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Chemistry

Imágenes químicas hiperespectrales no lineales multimodales mediante microscopía de generación de suma de frecuencia vibracional de barrido lineal

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/65388
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,3,4
1Department of Chemistry and Biochemistry, UC San Diego, 2State Key Laboratory of Molecular Reaction Dynamics, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, 3Materials Science and Engineering Program, UC San Diego, 4Department of Electrical and Computer Engineering, UC San Diego

Summary

Se desarrolló un marco de imágenes hiperespectrales rápidas y multimodales para obtener imágenes de generación de suma de frecuencia vibracional (VSFG) de banda ancha, junto con modalidades de imágenes de generación de segundos armónicos (SHG) de campo claro. Debido a que la frecuencia infrarroja es resonante con las vibraciones moleculares, se revela el conocimiento microscópico estructural y de la morfología mesoscópica de las muestras permitidas por simetría.

Abstract

La generación vibracional de suma de frecuencia (VSFG), una señal óptica no lineal de segundo orden, se ha utilizado tradicionalmente para estudiar moléculas en interfaces como una técnica de espectroscopia con una resolución espacial de ~100 μm. Sin embargo, la espectroscopia no es sensible a la heterogeneidad de una muestra. Para estudiar muestras mesoscópicamente heterogéneas, nosotros, junto con otros, empujamos el límite de resolución de la espectroscopia VSFG hasta un nivel de ~1 μm y construimos el microscopio VSFG. Esta técnica de imagen no solo puede resolver las morfologías de las muestras a través de imágenes, sino que también registra un espectro VSFG de banda ancha en cada píxel de las imágenes. Al ser una técnica óptica no lineal de segundo orden, su regla de selección permite la visualización de estructuras autoensambladas no centrosimétricas o quirales que se encuentran comúnmente en biología, ciencia de materiales y bioingeniería, entre otras. En este artículo, se guiará a la audiencia a través de un diseño de transmisión invertida que permite obtener imágenes de muestras no fijadas. Este trabajo también muestra que la microscopía VSFG puede resolver información geométrica química específica de láminas autoensambladas individuales combinándola con un solucionador de funciones de red neuronal. Por último, las imágenes obtenidas bajo configuraciones de campo claro, SHG y VSFG de varias muestras discuten brevemente la información única revelada por las imágenes VSFG.

Introduction

La generación vibracional de suma de frecuencia (VSFG), una técnica óptica no lineal de segundo orden1,2, se ha utilizado ampliamente como herramienta de espectroscopia para perfilar químicamente muestras con simetría permitida 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20,21,22. Tradicionalmente, VSFG se ha aplicado a los sistemas interfaciales 8,9,10,11 (es decir, gas-líquido, líquido-líquido, gas-sólido, sólido-líquido), que carecen de simetría de inversión, un requisito para la actividad de VSFG. Esta aplicación de VSFG ha proporcionado una gran cantidad de detalles moleculares de las interfaces enterradas 12,13, las configuraciones de las moléculas de agua en las interfaces 14,15,16,17,18 y las especies químicas en las interfaces 19,20,21,22.

Aunque VSFG ha sido poderoso en la determinación de especies moleculares y configuraciones en interfaces, su potencial en la medición de estructuras moleculares de materiales que carecen de centros de inversión no se ha cumplido. Esto se debe en parte a que los materiales podrían ser heterogéneos en su entorno químico, composiciones y disposición geométrica, y un espectrómetro VSFG tradicional tiene una gran área de iluminación del orden de 100 μm2. Por lo tanto, la espectroscopia VSFG tradicional informa sobre la información promediada por conjuntos de la muestra en un área de iluminación típica de 100 μm2. Este promedio de conjuntos puede conducir a cancelaciones de señales entre dominios bien ordenados con orientaciones opuestas y a una caracterización errónea de las heterogeneidades locales 15,20,23,24.

Con los avances en los objetivos de microscopio basados en reflectantes de alta apertura numérica (NA) (geometrías Schwarzschild y Cassegrain), que están casi libres de aberraciones cromáticas, el tamaño de enfoque de los dos haces en experimentos VSFG puede reducirse de 100 μm 2 a 1-2 μm2 y, en algunos casos, submicrónico25. Incluyendo este avance tecnológico, nuestro grupo y otros han desarrollado VSFG en una plataforma de microscopía 20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Recientemente, hemos implementado un diseño óptico invertido y un esquema de detección de banda ancha37, que permite una recopilación perfecta de imágenes multimodales (VSFG, segunda generación de armónicos (SHG) y óptica de campo claro). Las imágenes multimodales permiten una inspección rápida de las muestras mediante imágenes ópticas, correlacionando varios tipos de imágenes y localizando las posiciones de las señales en las imágenes de la muestra. Con la óptica de iluminación acromática y la elección de la fuente de iluminación láser pulsada, esta plataforma óptica permite la integración perfecta en el futuro de técnicas adicionales como la microscopía de fluorescencia38 y la microscopía Raman, entre otras.

En esta nueva disposición, se han estudiado muestras como organizaciones jerárquicas y una clase de autoensamblajes moleculares (MSA). Estos materiales incluyen el colágeno y la biomimética, donde tanto la composición química como la organización geométrica son importantes para la función final del material. Debido a que VSFG es una señal óptica no lineal de segundo orden, es específicamente sensible a los arreglos intermoleculares39,40, como la distancia intermolecular o los ángulos de torsión, lo que lo convierte en una herramienta ideal para revelar tanto composiciones químicas como arreglos moleculares. Este trabajo describe las modalidades VSFG, SHG y de campo claro del instrumento central que consiste en un láser de estado sólido de cavidad dopada con iterbio que bombea un amplificador paramétrico óptico (OPA), un microscopio invertido multimodal construido en casa y un analizador de frecuencia monocromador acoplado a un detector de dispositivo acoplado cargado bidimensional (CCD)27. Se proporciona un procedimiento de construcción y alineación paso a paso, y una lista completa de piezas de la configuración. Un análisis en profundidad de un MSA, cuya subunidad molecular fundamental está compuesta por una molécula de sulfato de sodio-dodecilo (SDS), un tensioactivo común, y dos moléculas de β-ciclodextrina (β-CD), conocida como SDS@2 β-CD en este documento, también se proporciona como ejemplo para mostrar cómo VSFG puede revelar detalles geométricos específicos de moléculas de materia organizada. También se ha demostrado que los detalles geométricos específicos de la MSA se pueden determinar con un enfoque de solucionador de funciones de red neuronal.

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Protocol

1. Microscopio VSFG de barrido de línea hiperespectral

  1. Sistema láser
    1. Utilice un sistema de láser pulsado (consulte la tabla de materiales) centrado a 1025 nm ± 5 nm. El láser está configurado a 40 W, 200 kHz (200 μJ / pulso) con un ancho de pulso de ~ 290 fs.
      NOTA: La tasa de repetición exacta puede variar, y un láser de alta tasa de repetición generalmente funciona mejor para este microscopio VSFG.
    2. Guíe la salida del láser de semillas en un amplificador paramétrico óptico (OPA) comercial para generar un haz de infrarrojo medio (MIR) (consulte la tabla de materiales). Ajuste el MIR a la frecuencia de intereses (Figura 1A).
      NOTA: En el presente estudio, el MIR está centrado a 3450 nm ± 85 nm (~2900 ± 72 cm-1) con una duración de pulso de ~290 fs y una energía de pulso de ~6 μJ, que abarca parte de la región del grupo funcional -CHx .
  2. Haz de conversión ascendente
    1. Pase el haz residual de 1025 nm de OPA a través de un etalón de Fabry-Perot (ver Tabla de Materiales) para producir un haz de conversión ascendente espectralmente estrecho con un FWHM de ~4,75 cm-1.
    2. Filtre espacialmente el haz estrecho de 1025 nm con un orificio de zafiro de 8 μm.
      NOTA: El haz de 1025 nm se puede visualizar utilizando una tarjeta NIR.
    3. Controle la polarización del pulso de 1025 nm con una placa de onda λ/2 (consulte la tabla de materiales).
  3. Haz MIR
    1. Guíe el haz MIR a través de una etapa de retardo para un control preciso de la superposición temporal.
    2. Controle la polarización del MIR con una placa de onda λ/2.
  4. Microscopio VSFG
    1. Se superponen espacialmente tanto la conversión ascendente como los haces MIR en un espejo dicroico personalizado (DM, Figura 1B) que es transmisivo a MIR y reflectante a NIR (ver Tabla de Materiales). Usa dos iris para guiar la alineación: uno justo después del DM y otro en el otro extremo. Use un medidor de potencia después del iris para determinar si MIR está centrado y use una tarjeta NIR para ubicar las posiciones NIR.
      NOTA: Después de la superposición, se puede utilizar la viga NIR para guiar ambas vigas.
    2. Dirija los haces superpuestos a un microscopio invertido con un escáner de haz resonante de un solo eje integrado de 325 Hz (montado en un escáner integrado de dos posiciones (I2PS), Figura 1B) (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: El escáner resonante proyecta una línea de los dos haces superpuestos en la abertura posterior del objetivo del condensador. Está montado en un control deslizante que permite la reconfiguración perfecta entre las modalidades VSFG/SHG y de campo claro.
    3. Enfoque los dos haces superpuestos espacialmente en la muestra con un objetivo de Schwarzschild puramente reflectante (SO, Figura 1B,D) (ver Tabla de Materiales).
    4. Recoja la señal VSFG generada por la muestra con un objetivo refractivo corregido al infinito (RO, Figura 1B, D) (consulte la Tabla de materiales).
    5. Guíe la señal VSFG de salida colimada a través de un polarizador lineal y luego a través de un sistema de lentes de tubo telecéntrico compuesto por dos lentes focales f = 60 mm (TL1 y TL2, Figura 1B, C) (ver Tabla de Materiales).
      NOTA: La imagen ampliada de las lentes de tubo se forma en la ranura de entrada del monocromador (MC, Figura 1B, C), y los datos resueltos espacialmente/frecuencia se detectan en un detector CCD bidimensional (CCD, Figura 1B).
  5. Modo SHG
    1. Para cambiar a imágenes SHG, bloquee el haz IR y gire la rejilla del espectrógrafo a 501,5 nm para obtener imágenes de la señal SHG.
  6. Modo de campo claro
    1. Para cambiar a imágenes ópticas de campo claro, encienda la fuente de luz blanca (consulte la Tabla de materiales). Mueva el control deslizante integrado (I2PS, Figura 1B) para recopilar imágenes de campo claro en la dirección contrapropagadora, con el objetivo de imagen (RO) actuando como condensador y el objetivo de condensador (SO) actuando como objetivo de imagen.
    2. Forme una imagen de la salida colimada del objetivo refractivo en el plano del sensor de una cámara de campo claro RGB utilizando un sistema de lente de tubo disponible en el mercado (consulte la Tabla de materiales).

Figure 1
Figura 1: Microscopio VSFG hiperespectral multimodal. (A) Vista superior de la configuración principal. Se envió un láser de bomba de 1025 nm a un OPA para generar un pulso de infrarrojo medio sintonizable. Los 1025 nm residuales se estrechaban con frecuencia con un etalón (E) y se filtraban espacialmente en un haz gaussiano mediante un filtro espacial (SFG). Los haces de infrarrojo medio y de 1025 nm se superponen espacialmente en un espejo dicroico (DM) personalizado y se guían a través del microscopio invertido (región encajonada en A). (B) Los dos haces se envían a un escáner de haz resonante de 325 Hz montado en un control deslizante integrado de 2 posiciones (I2PS), lo que permite cambiar sin problemas entre las modalidades ópticas de campo claro y no lineales. La plataforma del microscopio está equipada con un objetivo Schwarzschild (SO) con corrección al infinito basado en la reflexión que actúa como condensador y un objetivo de imagen (RO) con corrección al infinito basado en la refracción montado en una platina del eje z de nanoposicionamiento vertical (VNP). El SO enfoca la línea de haces entrantes que el escáner de haz resonante refleja en la muestra mientras que el RO recopila la sección de señales de la línea VSFG. Es importante controlar con precisión la posición del eje z de la ósmosis inversa con una precisión de 1 μm para garantizar que la muestra esté en las mejores condiciones focales para obtener imágenes de alta calidad. La línea colimada de la señal VSFG se dirige a un sistema de lentes de tubo compuesto por 2 lentes de tubo (TL1 y TL2), formando una imagen ampliada en la rendija de entrada del monocromador (MC). A continuación, se obtiene una imagen hiperespectral de la línea de espectros con resolución de frecuencia en un dispositivo de carga acoplada (CCD). Después de recolectar cada línea hiperespectral, la muestra se escanea en el eje perpendicular al eje de escaneo del escáner de haz resonante utilizando el NP. Para recoger imágenes de campo claro de la muestra, el I2PS se mueve a la posición de campo claro y se instala un espejo que intercepta la fuente de luz blanca (WLS). A continuación, la luz es enfocada por el RO y fotografiada por el SO. A continuación, se forma una imagen en el plano del sensor de la cámara de campo claro (BC) en la parte superior del microscopio invertido. (C) Vista detallada de la trayectoria óptica a través del área de la lente del tubo hacia el MC y el CCD. (D) Vista detallada del área de muestra entre el SO y el RO. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Alineación del microscopio hiperespectral y calibración espacial del eje CCD vertical

  1. Optimice aproximadamente la posición del plano de la muestra (eje z del nanoposicionador) utilizando una muestra estándar de ZnO (1 μm de grosor) con recubrimiento catódico de patrón de 15 mm x 15 mm x 0,170 mm ± cubreobjetos de 0,005 mm y llevándolo al enfoque de campo claro utilizando la modalidad de imágenes de campo claro.
    NOTA: Es posible que sea necesario ajustar la posición z de la RO, así como la alineación de la luz blanca, según sea necesario. En la Figura 2 se muestra una imagen representativa del ZnO en el patrón de vidrio utilizado para la calibración de la alineación.
  2. Mueva el I2PS de nuevo al brazo de iluminación no lineal y optimice la altura de la muestra para la intensidad máxima de VSFG no resonante generada por las regiones de ZnO observadas en la cámara CCD.
    NOTA: La posición z del RO debe ajustarse para obtener la máxima intensidad. Es posible que haya que iterar los pasos 2.1 y 2.2 varias veces antes de que se alcance la altura óptima de la muestra y la ósmosis inversa.
  3. Encienda el escáner de haz resonante y recopile una línea de las imágenes.
  4. Recopile imágenes de intensidad no resonante escaneando la muestra perpendicularmente a la dirección del escáner de haz. Tome cortes verticales de los datos de la imagen y establezca la relación píxel:micras. (consulte la Figura 3 y su leyenda).
    NOTA: La derivada de estas secciones de línea se analiza para producir la relación píxel:micras del eje CCD vertical que se utilizará para futuras imágenes.

Figure 2
Figura 2: Calidad de imagen representativa para la alineación aproximada de la modalidad de imágenes de campo claro de un patrón de ZnO. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Flujo de trabajo de calibración del eje vertical. Esta figura ilustra cómo convertir los píxeles CCD a dimensiones espaciales verticales en la unidad de μm. (A) Se recopila y reconstruye una imagen del cubreobjetos con patrón de ZnO. Luego, la distancia en píxeles de uno a los otros bordes del patrón (pequeña barra vertical en A). Debido a que la cruz del patrón de ZnO está diseñada para tener un ancho de 25 μm, se puede usar la relación entre el ancho físico y el ancho de píxel aquí para calcular la relación de dimensión física/píxel. En (B) se muestra una imagen representativa calibrada del eje vertical. (C) Por último, se toma un corte vertical como lo indica la línea roja. (D) Se toma la derivada de la rebanada vertical para obtener la resolución espacial. La derivada de la rebanada vertical se utiliza para obtener la resolución espacial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Recopilación de datos hiperespectrales

  1. Recopile los espectros de una línea vertical de las señales VSFG en el CCD, cuyos espectros se dispersan a lo largo del eje horizontal y las posiciones espaciales se registran en el eje vertical del CCD.
    NOTA: Esto da como resultado un conjunto de datos bidimensional para una sección de una sola línea.
  2. Después de obtener imágenes hiperespectrales de la sección de línea de la muestra, escanee la muestra en el eje perpendicular al eje de escaneo de línea utilizando el nanoposicionador tridimensional (NP, Figura 1).
    NOTA: El nanoposicionador 3D es importante para una alta precisión y reproducibilidad en la localización de regiones de muestra (plano x-y), así como para enfocar la muestra (eje z).
  3. Itere entre los pasos 3.1 y 3.2 para recopilar una imagen hiperespectral VSFG.

4. Análisis de datos hiperespectrales

  1. Desmezcle espectralmente los datos utilizando el flujo de trabajo de la biblioteca de imágenes hiperespectrales de la caja de herramientas de imágenes de MatLab41.
    NOTA: La desmezcla espectral correlaciona las ubicaciones espaciales con espectros únicos. El código de Matlab para el análisis de datos hiperespectrales se proporciona en el Archivo Suplementario 1.
    1. Cree un hipercubo de 4 dimensiones (x = espacial, y = espacial, z = intensidad dependiente de la frecuencia, ω = frecuencia) utilizando la función de hipercubo en la biblioteca de imágenes hiperespectrales de la caja de herramientas de procesamiento de imágenes de Matlab41.
    2. Identifique el número de espectros únicos con la función countEndmembersHFC con un valor de probabilidad de falsa alarma (PFA) de 10-7.
    3. Identifique espectros únicos utilizando la función de desmezcla espectral nfindr .
    4. Finalmente, usando la función sid , asocie cada píxel con uno de los espectros únicos identificados en el paso anterior.
      NOTA: Se pueden realizar métodos adicionales de desmezcla y coincidencia espectral con funciones/algoritmos alternativos ofrecidos en la Biblioteca de imágenes hiperespectrales de MatLab41.
  2. Ajuste los datos de suma de cada hoja aislada a la función de Voigt42 (Archivo suplementario 1).
    NOTA: La función lorentziana representa el límite de forma de línea homogénea pura, mientras que la función gaussiana se origina a partir de límites no homogéneos. En realidad, los sistemas podrían estar en una combinación de límites homogéneos y no homogéneos, lo que requiere una función de Voigt, una práctica común para la espectroscopia de fase condensada, incluida la VSFG.

5. Análisis geométrico de la muestra

  1. Determine la geometría de las muestras siguiendo el procedimiento mencionado en los pasos 5.2-5.3. En este estudio, se utiliza como ejemplo el SDS@2 β-CD. Derivar los elementos tensoriales permitidos por simetría de χ(2) basándose en la simetría C7 de la subunidad molecular de la muestra de mesohojas de SDS@2 β-CD.
    NOTA: La simetría permitida χ(2) depende de la simetría. Para calcular la susceptibilidad no lineal permitida de cualquier simetría, consulte la referencia43.
  2. Aplique la rotación de Euler27 para relacionar las mediciones del marco de laboratorio con el marco molecular.
    NOTA: En el caso de SDS@2 β-CD, su simetría C7 conduce a ocho ecuaciones independientes que relacionan 8 salidas (marco de laboratorio χ(2)) con 8 entradas (6 hiperpolarizabilidad independientes β(2), y dos ángulos: Θ, el ángulo de inclinación relativo al plano de muestra de todas las hojas, y φ, la rotación en el plano de la hoja (Figura 4)). Se utilizan dos láminas para extraer las alineaciones moleculares comunes de las dos láminas. Las relaciones entre φ1 y φ2 (ángulo de rotación en el plano de las dos hojas) se pueden extraer de las imágenes de campo claro. En el ejemplo actual, φ2 = φ1 + 60°. Se supone que todas las unidades moleculares se colocan en el mismo ángulo, por lo que Θ1 = Θ2. Esto da como resultado 11 incógnitas (9 independientes, incluidas 6 hiperpolarizabilidad independientes β(2), Θ 1 y φ1, y la relación de cobertura relativa entre las hojas N y los dos ángulos dependientes, que sonφ 2 y Θ 2) para 16 conocidos (8 polarizaciones de marco de laboratorio por hoja y dos hojas).
  3. Relacione el marco de laboratorio χ(2) resuelto por polarización y la hiperpolarizabilidad del marco molecular β(2) con un solucionador de funciones de red neuronal.
    NOTA: Un resumen detallado de este enfoque se puede encontrar en la referencia27.
    1. Cree un modelo de red neuronal en capas en Python44utilizando Keras compuesto por una estructura de nodos 200-100-50 y una función de activación de tangente hiperbólica.
    2. Cree una matriz de 100000 x 11 generada aleatoriamente con valores de β(2), Θ 1, Θ 2, φ1, φ 2 y N. Calcule el marco de laboratorio correspondiente 16 χ(2), utilizando la ecuación determinada en 5.2 por rotaciones de Euler.
    3. Utilice los valores calculados de χ(2) (un total de 100.000 por 16 valores) como entrada y aprenda a predecir 11 valores (β(2), Θ 1, Θ 2, φ1, φ 2 y N) cuando se proporcionen 16 valores de χ(2).
    4. Una vez entrenado, use otro conjunto de 1000 entradas con las entradas y salidas para probar el modelo entrenado. La salida predicha y la salida real deben mostrar una relación lineal con una pendiente de 1.
    5. Por último, suministre el χ(2) medido experimentalmente a partir de dos hojas (cada hoja tiene 8 χ(2 ) medidas) y use el modelo entrenado para predecir el ángulo de inclinación Θ, junto con otras propiedades.

Figure 4
Figura 4: Ilustración de la transformación de Euler. (A) Ilustración de la transformación de Euler entre la susceptibilidad de segundo orden χ(2) de las coordenadas de laboratorio (XYZ) y la hiperpolarizabilidad de las coordenadas moleculares (xyz) βijk. z-y'-z'' La rotación de Euler se realiza en las coordenadas moleculares, siendo φ como el ángulo de rotación en el plano, θ como el ángulo de inclinación y ψ como el ángulo de torsión. ψ está integrado para ángulos de torsión arbitrarios sobre el eje molecular. φ no se integra porque todas las moléculas giran en un ángulo específico en relación con el marco del laboratorio para formar las láminas autoensambladas. N es la cobertura relativa de la superficie de las dos hojas. (B) Visualización de las subunidades inclinadas que forman una hoja determinada por los resultados de la red neuronal. Esta figura ha sido modificada a partir de Wagner et al.27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Representative Results

Figure 5
Figura 5: Estructura molecular, morfología y orientación potencial del SDS@β-CD. (A) Vista superior y (B) vista lateral de la estructura química del SDS@β-CD. (C) Distribución muestral heterogénea representativa de las láminas de mesoescala en el plano muestral. La subunidad molecular podría tener diferentes orientaciones y alineaciones en el sustrato, lo cual se desconoce. Esta figura ha sido modificada a partir de Wagner et al.27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La capacidad del microscopio para discriminar entre estructuras moleculares organizadas de forma única y masa isotrópica se demuestra con la muestra de SDS@2 β-CD23,34 (Figura 5). En este estudio, la muestra se preparó mediante la adición de β-CD y SDS al agua desionizada (DI) en una proporción de 2:1 hasta que los dos solutos alcanzaron una concentración de 10% m/m. Luego, la suspensión se calentó hasta la claridad y se enfrió a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió CuCl 2 a una concentración de 1:10 CuCl2:SDS para ajustar las interacciones electrostáticas y se dejó reposar la mezcla durante 3-5 días para que se formaran completamente las mesoláminas de SDS@2 β-CD. Por último, se produjeron mesoláminas aisladas mediante la colada por caída de 5 μL de la suspensión de la lámina sobre un cubreobjetos de 15 mm x 15 mm x 0,170 mm ± 0,005 mm fijado a una máquina de recubrimiento giratorio que funciona a 10.000 rpm.

Las láminas de mesoescala formadas a partir de su autoensamblaje con una simetría específica de C7. Sin embargo, no está clara la orientación molecular de la unidad molecular única en este autoensamblaje, un conocimiento fundamental que puede influir en las funciones materiales. (Figura 5C). Se capturaron imágenes VSFG de las hojas autoensambladas dispersas en un cubreobjetos (Figura 6A). A través de la identificación espectral (paso 4 Análisis de datos hiperespectrales) utilizando la función de imágenes hiperespectrales de Matlab, se encontró que todas las hojas se pueden clasificar en dos tipos, una con mayor intensidad VSFG (espectros azules en la Figura 6B y hojas etiquetadas en azul en la Figura 6A) y la otra con menor intensidad. Al inspeccionar y comparar con la imagen óptica (Figura 6C, D), la hoja grande en el centro de las imágenes parecía tener hojas dobles apiladas, atribuyendo así la menor intensidad de VSFG debido a la interferencia destructiva entre las dos hojas de orientación diferentes. La hoja única se enfocó para extraer la orientación de la unidad molecular única (las azules en la Figura 6A). Dos de las hojas (resaltadas en cuadrados rojos y azules en la Figura 6A) se midieron mediante varias polarizaciones VSFG, y los espectros se ajustaron utilizando las funciones de Voigt. Tenga en cuenta que la polarización VSFG se describe en la señal de orden, la conversión ascendente y la MIR. Por ejemplo, SSP significa polarización P de IR, polarización S de conversión ascendente y polarización S de señales.

Figure 6
Figura 6: Superposición de imágenes VSFG resueltas por polarización con modalidad de campo claro. (A) Imagen VSFG hiperespectral resuelta por polarización (SSS) de SDS@2 β-CD. Los colores púrpura y rosa representan áreas donde residen diferentes espectros, y los espectros correspondientes se trazan en (B), que son espectros representativos para píxeles individuales con una relación señal-ruido para los espectros azul y magenta ~56 y ~26, respectivamente. Las hojas de los cuadros rojo y azul se analizan explícitamente a continuación para extraer los ángulos de inclinación de la supramolécula. (C) Imagen de campo claro de la misma área que la de (A). (D) Imagen hiperespectral VSFG superpuesta con una imagen óptica de un área idéntica. (E) De izquierda a derecha: espectros resueltos de polarización PPS, PPP, SSP y SSS sumados en 180 y 480 píxeles dentro de las dos hojas individuales resaltadas en recuadros rojos y azules en (A). Todos los espectros tenían una característica dominante centrada aproximadamente a 2910 cm-1 y una relación señal-ruido del orden de 1000. Los espectros se equiparon con múltiples funciones de Voigt, que fueron representadas por las áreas sombreadas, y se utilizaron para un análisis posterior de la orientación. Esta figura ha sido modificada a partir de Wagner et al.27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Luego, para extraer las orientaciones moleculares, primero se determinó la hiperpolarizabilidad permitida por simetría, Equation 1 permitida por la regla de selección de simetría, utilizando el procedimiento previamente publicado43. Entonces, la relación entre el marco de laboratorio y el marco molecular se deriva de la rotación de Euler27. A continuación, se extrae el ángulo de inclinación θ utilizando el método de red neuronal descrito anteriormente, y se encontró que el ángulo de inclinación era de ~23° (Figura 6).

Por último, se muestra la capacidad de la imagen multimodal en esta plataforma37(Figura 7). Aquí se estudian tres muestras diferentes, a saber, SDS@2 β-CD, colágeno y L-fenilalanil-L-fenilalanina (FF), con el microscopio con modalidades de imágenes de campo claro, SHG y VSFG. En primer lugar, todas las muestras mostraron morfologías similares en diferentes modalidades de imagen. Tanto SHG como VSFG mostraron variaciones de intensidad espacialmente, lo que falta en las imágenes ópticas. Debido a que tanto SHG como VSFG requieren estructuras ordenadas no centrosimétricas, la variación en la intensidad de la señal podría provenir de variaciones en el orden molecular local o en las orientaciones moleculares. A diferencia de SHG, se puede ajustar el haz MIR de VSFG para que resuene con diferentes modos de vibración. En el caso que aquí se muestra, se estudiaron los modos vibracionales CHx a 3,5 μm y el modo Amid-I a 6 μm. Para FF, se obtuvieron imágenes VSFG con señales fuertes y uniformes, lo que sugiere una estructura autoensamblada bien ordenada para todos los grupos vibracionales, de acuerdo con su naturaleza cristalina. Por el contrario, la muestra de colágeno mostró una señal VSFG más fuerte en la región CHx que en la región Amida, lo que indica que las muestras son flexibles y sus grupos vibratorios tienen diferentes grados de orden.

Figure 7
Figura 7: Imágenes multimodales de tres muestras diferentes. (Un i-A iii) SDS@2 β-CD de campo claro, SHG (polarización PP) y VSFG (polarización PPP) de imágenes de la región de 3,5 μm, respectivamente. Las imágenes no lineales se superponen con imágenes de campo claro. Las estructuras químicas de SDS y 2β-CD se muestran en el recuadro de ai. (B i-B iv) Campo claro de colágeno liofilizado, SHG (polarización PP), VSFG (polarización PPP) de regiones de 3,5 μm y 6 μm respectivamente. La estructura química del residuo del trímero proteico primario del colágeno, compuesto por glicina, prolina e hidroxiprolina, se muestra en el recuadro de Bi. (C i-Civ) FF de campo claro, SHG (polarización PP) y VSFG (polarización PPP) de regiones de 3,5 μm y 6 μm respectivamente. La estructura química de las subunidades moleculares FF se muestra en el recuadro de ci. Todas las imágenes de 6 μm se toman en un entorno de instrumento de nitrógeno purgado para eliminar la atenuación de la humedad del aire ambiente. SDS@2 β-CD no tiene una imagen VSFG a 6 μm porque no tiene grupos de amidón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Código de Matlab para el análisis de datos hiperespectrales Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Los pasos más críticos son de 1,42 a 1,44. Es fundamental alinear bien la lente del objetivo para obtener una resolución espacial óptica. También es importante recoger la señal emitida, retransmitir y proyectar el haz de escaneo como una línea en las rendijas de entrada. Las alineaciones adecuadas garantizarían la mejor resolución y la mejor relación señal-ruido. Para una muestra típica, como hojas de SDS@2 β-CD de 100 μm por 100 μm, una imagen de buena resolución (~1 μm de resolución) con una alta relación señal-ruido tardaría 20 minutos. Esto ya es más rápido que la versión anterior del instrumento24,26. Se puede mejorar aún más la velocidad de adquisición de datos mediante un láser de mayor tasa de repetición.

La limitación actual es la resolución espacial, que podría mejorarse aún más con una óptica objetiva de NA aún más alta y posibles técnicas de superresolución basadas en ópticas no lineales45. La detección heterodina se ha aplicado en espectroscopía VSFG para resolver su fase y extraer las orientaciones moleculares 5,46,47,48. Esto es técnicamente factible en nuestro experimento. Sin embargo, las imágenes VSFG se basan naturalmente en la dispersión de la señal fuera de la muestra, lo que altera su fase y, por lo tanto, complica las relaciones entre la orientación molecular y la fase de la señal VSFG.

La obtención de imágenes de la morfología de los materiales con especificidad química es un reto porque muchas técnicas de obtención de imágenes carecen de sensibilidades moleculares. La microscopía VSFG hiperespectral rápida llena este vacío al sondear las firmas vibracionales moleculares y revelar alineaciones moleculares de materia organizada a mesoescala que son importantes en la ciencia de los materiales, la química y la biología. En el futuro, la naturaleza reflectante de la óptica de iluminación permitirá que otras técnicas se integren en el instrumento central, aumentando aún más sus capacidades y permitiendo imágenes multimodales de muestras químicas, biológicas y materiales.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El desarrollo del instrumento cuenta con el apoyo de la subvención NSF CHE-1828666. ZW, JCW y WX cuentan con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales, Subvención 1R35GM138092-01. BY cuenta con el apoyo de la Asociación de Promoción de la Innovación Juvenil de la Academia China de Ciencias (CAS, 2021183).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Camera Por Thorlabs WFA4100 connect a camera to a microscope or optical system
25.0 mm Right-Angle Prism Mirror, Protected Gold Thorlabs MRA25-M01 reflect light and produce retroreflection, redirecting light back along its original path
3” Universal Post Holder-5 Pack Thorlabs UPH3-P5 hold and support posts of various sizes and configurations
30 mm to 60 mm Cage Plate, 4 mm Thick Thorlabs LCP4S convert between a 30 mm cage system and a 60 mm cage system
500 mm Tall Cerna Body with Epi Arm Thorlabs CEA1500 provide the function of enabling top illumination techniques in microscopy
60 mm Cage Mounted Ø50.0 mm Iris Thorlabs LCP50S control the amount of light passing through an optical system
60 mm Cage Mounting Bracket Thorlabs LCP01B mount and position a 60 mm cage system in optical setups
Air spaced Etalon SLS Optics Ltd. Customized generate narrow-band 1030 nm light 
Cage Plate Mounting Bracket Thorlabs KCB2 hold and adjust mirrors at a precise angle
CCD Andor Technologies Newton  2D CCD for frequency and spatial resolution
Collinear Optical Parametric Amplifier Light Conversion Orpheus-One-HP Tunable MID light generator
Copper Chloride Thermo Fischer Scientific A16064.30 Self-assembly component
Customized Dichroic Mirror Newport Customized selectively reflects or transmits light based on its wavelength or polarization
Ext to M32 Int Adapter Thorlabs SM1A34 provide compatibility and facilitating the connection between components with different thread types
Infinity Corrected Refractive Objective Zeiss 420150-9900-000 Refractive Objective
Infinity Corrected Schwarzschild Objective Pike Technologies Inc. 891-0007 Reflective objective
Laser Carbide, Light-Conversion C18212 Laser source
M32x0.75 External to Internal RMS Thorlabs M32RMSS adapt or convert the threading size or type of microscope objectives 
M32x0.75 External to M27x0.75 Internal Engraving Thorlabs M32M27S adapt or convert the threading size or type of microscope objectives 
Manual Mid-Height Condenser Focus Module Thorlabs ZFM1030 adjust the focus of an optical element
Monochromator Andor Technologies Shamrock 500i Provides frequency resolution for each line scan
Motorized module with 1" Travel for Edge-Mounted Arms Thorlabs ZFM2020 control the vertical positon of the imaging objective
Nanopositioner Mad City Labs Inc. MMP3 3D sample stage
Resonant Scanner EOPC SC-25 325Hz resonant beam scanner
RGB Color CCD Camera Thorlabs DCU224C Brightfield camera, discontinued but other cameras will work just as well
RGB tube lens Thorlabs ITL200 white light collection
Right Angle Kinematic Breadboard Thorlabs OPX2400 incorporate a sliding mechanism with two fixed positions
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 30 mm Thorlabs KCB1 hold and adjust mirrors at a precise angle
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 60 mm Thorlabs KCB2 hold and adjust mirrors at a precise angle
SM2, 60 mm Cage Arm for Cerna Focusing Stage Thorlabs CSA2100 securely mount and position condensers
Snap on Cage Cover for 60 mm Cage, 24 in Long, Thorlabs C60L24 enclose and protect the components inside the cage
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fischer Scientific J63394.AK Self-assembly component
Three-Chnnale Controller and Knob Box for 1" Cerna Travel Stages Thorlabs MCM3001 control ZFM2020
Tube lens Thorlabs LA1380-AB - N-BK7 SFG signal collection
Visible LED Set Thorlabs WFA1010 provide illumination in imaging setup
Whitelight Source Thorlabs WFA1010 Whitelight illumination source for brightfield imaging
WPH05M-1030 - Ø1/2" Zero-Order Half-Wave Plate, Ø1" Mount, 1030 nm  Thorlabs WPH05M-1030 alter the polarization state of light passing through it
WPLQ05M-3500 - Ø1/2" Mounted Low-Order Quarter-Wave Plate, 3.5 µm  Thorlabs WPLQ05M-3500 alter the polarization state of light passing through it
X axis Long Travel Steel Extended Contact Slide Stages Optosigma TSD-65122CUU positioning stages that offer extended travel in the horizontal (X) direction
XT95 4in Rail Carrier Thorlabs XT95RC4 mount and position optical components
X-Y Axis Translation Stage w/ 360 deg. Rotation Thorlabs XYR1 precise movement and positioning of objects in two dimensions, along with the ability to rotate the platform
XY(1/2") Linear Translator with Central SM1 Thru Hole Thorlabs XYT1 provide precise movement and positioning in two dimensions
Yb doped Solid State Laser Light Conversion CB3-40W Seed laser
β-Cyclodextrin Thermo Fischer Scientific J63161.22 Self-assembly component

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Imágenes químicas hiperespectrales no lineales multimodales mediante microscopía de generación de suma de frecuencia vibracional de barrido lineal
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Wagner, J. C., Yang, B., Wu, Z., Xiong, W. Multimodal Nonlinear Hyperspectral Chemical Imaging Using Line-Scanning Vibrational Sum-Frequency Generation Microscopy. J. Vis. Exp. (202), e65388, doi:10.3791/65388 (2023).

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