 10 min. Infine, racchiudere gli occhi nella paraffina.
- Sezionare i blocchi di paraffina in fette spesse 6 μm e montarle su vetrini da microscopio per la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) e acido-Schiff periodico (PAS), come descritto nel file supplementare 1.
7. Imaging e analisi in immunofluorescenza
- Per gli studi di immunoistochimica (IHC), fissare gli occhi in 1 mL di PBS (1x) contenente il 4% di PFA a 4 °C durante la notte. Lavare il campione 3 volte in 1 mL di PBS (1x) per 5 minuti ciascuno.
- Per prevenire la formazione di cristalli di ghiaccio e proteggere le strutture molecolari delle proteine, eseguire la saturazione seriale di saccarosio con concentrazioni di saccarosio al 10%, 20% di saccarosio e 30% di saccarosio in PBS. Incorporare i globi in una soluzione di tomografia a coerenza ottica (OCT; Figura 2) e conservarli a -80 °C.
- Sezionare il blocchetto OCT in fette spesse 12 μm e montarlo su vetrini da microscopio per la colorazione IHC.
- Permeabilizzare sezioni di tessuto su vetrini da microscopio in Triton X allo 0,1% −100 in PBS (1x) per 15 min. Quindi, bloccare gli antigeni non specifici con BSA al 5% in PBS (1x) per un'ulteriore 1 ora a temperatura ambiente.
- Incubare sezioni di tessuto su vetrini da microscopio a 4 °C per una notte nel cocktail degli anticorpi primari mirati preparati in PBS (1x) contenente l'1% di BSA. In questo esperimento, gli anticorpi primari erano anticorpi diluiti 1:100 anti-cheratina 13 (K13) e anti-cheratina 12 (K12) di coniglio diluiti con concentrazione rispettivamente di 2,24 μg/mL e 1,56 μg/mL.
- Dopo l'incubazione, lavare le sezioni di tessuto sui vetrini da microscopio 3 volte con PBS (1x). Successivamente, rilevare gli anticorpi primari legati con 1:500 diluiti anti-coniglio-IgG d'asino. Incubare con l'anticorpo secondario a 4 °C per 1 ora al buio. Quindi lavare in PBS (1x) 3 volte per 5 minuti ciascuna.
- Applicare una goccia di mezzo di montaggio a fluorescenza anti-sbiadimento contenente DAPI sulle sezioni di tessuto al microscopio e coprire con un vetrino coprioggetto. Lasciare asciugare i campioni al buio ed esaminarli con un microscopio a fluorescenza con la stessa impostazione laser per occhi normali e feriti.
Representative Results
L'efficacia del metodo nell'indurre il deficit di cellule staminali limbari (LSCD) è stata valutata valutando i segni clinici e istologici della LSCD. La valutazione clinica è stata effettuata mediante microscopia con lampada a fessura e tomografia a coerenza ottica del segmento anteriore (AS-OCT) (Figura 3 e Figura 4).
La riepitelizzazione avveniva in modo centripeto ed era più veloce nella parte temporale della cornea rispetto alla sua parte nasale. Gli occhi feriti hanno sviluppato una foschia corneale 2+-3+ subito dopo la lesione chimica (Figura 3). Le cellule epiteliali sono migrate dalla congiuntiva alla superficie corneale in seguito a una lesione limbare. Il grande difetto epiteliale corneale è stato riepitelizzato completamente nei giorni 12-14, il che ha richiesto più tempo rispetto a una lesione epiteliale corneale di dimensioni simili e membrana basale e stroma intatti che in genere guariva entro 5 giorni dopo la lesione 8,9. A causa della LSCD, il 50% degli occhi danneggiati ha sviluppato difetti epiteliali persistenti alla fine della seconda settimana (Figura 3). L'edema corneale è stato più prominente durante i primi giorni (Figura 3, Figura 4), mentre la fibrosi corneale è stata significativa nella seconda settimana che ha provocato un'opacità corneale 4+ nel 100% degli occhi feriti.
I primi segni di neovascolarizzazione (NV) sono stati osservati clinicamente e istologicamente, 24 ore dopo l'induzione del danno chimico, come illustrato nella Figura 5, coerentemente con la sequenza temporale della NV identificata dallo studio Kvanta et al. che ha mostrato segni di NV limbare 24 ore dopo la lesione22. Durante il processo di guarigione, i nuovi vasi sono maturati e il 14° giorno dopo la lesione, NV ha attraversato il limbus e ha raggiunto la cornea centrale. Il limbus, che definisce il confine tra la congiuntiva e la cornea, è stato distrutto.
L'evidenza istologica del deficit di cellule staminali limbari e della congiuntivalizzazione è stata osservata dalla comparsa di cellule caliciformi PAS+ e vasi sanguigni stromali 23,24,25,26. Le cellule caliciformi sono state osservate nel presente modello di lesione e indicate dalla freccia nella Figura 6.
Gli epiteli congiuntivali e corneali esprimono principalmente cheratine uniche, rispettivamente K13 e K1227. Dopo la lesione limbare, nuove cellule epiteliali originate dalla congiuntiva hanno coperto la cornea denudata e K12 non è stato espresso sulla superficie corneale di nessun animale ferito durante le 2 settimane dopo la lesione. Questo risultato, coerente con altri studi28, indicava la LSCD completa e l'assenza di cellule epiteliali corneali sulla superficie corneale. Tuttavia, nello studio di Park et al.29, hanno rilevato l'espressione di K12 20 e 32 settimane dopo la lesione, suggerendo una possibile trans-differenziazione delle cellule epiteliali.
Di conseguenza, abbiamo osservato che la lesione chimica ha distrutto il limbus e le cellule staminali limbari, il che ha provocato la migrazione delle cellule epiteliali congiuntivali al centro della cornea per coprire la superficie corneale denudata. Ciò è ulteriormente convalidato dal marcatore delle cellule epiteliali congiuntivali, K13, che è stato espresso nell'intera superficie congiuntiva e corneale, come mostrato nella Figura 7.
Figura 1: L'occhio destro di topo normale e il punch-trephine per indurre lesioni corneali e limbari. (A) Vista laterale che mostra l'occhio di topo con cornea molto curva (le punte di freccia indicano il limbus). (B) L'immagine dimostra che anche una carta da filtro di grandi dimensioni non è sufficiente a coprire adeguatamente l'area limbare. Il diametro da limbus a limbus dell'occhio del topo è di quasi 4 mm e una biopsia punch con un diametro esterno di 4,5 mm e un diametro interno di 3,5 mm (pannelli D e H), copre in modo appropriato la cornea e la superficie limbare come mostrato nei pannelli (C) e (E). (F) Il punch-trephine è tenuto in modo appropriato sul globo intorno all'area limbare. (G) Per garantire che non vi siano perdite attraverso il bordo del punzone-trefina, dopo aver posizionato in modo appropriato il punzone-trefina su un asse parallelo con il globo, il foro viene riempito con blu di metilene. Non viene rilevata alcuna perdita di blu di metilene. Barra della scala = 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Occhi enucleati. (A) Gli occhi sono stati enucleati preservando la congiuntiva bulbare e palpebrale, la ghiandola lacrimale (punta di freccia) e il nervo ottico (freccia). Gli occhi normali (B) e feriti (C) sono stati saturati con il 30% di saccarosio per proteggerli dalla formazione di criocristalli. La parte nasale del globo è riconoscibile attraverso la caruncola nasale (etichettata N). Barra della scala = 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Guarigione della ferita dell'occhio sinistro. Il processo di guarigione della ferita dell'occhio sinistro del topo durante 2 settimane dopo la lesione alcalina corneale e limbare in un modello murino è mostrato qui (A-F). L'esame dell'occhio con lampada a fessura. L'edema corneale è più prominente nei giorni 0 e 2 (A,B), mentre la fibrosi è più evidente durante la seconda settimana post-lesione (E-F). A.f.f.f mostrano il processo di riepitelizzazione dello stesso occhio. Il difetto epiteliale corneale e limbare totale immediatamente dopo l'induzione della lesione è stato osservato in A.f. Il difetto epiteliale è guarito dalla migrazione delle cellule epiteliali congiuntivali in un modello centripeto entro 12-14 giorni (A.f-F.f). Tuttavia, il 50% degli occhi feriti ha sviluppato un difetto epiteliale persistente alla fine della seconda settimana, come mostrato dalla freccia nelle immagini F e F.f. Barra della scala = 1 mm (pannello C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: OCT del segmento anteriore dell'occhio del topo. (A) L'AS-OCT illustra la normale curvatura della cornea e la camera anteriore. La struttura dell'iride è ben definita e riconoscibile. Non è rilevabile alcuna adesione iridocorneale alla periferia mediana dell'iride. (B) Immediatamente dopo la lesione lo spessore corneale aumenta a causa della formazione di edema e l'adesione iridocorneale si sviluppa alla periferia media dell'iride. (C) Due settimane dopo la lesione la curvatura corneale è cambiata ed è visibile l'adesione iridocorneale totale con distruzione della camera anteriore. Barra della scala = 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Neovascolarizzazione corneale. Segni clinici e istologici di neovascolarizzazione corneale possono essere osservati durante il processo di guarigione della ferita a seguito di una lesione da idrossido di sodio (NaOH). (A) I segni iniziali di neovascolarizzazione diventano rilevabili il primo giorno dopo la lesione, caratterizzati da una colorazione rossastra della cornea (indicata da una freccia bianca). Questo scolorimento deriva dall'aggregazione di globuli rossi nello stroma, come illustrato nella corrispondente immagine istologica (D) (indicata da punte di freccia gialle). (B) Durante la prima settimana di rigenerazione, i nuovi vasi aumentano progressivamente e si diffondono in tutta la cornea. (C) Entro la fine di 2 settimane, l'area limbare viene distrutta e i nuovi vasi continuano ad evolversi. (E) La sezione istologica della cornea illustra ulteriormente la presenza di neovascolarizzazione stromale profonda (mostrata dalle punte di freccia). Lampada a fessura Barra della scala dell'immagine = 1 mm, la barra della scala dell'immagine istologica = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Colorazione periodica acido-Schiff e immunoistochimica (IHC) della cornea. La colorazione periodica acido-Schiff e immunoistochimica della cornea normale e lesionata è stata eseguita 2 settimane dopo la lesione. Epitelio corneale di topo normale composto da 4-5 strati di cellule (A). La lesione alcalina della cornea e del limbus ha portato alla congiuntivalizzazione della cornea con comparsa di cellule caliciformi sulla superficie corneale, come mostrato dalle frecce nere in (D). Le cellule epiteliali corneali normali esprimono K12 (B), che non è espresso dalle cellule congiuntivali che ricoprono la cornea lesa (E). K13, un marcatore caratteristico delle cellule epiteliali congiuntivali, non è espresso sulle normali cellule epiteliali corneali (C). Tuttavia, è presente sulla superficie corneale lesa dell'idrossido di sodio (NaOH) che è un segno di congiuntivalizzazione corneale (F). Barra della scala dell'immagine istologica = 50 μm, barra della scala dell'immagine colorata IHC = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Ematossilina ed eosina e colorazione immunoistochimica. Sono state eseguite ematossilina ed eosina (H&E) e sono state eseguite colorazioni immunoistochimiche del tessuto limbus normale e lesionato. (A) Il limbus normale segna l'area di transizione tra la fine della sclera e l'inizio della cornea. Questa regione è tipicamente ricoperta da uno o due strati di cellule epiteliali congiuntivali (indicate dalle frecce). In un occhio sano, l'espressione di uno specifico marcatore epiteliale corneale chiamato K12 inizia nel limbus e si estende alla superficie della cornea (mostrata nell'immagine B). D'altra parte, l'espressione di un marcatore congiuntivale noto come K13 è limitata al limbus e non si estende oltre di esso (indicato dalla freccia bianca nell'immagine C). Negli occhi danneggiati dall'idrossido di sodio (NaOH), i confini del limbus sono interrotti. Questo porta alla migrazione delle cellule congiuntivali verso la cornea danneggiata. (D) Le immagini del limbus danneggiato da NaOH dimostrano la presenza di neovascolarizzazione sia sotto lo strato epiteliale che all'interno del tessuto stromale. A seguito della lesione, la superficie corneale lesa manca della presenza di K12 (E), mentre K13 è abbondantemente espressa sulla superficie corneale (F). Barra della scala dell'immagine istologica = 50 μm, barra della scala dell'immagine colorata IHC = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare 1: Protocollo di colorazione. Fare clic qui per scaricare il file.
Video 1: Lesione corneale e limbare di NaOH in un modello murino con un punch-trephine. Il video mostra la procedura per indurre la lesione corneale e limbare di NaOH in un modello murino con un punch-trephine. È fondamentale tenere il punch-trephine in un asse parallelo con il globo e applicare una pressione minima al limbus. Questa tecnica corretta è essenziale per prevenire le perdite e ottenere risultati ottimali. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 2: Illustrazione della tecnica di enucleazione preservando la congiuntiva bulbare. Per differenziare il lato nasale del globo dal lato temporale, la caruncola nasale viene preservata insieme al globo. L'intera congiuntiva viene sezionata a partire dalla sua giunzione con la placca tarsale. Con una pressione minima, il contenuto orbitale sporge verso l'esterno. Guidando la pinza verso la parte posteriore del globo, il nervo ottico viene afferrato e il tessuto viene estratto. Il tessuto enucleato comprende il globo, il grasso orbitale e la ghiandola lacrimale orbitaria. Clicca qui per scaricare questo video.
Discussion
Questo studio propone un dispositivo innovativo, il punch-trephine, che può essere utilizzato per indurre con successo una lesione corneale e limbare efficace e riproducibile in un modello murino. Questo modello di deficit di cellule staminali limbari è ideale per studiare le dinamiche della guarigione delle ferite corneali e della congiuntivalizzazione dopo una lesione.
L'evidenza suggerisce che sia la nicchia limbare che la parte centrale della cornea murina contengono cellule staminali30. Pertanto, è necessaria un'efficiente lesione corneale e limbare per produrre un modello di deficit di cellule staminali e il modello di lesione qui presentato consente l'esposizione del limbus corneale curvo a un agente chimico per un periodo specifico. Per determinare la migliore concentrazione e durata della lesione da NaOH, le lesioni sono state inflitte con varie concentrazioni e durate di NaOH. Concentrazioni più elevate di NaOH o durate di esposizione più lunghe hanno provocato un aumento del danno tissutale e della fibrosi. Pertanto, i ricercatori possono regolare questi parametri in base agli obiettivi specifici del loro studio e alla gravità desiderata della lesione.
Per riprodurre con successo questo modello di lesione corneale e limbare, è necessario considerare diverse considerazioni chiave. Innanzitutto, è imperativo misurare il diametro da limbo a limbare dell'occhio bersaglio per determinare la dimensione appropriata del punzone. Si consiglia di selezionare un punzone per biopsia con un diametro esterno di 0,5 - 1 mm più grande di questo diametro.
La tensione superficiale del liquido utilizzato è un fattore importante per prevenire la fuoriuscita all'interfaccia tra la superficie oculare e il bordo della trefina del punzone, come mostrato nella Figura 1G. Pertanto, non è necessario applicare pressione sulla punta della biopsia del punzone.
Per evitare di causare danni meccanici al tessuto, è fondamentale tenere la trefina del punzone in un asse parallelo con l'occhio e astenersi dall'applicare pressione sul limbus. Una regolazione impropria dell'asse della trefina del punzone può aumentare il rischio di perdite e provocare un sito decentrato di lesioni e risultati imprecisi.
Alcune potenziali limitazioni di questa tecnica includono la necessità di selezionare la dimensione appropriata del punzone, l'acquisizione di competenza nel tenere la trefina del punzone e il potenziale rischio di causare lesioni meccaniche. Tuttavia, queste limitazioni possono essere superate attraverso la pratica e seguendo le istruzioni delineate in questo protocollo. Il ceppo e la fascia di età dei topi sono altri fattori che influenzano il processo di riepitelizzazione e devono essere considerati nello studio.
Inoltre, il protocollo proposto è vantaggioso in quanto descrive in dettaglio un metodo di enucleazione che preserva la congiuntiva bulbare e palpebrale e consente la determinazione della parte nasale del globo senza l'applicazione di suture chirurgiche come marcatore. Ricerche precedenti hanno indicato che la regione nasale dell'occhio possiede l'innervazione neurale più bassa rispetto ad altre aree della cornea, il che la rende più vulnerabile alla neovascolarizzazione e alla ridotta efficacia rigenerativa 31,32.
In sintesi, i segni clinici della LSCD, come l'opacità corneale (CO), i difetti epiteliali persistenti e la neovascolarizzazione corneale (NV), insieme ai cambiamenti istologici osservati, tra cui la metaplasia delle cellule caliciformi, l'espressione di K13 sulla superficie corneale e l'assenza di K12 sulla superficie corneale, confermano la presenza di LSCD in questo modello. Questi risultati forniscono la prova che questa nuova tecnica è efficace nell'indurre LSCD. Questo modello di danno chimico può essere impiegato in studi preclinici per studiare nuovi farmaci e trattamenti farmaceutici nel campo della lesione e della rigenerazione corneale.
Disclosures
Nessuno degli autori ha alcun interesse finanziario in nessuna delle aziende o dei prodotti descritti in questo studio. Gli autori dichiarano di non avere altri conflitti di interesse.
Acknowledgments
Riconosciamo che NEI P30-EY026877 supporta questa ricerca. Ringraziamo Charlene Wang e il Dr. Irv Weissman Lab presso l'Istituto per la Biologia delle Cellule Staminali e la Medicina Rigenerativa dell'Università di Stanford per tutta la loro gentile assistenza nel fornire animali da esperimento. Apprezziamo l'assistenza di Hirad Rezaeipoor nella preparazione e nella modifica delle immagini.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-K12 antibody | ABCAM | ab185627 | |
| Anti-K13 antibody | ABCAM | ab92551 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher Scientific | B14 | |
| C57BL/6 mice | Dr Weissman Lab, Stanford University | ||
| Curved forceps | Storz | E1885 | |
| Disposable 90 degree bent needle | |||
| Disposable biopsy punch | Med blades | ||
| Donkey anti-rabbit IgG H&L | ABCAM | ab150073 | |
| Ethanol | ThermoFisher Scientific | T038181000CS | |
| Ethiqa XR (Buprenorphine extended-release injectable suspension) | Fidelis Animal Health | ||
| Heating pad for mouse | |||
| Ketamine hydrochloride | Ambler | ANADA 200-055 | |
| OCT | Tissue-Tek 4583 | ||
| Ophthalmic surgical scissors | |||
| pH Indicator Sticks | Whatman | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | AM9624 | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Slit-lamp microscope | NIDEK | SL-450 | |
| Sodium fluorescein AK-fluor 10% | Dailymed | NDC17478-253-10 | |
| Sterile irrigation solution (BSS) | Alcon | 9017036-0119 | |
| Sterile syringe, 1 and 5 ml | |||
| Straight forceps | Katena K5 | 4550- Storz E1684 | |
| Surgical eye spears | American White 17240 Cross | ||
| Surgical microscope | Zeiss S5 microscope | ||
| Tetracaine ophthalmic drop | Alcon | NDC0065-0741-14 | |
| Timer | |||
| Triple antibiotic ophthalmic ointment | Bausch and Lomb | ||
| TritonX -100 | Fisher Scientific | 50-295-34 | |
| Two-speed rotary tool | 200-1/15 Two Speed Rotary Toolkit | ||
| Xylazine | AnaSed | NADA#139-236 |
References
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
- Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: a global problem. Clinical & experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
- Lamm, V., Hara, H., Mammen, A., Dhaliwal, D., Cooper, D. K. C.
- Danjo, S., Friend, J., Thoft, R. A. Conjunctival epithelium in healing of corneal epithelial wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (9), 1445-1449 (1987).
- Shapiro, M. S., Friend, J., Thoft, R. A.
- Shah, D., Aakalu, V. K. Murine Corneal Epithelial Wound Modeling. Wound Regeneration: Methods and Protocols. Das, H. , Springer US. 175-181 (2021).
- Rittié, L., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D.
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (178), 63112 (2021).
- Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Paschalis, E. I., et al. The Role of Microglia and Peripheral Monocytes in Retinal Damage after Corneal Chemical Injury. The American Journal of Pathology. 188 (7), 1580-1596 (2018).
- Jiang, M., et al. Single-Shot Dimension Measurements of the Mouse Eye Using SD-OCT. Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 43 (3), 252-256 (2012).
- Shadmani, A., Razmkhah, M., Jalalpoor, M. H., Lari, S. Y., Eghtedari, M. Autologous Activated Omental versus Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells in Corneal Alkaline Injury: An Experimental Study. Journal of Current Ophthalmology. 33 (2), 136-142 (2021).
- Swarup, A., et al. PNP Hydrogel Prevents Formation of Symblephara in Mice After Ocular Alkali Injury. Translational Vision Science & Technology. 11 (2), 31-31 (2022).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), 2771 (2012).
- Jaber, S. M., et al. Dose Regimens, Variability, and Complications Associated with Using Repeat-Bolus Dosing to Extend a Surgical Plane of Anesthesia in Laboratory Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 684-691 (2014).
- Navarro, K. L., et al. Mouse Anesthesia: The Art and Science. ILAR Journal. 62 (1-2), 238-273 (2021).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A.
- ACLAM Medical Records Committee. Medical Records for Animals Used in Research, Teaching, and Testing: Public Statement from the American College of Laboratory Animal Medicine. ILAR Journal. 48 (1), 37-41 (2007).
- Yoeruek, E., et al. Safety, penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn. Acta Ophthalmologica. 86 (3), 322-328 (2008).
- Shomer, N. H., et al.
- Kvanta, A., Sarman, S., Fagerholm, P., Seregard, S., Steen, B. Expression of Matrix Metalloproteinase-2 (MMP-2) and Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in Inflammation-associated Corneal Neovascularization. Experimental Eye Research. 70 (4), 419-428 (2000).
- Tseng, S. C., Hirst, L. W., Farazdaghi, M., Green, W. R. Goblet cell density and vascularization during conjunctival transdifferentiation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (10), 1168-1176 (1984).
- Huang, A. J., Tseng, S. C. Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium. Investigative ophthalmology & visual science. 32 (1), 96-105 (1991).
- Rama, P., et al. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
- Deng, S. X., et al. Global consensus on the definition, classification, diagnosis and staging of limbal stem cell deficiency. Cornea. 38 (3), 364-375 (2019).
- Wei, Z. G., Wu, R. L., Lavker, R. M., Sun, T. T. In vitro growth and differentiation of rabbit bulbar, fornix, and palpebral conjunctival epithelia: Implications on conjunctival epithelial transdifferentiation and stem cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 34 (5), 1814-1828 (1993).
- Kao, W. W. Y. Keratin expression by corneal and limbal stem cells during development. Experimental Eye Research. 200, 108206 (2020).
- Park, M., et al. Plasticity of ocular surface epithelia: Using a murine model of limbal stem cell deficiency to delineate metaplasia and transdifferentiation. Stem Cell Reports. 17 (11), 2451-2466 (2022).
- Li, J., et al. Identification for Differential Localization of Putative Corneal Epithelial Stem Cells in Mouse and Human. Scientific Reports. 7 (1), 5169 (2017).
- McKenna, C. C., Lwigale, P. Y. Innervation of the Mouse Cornea during Development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 30-35 (2011).
- He, J., Bazan, H. E. P. Neuroanatomy and Neurochemistry of Mouse Cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (2), 664-674 (2016).
