Summary
Her presenterer vi ekstraksjon og fremstilling av polare og semipolare metabolitter fra en korallholobiont, samt separert korallvertsvev og Symbiodiniaceae-cellefraksjoner, for gasskromatografi-massespektrometrianalyse.
Abstract
Gasskromatografi-massespektrometri (GC-MS) -baserte tilnærminger har vist seg å være kraftige for å belyse det metabolske grunnlaget for cnidar-dinoflagellatsymbiosen og hvordan koraller reagerer på stress (dvs. under temperaturindusert bleking). Steady-state metabolittprofilering av korallholobiont, som består av cnidarian verten og tilhørende mikrober (Symbiodiniaceae og andre protister, bakterier, archaea, sopp og virus), har blitt vellykket brukt under omgivelses- og stressforhold for å karakterisere korallens holistiske metabolske status.
For å svare på spørsmål rundt symbiotiske interaksjoner, er det imidlertid nødvendig å analysere metabolittprofilene til korallverten og dens algesymbionter uavhengig, noe som kun kan oppnås ved fysisk separasjon og isolering av vevet, etterfulgt av uavhengig ekstraksjon og analyse. Mens anvendelsen av metabolomikk er relativt ny for korallfeltet, har vedvarende innsats fra forskningsgrupper resultert i utvikling av robuste metoder for å analysere metabolitter i koraller, inkludert separasjon av korallvertsvev og algesymbionter.
Denne artikkelen presenterer en trinnvis veiledning for holobiontseparasjon og ekstraksjon av metabolitter for GC-MS-analyse, inkludert viktige optimaliseringstrinn for vurdering. Vi demonstrerer hvordan, når den er analysert uavhengig, er den kombinerte metabolittprofilen til de to fraksjonene (korall og Symbiodiniaceae) lik profilen til hele (holobiont), men ved å separere vevene, kan vi også få nøkkelinformasjon om metabolismen av og interaksjoner mellom de to partnerne som ikke kan oppnås fra helheten alene.
Introduction
Metabolitter representerer sluttproduktene av cellulære prosesser, og metabolomics - studiet av suiten av metabolitter produsert av en gitt organisme eller økosystem - kan gi et direkte mål på organismefunksjon1. Dette er spesielt viktig for å utforske økosystemer, symbiotiske interaksjoner og restaureringsverktøy, da målet med de fleste forvaltningsstrategier er å bevare (eller gjenopprette) spesifikke økosystemtjenestefunksjoner2. Korallrev er et akvatisk økosystem som demonstrerer den potensielle verdien av metabolomikk for å belyse symbiotiske interaksjoner og knytte korallfysiologiske responser til virkninger på samfunnsnivå og økosystemnivå3. Anvendelsen av gasskromatografi-massespektrometri med høy gjennomstrømning (GC-MS) er spesielt verdsatt på grunn av dens evne til raskt å analysere et bredt spekter av metabolittklasser samtidig med høy selektivitet og følsomhet, gi rask identifikasjon av forbindelser når spektralbiblioteker er tilgjengelige, og gi et høyt nivå av reproduserbarhet og nøyaktighet, med en relativt lav kostnad per prøve.
Koraller er holobionter som består av koralldyret, fotosyntetiske dinoflagellatendosymbionter (familie: Symbiodiniaceae4), og et komplekst mikrobiom 5,6. Samlet sett opprettholdes holobiontens egnethet primært gjennom utveksling av små molekyler og elementer for å støtte den metabolske funksjonen til hvert medlem 7,8,9,10. Metabolomiske tilnærminger har vist seg spesielt kraftige for å belyse det metabolske grunnlaget for symbiosespesifisitet9,11, blekingsresponsen på termisk stress 7,8,12,13, sykdomsresponser 14, forurensningseksponeringsresponser 15, fotoakklimatisering 16 og kjemisk signalering 17 i koraller, samt hjelpe til med biomarkøroppdagelse 18,19. I tillegg kan metabolomikk gi verdifull bekreftelse på konklusjonene utledet fra DNA- og RNA-baserte teknikker 9,20. Det er derfor et betydelig potensial for bruk av metabolomics for å vurdere revets helse og utvikle verktøy for bevaring av rev3, for eksempel gjennom påvisning av metabolske biomarkører for stress18,19 og for å undersøke potensialet for aktive forvaltningsstrategier som ernæringssubsidier21.
Å separere verts- og symbiontcellene og analysere deres metabolittprofiler uavhengig, i stedet for sammen som holobiont, kan gi mer informasjon om partnerinteraksjonene, uavhengige fysiologiske og metabolske statuser og potensielle molekylære mekanismer for tilpasning 11,12,22,23,24. Uten å skille koraller og Symbiodiniaceae, er det nesten umulig å belyse bidraget og metabolismen av koraller og / eller Symbiodiniaceae uavhengig, bortsett fra med kompleks genomrekonstruksjon og metabolsk modellering25, men dette har ennå ikke blitt brukt på korall-dinoflagellatsymbiosen. Videre kan forsøk på å trekke ut informasjon om den individuelle metabolismen til verten eller algesymbionten fra metabolittprofilen til holobionten føre til feiltolkning.
For eksempel, inntil nylig, ble tilstedeværelsen av C18: 3n-6, C18: 4n-3 og C16 flerumettede fettsyrer i ekstrakter fra koraller og holobiont vev antatt å være avledet fra algesymbioten, da koraller ble antatt å ikke ha ωx desaturaser som er essensielle for produksjon av omega-3 (ω3) fettsyrer; Nylige genomiske bevis tyder imidlertid på at flere nesledyr har evnen til å produsere ω3 PUFA de novo og videre biosyntetisere ω3 langkjedede PUFA26. Kombinere GC-MS med stabil isotopmerking (f.eks. 13 C-bikarbonat, NaH 13CO 3) kanbrukes til å spore skjebnen til fotosyntetisk fast karbon gjennom korallholobiont metabolske nettverk under både kontrollforhold og som svar på eksterne stressorer27,28. Imidlertid er et kritisk skritt i sporingen av 13 C-skjebnen separasjonen av korallvevet fra algecellene - først da kan tilstedeværelsen av en 13C-merket forbindelse i korallvertsfraksjonen utvetydig tildeles som en Symbiodiniaceae-avledet metabolitt translokalisert til korallen eller et nedstrømsprodukt av en translokalisert merket forbindelse. Denne teknikken har vist sin kraft ved å utfordre den langvarige antagelsen om at glyserol er den primære formen der fotosyntat overføres fra symbiont til vert29, samt å belyse hvordan ernæringsfluks mellom partnere endres under bleking27,28 og som svar på inkompatible Symbiodiniaceae-arter11.
Mens beslutningen om å skille vev primært drives av forskningsspørsmålet, er praktisk, pålitelighet og potensielle metabolske virkninger av denne tilnærmingen viktig å vurdere. Her gir vi detaljerte, demonstrerte metoder for ekstraksjon av metabolitter fra holobiont, samt separate verts- og symbiontfraksjoner. Vi sammenligner metabolittprofilene til verten og symbionten uavhengig av hverandre og hvordan disse profilene er sammenlignet med holobiont-metabolittprofilen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Den eksperimentelle designen, prøveinnsamlingen og lagringen er beskrevet i detalj andre steder 2,30,31. Tillatelse til innsamling av ville koraller må innhentes før innsamling og eksperimentering. Prøvene her ble samlet inn fra kolonier av Montipora mollis (grønn fargemorf) importert fra Batavia Coral Farms (Geraldton, WA), opprinnelig samlet inn fra et rev utenfor Abrohlosøyene (Western Australia; 28°52'43.3"S 114°00'17.0"E) på en dybde på 1 m under akvakulturlisensen AQ1643. Før prøvetaking ble koloniene holdt i et 800 l akvarium ved 35 PSU, under blått og hvitt lys ved 150 μmol fotoner·m−2·s−1, og ved 25 °C ± 0,5 °C i 3 måneder. Korallfragmentene (~5 cm2, N = 6) ble snapfrosset i flytende nitrogen og lagret ved −80 °C frem til prosessering.
1. Klargjøring av avsugsløsninger og utstyr
- Minst 1 dag før fjerning av korallvev, klargjør ekstraksjonsløsninger og utstyr.
- Forkjøl ultrarent vann i rent, vaskemiddelfritt glass ved 4 °C.
- Bland 100 % metanol av LC-kvalitet med en 10 μg·mL−1 endelig konsentrasjon av egnede interne standard(er) (f.eks. 13C6 sorbitol).
- Lag en 50% metanolekstraksjonsløsning med halv 100% LC-kvalitet metanol og halvparten ultrarent vann. Oppbevar begge metanoloppløsningene ved -20 °C.
MERK: For å forhindre nedbrytning av metabolittene anbefales det å utføre prøvebehandlingstrinnene i grupper på fem korallfragmenter om gangen, med en ekstra biologisk (bare vann) blank (totale prøver N = 6). Når hver korallprøve er separert i de to fraksjonene (korallvertsvev, heretter "Host" og mikroalgeceller, heretter "Symbiont"), vil det totale antall prøver i en behandlingsbatch være 12.
2. Korallmetabolisme slukking
MERK: Den eksperimentelle designen, prøveinnsamlingen og lagringen er beskrevet i detalj andre steder 2,30,31. Det skal imidlertid bemerkes at tiden det tar å slukke metabolismen (dvs. tiden mellom korallprøveinnsamling og bevaring) er avgjørende for å fange den opprinnelige responsen30. Ta vare på prøven så raskt som mulig etter innsamling for å forhindre endringer i metabolittsammensetningen på grunn av nedbrytning av prøven eller ikke-målfysiologiske responser32.
- Legg korallfragment i en steril prøveoppsamlingspose, og tøm overflødig sjøvann så mye som mulig. Senk prøven i flytende nitrogen i minst 30 s. Flytt prøvene så snart som mulig til en fryser på −80 °C for oppbevaring.
MERK: Prøver kan fryses ved -80 ° C i lysblokkerte beholdere til behandling, unngå fryse-tine-sykluser.
3. Fjerning av korallvev fra skjelettet
MERK: Prøvene skal alltid oppbevares på is (4 °C) for å sikre at de samtidig er i flytende form og samtidig forhindrer kontinuerlig metabolisme.
- Legg en ren, steril prøveoppsamlingspose på is slik at posen er stabil og åpen oppå isen i en grunn brønn, men ikke er nedsenket i isen. Tilsett 10 ml kaldt (4 °C) ultrarent vann i posen.
MERK: Dette vil bidra til å unngå gjentatt frysetining av korallfragmentet på grunn av kald trykkluft og omgivende is. - Velg et korallfragment med sterilisert pinsett, og skyll med kaldt (4 °C) ultrarent vann med en steril Pasteur-pipette til det ikke er rester av sjøvann. Senk det skyllede korallfragmentet i posen som inneholder 10 ml ultrarent vann.
MERK: Denne skyllingen er avgjørende for å fjerne eventuelle gjenværende salter som kan forstyrre nedstrømsanalysen. Unngå håndkontakt med vannet eller korallfragmentet gjennom posen for å holde prøven ved 4 °C. - Teip en steril 1 ml pipettespiss over enden av en luftpistol med elektrisk tape, med ~5 mm kuttet av enden av spissen (figur 1A).
- Rett luftpistolen mot korallfragmentet med posen halvt forseglet og luftstrømmen på lavt medium for å forsiktig fjerne vevet ved å oppmuntre til en sirkulær bevegelse av vannet over korallfragmentet.
- Etter ~ 3 min, eller når alt vevet ser ut til å ha blitt fjernet fra skjelettet, slå av luften, og fjern airbrush. Lukk posen helt.
- Klem alt fjernet korallvev til et nederste hjørne av posen. Klipp av motsatt hjørne og hell innholdet i posen forsiktig i et 15 ml rør på is.
4. Valgfri homogenisering
MERK: Noen korallarter er mer tyktflytende enn andre, noe som betyr at luftbørsting vil fjerne vevet i klumper i stedet for i en slurry. Hvis klumper av vev er synlige i det luftbørstede homogenatet, kan et homogeniseringstrinn ved 4 °C tilsettes for alle prøvene.
- Rengjør en mekanisk sagtannhomogenisator to ganger med 4 °C, 70 % metanol og til slutt med 4 °C ultrarent vann.
- Homogeniser korallprøven i et 15 ml rør i ~ 1 min til prøven er fullstendig homogenisert og ingen klumper er synlige.
- Rengjør homogenisatoren som i trinn 4.1 mellom hver prøve. Hold homogeniseringstiden konsistent på tvers av prøvene.
5. Prøveinnsamling for normalisering
- Samle en 1000 μL alikot fra det homogeniserte vevet for Symbiodiniaceae-celletall, korallvertsvevsproteininnholdsanalyse og klorofyll en estimering. Oppbevares ved −20 °C til analyseklar (avsnitt 10).
6. Valgfri korall vert vev-Symbiodiniaceae celle separasjon
- Sentrifuger korallhomogenatet ved 2 500 × g i 5 minutter ved 4 °C ved bruk av en nedkjølt sentrifuge.
MERK: Denne hastigheten er optimal for å skille de tyngre Symbiodiniaceae-cellene, samtidig som celleveggene holdes intakte, fra vertsvevet, som er suspendert i supernatanten. - Fjern supernatanten som inneholder vertsmaterialet, og sett i et nytt 15 ml rør.
MERK: Lipidene fra vertsvevet danner vanligvis et smalt rosa / hvitt lag på toppen av symbiontcellene. Dette laget kan samles sammen med den løselige vertssupernatanten via pipettering (figur 1B). - Virvel verten kraftig i nøyaktig 1 min. Oppbevar algepelletsprøven og vertssupernatantprøven på is.
- Tilsett 2 ml ultrarent vann ved 4 °C til algepelleten. Virvel kraftig i nøyaktig 2 min for å resuspendere pelleten.
MERK: Hvis individuelle fragmenter på 1 cm ikke ble samlet fra korallkolonien for Symbiodiniaceae-genotyping, kan en 200 μL alikot av Symbiodiniaceae-cellesuspensjonen samles her, bevares i den foretrukne DNA-bufferløsningen og lagres som beskrevet i Thurber et al.30 for Symbiodiniaceae genotyping (f.eks. Per González-Pech et al.12). - Gjenta trinn 6.1-6.4 en gang til.
MERK: Den pålitelige separasjonen av verten og symbionten avhenger av korallbiomassen og artene, da noen arter kan være mer tyktflytende enn andre. Minst tre vasketrinn anbefales, men dette kan økes avhengig av separasjonssuksess. Gjenta vasketrinn 4.7-4.9 til ingen Symbiodiniaceae-celler kan ses i bunnen av vertsfraksjonen og til Symbiodiniaceae-fraksjonen er synlig fri for vertsmateriale (f.eks. ikke noe hvitt lag på toppen) (figur 1). - Fjern supernatanten som inneholder vertsmaterialet, og sett i et nytt 15 ml rør.
- Behold symbiontpelleten i 15 ml røret.
7. Tørking av prøve
- Frys enten holobionthomogenatet eller begge de separerte verts- og Symbiodiniaceae-fraksjonene, ved -80 °C i ~120 minutter. Lyofiliser prøvene over natten med et vakuum på 0,01 mbar ved -85 °C.
MERK: For å unngå prøvetap under lyofilisering, anbefales det å bruke et lokk kuttet fra et annet sterilt rør, eller steril parafilm, med et ~ 2 mm hull stanset forsiktig gjennom ved hjelp av en steril 25 G nål. - Når det er tørt, ved hjelp av en laboratoriebalanse, veier du ett av følgende: 1) 25 mg av holobiont; 2) 15 mg av symbiontfraksjonen; eller 3) 30 mg av vertsvevet fra hver prøve i separate 2 ml myknerfrie mikrosentrifugerør.
MERK: Kritisk trinn: Optimalisering av biomassen for utvinning er viktig for å sikre at GC-MS ikke blir overbelastet samtidig som det sikres tilstrekkelig signal. Det tørkede korallmaterialet er veldig statisk. For å unngå tap av prøver, bruk antistatiske enheter for å eliminere elektrostatiske ladninger fra prøvene og veiebeholderne. Et enkelt og kostnadseffektivt alternativ er å legge en vaskemaskin under prøverøret. Den tørkede symbiontpelleten kan kuttes til ønsket vekt ved hjelp av et sterilt blad.
8. Intracellulære metabolittekstraksjoner
- Intracellulær metabolittekstraksjon fra lyofilisert holobiont:
- Tilsett 400 μL 100 % kald (−20 °C) metanol med intern standard/s (IS; 13C6 sorbitol og/eller 13C5-15 N valin, ved 10μM) til hvert rør.
- Tilsett et lite antall 710-1,180 μm syrevaskede glassperler (~ 10 mg) til hver prøve. Plasser i en perlemølle ved 50 Hz i 3 minutter i en forkjølt (-20 °C) perlemølleinnsats.
- Tilsett ytterligere 600 μL 100% kald (-20 ° C) metanol med ISs (13 C6 sorbitol og / eller 13C 5-15 N valin, ved 10μM) til hvert rør.
- Vortex å blande i 1 min. Legg på en rotisserie shaker ved 4 °C i 30 minutter.
- Intracellulær metabolittekstraksjon fra separerte lyofiliserte Symbiodiniaceae-celler:
- Tilsett 200 μL 100% kald (-20 ° C) metanol med ISs (13 C6 sorbitol og / eller 13C5-15 N valin, ved 10μM) til det tørkede Symbiodiniaceae-materialet.
- Tilsett et lite antall 710-1,180 μm syrevaskede glassperler (~ 10 mg). Plasser i en perlemølle ved 50 Hz i 3 minutter i en forkjølt (-20 °C) perlemølleinnsats.
- Tilsett ytterligere 800 μL 100 % kald (-20 °C) metanol med IS, og virvel i 30 s.
- Intracellulær metabolittekstraksjon fra separert lyofilisert vertsvev:
- Tilsett 1 ml 100 % kald (-20 °C) metanol av LC-kvalitet (13 C6 sorbitol og/eller 13C5-15 N valin ved 10μM) til det tørkede vertsmaterialet.
- Vortex å blande i 20 s. Plasser i en flytende rørholder i et sonikeringsbad satt til 4 ° C i 30 minutter.
9. Rensing av metabolittekstrakt
- Sentrifuger prøvene (holobiont/vert/symbiont) ved 3000 × g i 30 minutter ved 4 °C.
- Overfør all supernatanten til et nytt 2 ml mikrosentrifugerør, pass på at du ikke forstyrrer cellepelleten.
MERK: Dette er de semi-polare ekstraktene. Disse kan oppbevares midlertidig på is, men lagres langvarige ved -80 °C i mørket. - Til de gjenværende cellerestene, tilsett 1000 μL 50% kald (-20 ° C) metanol. Virvel kraftig i 1 min for å suspendere.
- Sentrifuger prøvene ved 3000 × g i 30 minutter ved 4 °C.
- Samle og slå sammen supernatanten (polare ekstrakter) med de halvpolare ekstraktene fra samme prøve.
MERK: Celleavfallet kan lagres ved -80 °C og brukes til normalisering av proteininnhold (avsnitt 11). - Sentrifuger de samlede ekstraktene ved 16 100 g i 15 minutter for å fjerne alle bunnfallene, og flytt supernatanten til et nytt myknerfritt mikrosentrifugerør (2 ml).
MERK: Prøveekstraktene kan oppbevares ved -80 °C i mørket. - Når du er klar til å analysere, aliquot 50 μL av hvert ekstrakt i en glassinnsats. Konsentrer deg i 30 minutter ved 30 °C ved hjelp av en vakuumkonsentrator. Gjenta fire ganger til (for 250 μL av totalt tørket ekstrakt).
MERK: De tørkede prøvene kan oppbevares ved romtemperatur under tørkemiddelforhold frem til analyse.
10. Metabolitt derivatisering
MERK: En to-trinns online derivatiseringsprosess brukes til metoksimering og trimetylsilylering av de polare metabolittene.
- Tilsett 25 μL metoksyaminhydroklorid (30 mg / ml i pyridin) til hver prøve.
- Agiter ved 37 °C på en orbital shaker satt til 750 o / min i 2 timer.
- Tilsett 25 μL N,O-bis (trimetylsilyl)trifluoracetamid + trimetylklorsilan til hver prøve.
- Omrør igjen ved 37 °C og 750 o/min i 1 time.
- La prøvene balanseres ved romtemperatur i 1 time før du injiserer 1 μL i et 1:10 delt forhold på GC.
11. Gasskromatografi-massespektrometri analyse
MERK: Massespektrometeret skal stilles inn i henhold til produsentens anbefalinger ved bruk av tris-(perfluorbutyl)-amin (CF43).
- Bruk helium med ultrahøy renhet som bæregass ved en konstant kolonnestrømningshastighet på 1 ml/min.
- Bruk en 30 m DB-5 kolonne med en 1 μm filmtykkelse og en 0,25 mm indre diameter.
- GC ovn program
- Sett innløpstemperaturen til 280 °C.
- Start med injeksjonen med en ovnstemperatur på 100 °C, og hold den i 4 minutter.
- Øk temperaturen med 10 °C/min til 320 °C, og hold deretter i 11 min.
- Massespektrometer parametere
- Sett MS-overføringslinjen til 280 °C, og juster ionekilden til 200 °C.
- Bruk argon som kollisjonscellegass for å generere produktet MRM (multiple reaction monitoring).
- Oppnå metabolittdeteksjon i forhold til et tidssegmentert MRM-bibliotek som inneholder MRM-mål.
12. Symbiodiniaceae celletall, korallvert vev protein innhold analyse, og klorofyll en estimering
- Symbiodiniaceae celletall:
- Ta en aliquot av korallvevshomogenatet.
- Sentrifuge prøvene ved 2000 × g for å pelletere alger.
- Fjern ~200 μL supernatanten fra algepelleten, og sett i et nytt mikrosentrifugerør.
MERK: Dette vil være proteinprøven som vil bli brukt til å normalisere dataene; Oppbevares ved −20 °C før analyser, om nødvendig. - Resuspender algepelleten i 1 ml filtrert sjøvann ved å pipettere forsiktig opp og ned. Fortynn om nødvendig algesuspensjonen for å lette celletellingen.
- Utfør et celletall ved hjelp av et hemocytometer under et lysmikroskop ved å tilsette 10 μL til et av kamrene. Fullfør 8-10 tellinger per prøve.
MERK: Alternative metoder for telling av algecellene kan også brukes der det er tilgjengelig (f.eks. flowcytometri, konfokalmikroskopi med høy gjennomstrømning). - Beregn konsentrasjonen av symbiontcellene (ml-1), med tanke på eventuelle fortynningsfaktorer som brukes.
- Analyse for proteininnholdet
- Kvantifiser prøveproteininnholdet (f.eks. via Bradfords kolorimetriske analyse, som opprinnelig beskrevet av Bradford et al.33, eller Lowry-analysen34,35, protokollen som er beskrevet for cnidarians andre steder 36).
- Klorofyll en ekstraksjon
- Bruk en cellepellet på ~200 000 celler, frosset eller fersk.
- Overfør hver algepellet til 2 ml dimetylformamid (DMF) i et hetteglass med glassscintillasjon, og inkuber i mørket ved 4 °C i 48 timer.
MERK: DMF er giftig og kreftfremkallende, så prøveprepareringen må fullføres under en avtrekkshette som er så mørk som mulig og på is. Hvis det er < 200 000 celler, bruk mindre DMF. - Sentrifuge i 3 min ved 16 000 × g.
- Overfør 200 ml til en UV-96 brønnplate for fotometriske målinger. Kjør hver prøve i triplikat med DMF som tom.
- Mål absorbansen ved bølgelengder (E) 663,8 nm, 646 nm og 750 nm. Trekk absorbansen ved 750 nm fra absorbansen ved begge de andre bølgelengdene.
MERK: Måling ved 750 nm korrigerer for spredning eller turbiditet i prøven. - Beregn klorofyll en konsentrasjon (μg / ml) ved hjelp av ligning (1):
Chl a konsentrasjon (μg / ml) = (12,00 × E 663,8) - (3,11 × E646,8) (1)
13. Kvantifisering av cellebiomassen etter metabolittekstraksjoner for normalisering
MERK: Det er to alternativer for kvantifisering av cellebiomasse beskrevet nedenfor: kvantifisering av protein relatert til biomasse ved hjelp av en modifisert Bradford kolorimetrisk metode og måling av celleavfallets tørrvekt. Begge metodene er hensiktsmessige å bruke, da begge tilbyr nøyaktig kvantifisering av cellebiomassen.
- Proteininnhold i celleavfallet
- Resuspender de frosne cellerestene med 1 ml 0,2 M NaOH, og inkuber prøvene ved 98 °C i 20 minutter.
- Avkjøl prøvene på is i ~ 10 min, og sentrifuge ved 3000 × g i 5 minutter ved omgivelsestemperatur.
- Kvantifiser prøveproteininnholdet (f.eks. via Bradfords kolorimetriske analyse, som opprinnelig beskrevet av Bradford et al.33 og modifisert av Smart et al.37).
- Måling av celleavfall tørrvekt
- Resuspender celleavfallet fra den intracellulære metabolittekstraksjonen i dobbeltdestillert vann (~10 ml).
- Filtrer løsningen under vakuum ved hjelp av et forhåndsveid membranfilter (0,22 μm pore, 47 mm).
- Vask rørene som inneholder biomasse to ganger med ultrarent vann for å sikre fullstendig overføring av biomasse til membranfilteret.
- Fjern membranfilteret som inneholder biomassen og tørk det med en mikrobølgeovn (lav effekt; ~ 250 W i 20 minutter).
- Oppbevar filterpapiret i en tørkemaskin over natten. Registrer tørrvekten til filterpapiret og beregn biomassens tørrvekt ved å trekke vekten av det tørre membranfilteret (ved hjelp av et rent, tørt membranfilter tørket sammen med prøvefilteret) fra totalvekten.
14. Dataanalyse
- Analyser metabolittmål ved hjelp av metabolittdatabaser der hvert mål består av en kvantifikator og kvalifikator MRM.
- Inspiser visuelt de oppdagede metabolittmålene og integrer dem manuelt etter behov.
- Bruk et metabolitttoppområde til å beregne relativ mengde av hver prøve for hver gruppe. Verdiene er blankt korrigert og normalisert for å prøve internt standard toppområde, og deretter for å prøve celleavfallsproteininnhold i henhold til Smart et al.37.
- Forkast metabolitter med et relativt standardavvik større enn 35 % i alle behandlingsgruppene (N = 23 metabolitter).
- Transformere dataene (f.eks. kuberot) og middelsentrere dem; bekrefte en normalfordeling og homogenitet av varians.
- Utføre dataanalysen (ANOVA og varmekartkonstruksjon; f.eks. ved hjelp av https://www.metaboanalyst.ca)38. Samle prøvene for å undersøke variasjon i behandlingen ved hjelp av pakkene "cluster", "factoextra" og "klustR". Beregn gapstatistikken (en metode for å bestemme det optimale antall klynger39) ved hjelp av "clusGap" -funksjonen i R og plott ved hjelp av R-pakken "tidyverse". Utfør PERMANOVAs for å undersøke signifikansen i separasjonen mellom behandlingsmetabolittprofilene (f.eks. i Primer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alle data som produseres under dette arbeidet er tilgjengelige i tilleggsinformasjonen.
Host-symbiont separasjon
Figur 1: Oppsett og validering av separasjon av korallvertsvev og Symbiodiniaceae-celler. (A) Luftpistoloppsettet for fjerning av korallvev fra korallskjelettet. En pipettespiss er festet til luftpistolen med elektrisk tape, og en liten (~ 5 mm) seksjon er kuttet fra spissen for å tillate mer luft å slippe ut uten å løsne spissen. (B) Eksempler på holobiont og separert vertsvev (supernatant) og Symbiodiniaceae celler (pellet). Verdien representerer antall sentrifugeringstrinn. Pilen peker på det smale vertslipidlaget på toppen av symbiontpelleten som kan samles og kombineres med vertsfraksjonen. (VG Nett) Brightfield (øverst) og klorofyll autofluorescens (nederst) mikroskopibilder av en alikot av (C) holobiont med både vertsvev og symbiontceller, (D) vertsfraksjonen uten symbiontceller som verifisert ved fravær av klorofyllautofluorescens, og (E) intakte symbiontceller, som demonstrerer fjerning av vertsvevet. Skalastenger = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Mikroskopisk visualisering viste ingen Symbiodiniaceae-celler i vertsvevsprøvene etter de tre vasketrinnene (figur 1D). Tilsvarende var det minimalt vertsvev tilstede i symbiontfraksjonene (figur 1E). Holobionthomogenatet (figur 1C) viste imidlertid at de intracellulære Symbiodiniaceae kanskje ikke har blitt tilstrekkelig frigjort fra symbiosomene ved enkel luftbørsting og dermed ikke så tilstrekkelig lysert under mekanisk homogenisering (protokolldel 4) eller løsningsmiddelekstraksjon (protokolldel 8) sammenlignet med sentrifugalseparasjon (figur 1E). Denne begrensningen kan forklare noe av den store variasjonen innad i gruppen mellom holobiontprøvene og spesifikke observasjoner i holobiontprofilene. For eksempel var to metabolitter (glykolsyre og 1-heksadekanol) signifikant mer tallrike i holobiont versus symbiont, men ikke i verten versus symbiont; Dette kan ha vært et resultat av den store variasjonen innenfor gruppen i den relative mengden av disse metabolittene i Holobiont-profilene. Spesielt hadde holobiontprøve 3 relativt høyere konsentrasjoner av dodekansyre, glykolsyre og 1-heksdekanol enn noen av symbiont- eller vertsprøvene individuelt. Ettersom data fra metabolittens toppområde normaliseres til proteininnholdet i prøven, kan holobiontproteininnholdet ha blitt undervurdert hvis symbiontcellene ikke ble renset tilstrekkelig for vertsvev, og dermed påvirke biomassenormaliseringen og føre til beregning av en høyere metabolittoverflod i forhold til biomassen i denne prøven. Dette understreker ytterligere potensialet for økt variasjon i holobiont metabolomics.
Analyse av metabolittprofil
Valget av massespektrometermodus er avhengig av analysen som utføres. For profilering av steady-state metabolitter muliggjør en omfattende målrettet metodikk ved bruk av QqQ-MS i MRM-modus forbedret metabolittdeteksjon og identifisering på grunn av eliminering av bakgrunnsstøy som kan genereres av høye biologiske saltkonsentrasjoner. For stabile isotopmerkingstilnærminger tillater et massespektrometer (dvs. enkelt kvadrupol, trippel kvadrupol [QqQ], kvadrupolflytid [QTOF]) som kjører i skannemodus deteksjonen av masseisotopologer som indikerer stabile isotopanrikningsmønstre.
Målrettet GC-MS-analyse ble fullført ved hjelp av Shimadzu Smart Metabolite Database (v3; som dekker ca. 350 endogene metabolitter og flere stabile isotopisk merkede interne standarder) og Shimadzu LabSolutions Insight-programvaren. På tvers av alle behandlingene ble 107 kommenterte metabolitter identifisert, inkludert en rekke aminosyrer, organiske syrer, karbohydrater, fettsyrer og steroler (tilleggstabell S1). Kvalitative og kvantitative ionepar er gitt i tilleggstabell S2. Kmeans clustering identifiserte tre forskjellige klynger av prøver (verifisert av en gapstatistikktest), med alle prøvene i separate, distinkte klynger; symbiontene var i hop 1, verten i klynge 2, og holobiontprøvene i hop 3 (figur 2).
Figur 2: Kmeans klyngeanalyse av metabolittprofilene . (A) Utvalgets metabolittprofiler ble gruppert etter euklidsk avstand med det optimale antall klynger (N = 3), som ble verifisert via en gapstatistikkberegning. (B) Parallell koordinatvisualisering av gjennomsnittlig metabolitt relativ mengde (linje, farget i henhold til klyngen) og konfidensintervall (skyggelegging, farget i henhold til klyngen) for hver klynge (rød = klynge 1, grønn = klynge 2, blå = klynge 3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Sammenligning av verts- og symbiontmetabolittprofil
Verts- og symbiontprofilene var signifikant forskjellige fra hverandre (PERMANOVA, t = 16,909, p < ,001; Supplerende tabell S3), med 100 individuelle metabolitter signifikant forskjellig mellom verts- og symbiontfraksjonene (ANOVA, FDR < .05; figur 3 og tilleggstabell S1). Av disse var 13 metabolitter signifikant mer tallrike i symbionten enn vertsekstraktene, inkludert eikosanoidene dokosaheksaensyre (C22:6[ω-6]; DHA), eikosapentaensyre (C20:5[ω-6]; EPA) og arakidonsyre (C20:4[ω-6]; ARA) (ANOVA, FDR < 0,05; figur 3 og tilleggstabell S1). Totalt 87 metabolitter var mindre tallrike i symbionten enn vertsekstraktene (ANOVA, FDR < 0,05; figur 3 og tilleggstabell S1).
Figur 3: Varmekartvisualisering av metabolittens relative mengder med post-hoc analyseresultater av gruppesammenligningene. Verts-, symbiont- og holobiontprøvene (N = 5 per gruppe) ble hierarkisk gruppert via Wards kobling, og metabolittene ble gruppert i henhold til euklidsk avstandsmål. De fargede firkantene indikerer signifikante forskjeller i gruppesammenligningene oppdaget via ANOVA med post hoc Tukeys HSD (tilleggstabell S1). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Holobiont metabolittprofiler sammenlignet med separerte verts- og symbiontprofiler
Holobiont-metabolittprofilene viste stor variasjon innenfor gruppen, underbygget av den store separasjonen av prøver i holobionthopen i Kmeans-analysen; Spesielt ble prøve 3 og prøve 4 skilt langs dimensjon 2 fra prøve 1, prøve 2 og prøve 5 (figur 2A). Holobiontprøvene var mellomliggende mellom separert vert og symbiontfraksjoner (figur 2A). Mens Kmeans-klyngefordelingene (figur 2A), parallelle koordinater (figur 2B) og varmekartvisualisering av metabolittens relative mengde (figur 3) indikerte at holobiontprofilen stemte bedre overens med vertsfraksjonsprofilen, skilte holobiontprofilen seg signifikant fra både verten (PERMANOVA, t = 3,47, p < 0,001; Tilleggstabell S3) og symbiontprofiler (PERMANOVA, t = 11,29, p < 0,001; Tilleggstabell S3). På individmetabolittnivå var 66 og 82 metabolitter i holobiont signifikant forskjellig fra henholdsvis verts- og symbiontprofilen (ANOVA, FDR < 0,05, tilleggstabell S1). Av disse hadde 54 (81,8 %) av de 66 signifikante metabolittene signifikant høyere relativ overflod i verten enn holobiontfraksjonen, og 78 (95 %) hadde signifikant høyere relativ overflod i holobiont enn symbiontfraksjonen. fire var mer tallrike i symbiontfraksjonene, inkludert DHA, glyserol-3-fosfat, inositolfosfat og fosforsyre (figur 3). Åtte metabolitter (inkludert to fettsyrer [linolsyre (C18:1) og myrististiske (C14:0) syrer], fem dikarboksylsyrer og aminosyren guanin) var signifikant forskjellige i overflod mellom verten og symbionten, men ikke sammenlignet med holobiontfraksjonen (figur 3).
Tilleggstabell S1: Den relative forekomsten av hver metabolitt identifisert ved hjelp av GC-MS-analyse i holobiont og separert vert og symbiont. Verdiene er gjennomsnittlige ± standardfeil, og de oppgitte ANOVA-resultatene, inkludert post hoc-analysen, indikeres av de fargede cellene (kolonne K, L og M). Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell S2: Kvalitative og kvantitative ionepar for de identifiserte metabolittene. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell S3: PERMANOVA-resultater. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Separasjonen av verten og symbionten er enkelt og raskt oppnåelig via enkel sentrifugering, og resultatene her viser at separasjon av fraksjonene kan gi verdifull informasjon som indikerer spesifikke holobiontmedlemsbidrag, noe som kan bidra til funksjonell analyse av korallhelse. I voksne koraller utføres lipidsyntese primært av den fastboende algesymbionten40, som leverer lipider (f.eks. triacylglycerol og fosfolipider)41 og fettsyrer som kan fremme stressrestitusjon 11,42. Av de 13 metabolittene som var mer tallrike i symbiont versus vertsprofiler i dette arbeidet, var 9 fettsyrer, inkludert de biologisk relevante eikosanoidene DHA (C22: 6 [ω-6]), EPA (C20: 5 [ω-6]) og ARA (C20: 4 [ω-6]), som er involvert i spenningssignalering mellom rike i korall-Symbiodiniaceaesymbiose 9,10. Inositolfosfat spiller en avgjørende rolle i ulike cellulære funksjoner, inkludert cellevekst, apoptose, endocytose og celledifferensiering. Den relative overflod av inositol isoformer og derivater har ofte blitt funnet å endre seg under symbiose dysfunksjon 7,11,27,28, selv om rollen til disse isoformer og deres derivater i korall-Symbiodiniaceae symbiose forblir uklart. Dermed bidrar den klare forskjellen i relativ overflod mellom verts- og symbiontprofiler til å bidra til denne kunnskapen.
Mange studier har brukt holobiont metabolittprofiler for å undersøke korallmetabolske interaksjoner og ytelse under omgivelses- og stressforhold 13,43,44,45. Her viser vi at analysen av holobionthomogenatet kan resultere i stor variasjon i behandlingen, og de resulterende profilene kan maskere verts- og/eller symbiontspesifikke overflodsmønstre og metabolske bidrag til det totale holobiontmetabolomet. For eksempel, av de 13 metabolittene som var signifikant mer tallrike i symbionten i forhold til vertsfraksjonen, var bare 4 signifikant mer tallrike i symbionten i forhold til holobionten. Disse inkluderte potensielt biologisk relevant DHA og inositolfosfat 7,9,10,11,27,28; De distinkte forskjellene observert i stresssignalerende eikosanoider EPA og ARA mellom verten og symbionten var imidlertid ikke signifikante i holobiont versus symbiontprøvene. Disse metabolittene blir i økende grad anerkjent som viktige metabolitter i det molekylære språket for symbiose og som indikatorer på stressresponser10, men undersøkelse av holobiontprofiler alene ville ikke avsløre de distinkte endringene i de relative mengdeforholdene til disse metabolittene hos spesifikke holobiontmedlemmer. Dermed kan analyse av holobiont maskere forskjeller som ellers er tydelige når verten og symbionten analyseres separat, og disse forskjellene kan ikke oppdages som signifikante i studier som sammenligner abiotiske eller biotiske behandlinger utelukkende ved bruk av holobiontprofiler. Dette kan gjøre det utfordrende å utlede spesifikke partnerbidrag eller funksjoner 7,8,9,11,12,22,28, spesielt når man forsøker å svare på biologiske spørsmål der symbiotiske interaksjoner ligger til grunn for den observerte holobiontfenotypen 46,47.
En alternativ metode ville være å skille vertsvevene og symbiontcellene, ta en alikot av homogenatet eller et ekstrakt av hver fraksjon for å rekombinere før ekstraksjon, og analysere dette sammen med de separerte fraksjonene; Denne metoden vil sikre frigjøring av symbionter fra vertsvevet, men vil øke potensialet for menneskelig feil og/eller metabolitttap48. Det kan være mulig å analysere fraksjonene separat og integrere datapostanalysen, men beregningene må ta hensyn til andelen symbiont- og vertsceller i den opprinnelige korallholobionten.
Mens mer informasjon kan oppnås ved å separere verts- og symbiontfraksjonene for metabolittanalyse, spesielt når det gjelder individuelle medlemsbidrag til holobiont metabolisme og funksjon, om å skille verten og symbionten i stedet for å analysere holobiont er til slutt en beslutning styrt av forskningsspørsmålet. For eksempel er analyse av metabolittprofilen til holobiont relevant når andre fysiologiske målinger tas med holobiont (f.eks. analyse av flyktige metabolittutslipp fra korallkolonier 49,50,51) og når metabolomikkprofiler må integreres med holobiont-datasett. I tillegg er separasjonen av verten og symbionten ikke uten begrensninger; For eksempel kan ytterligere manipulasjonstrinn forstyrre metabolittstabiliteten og føre til tap av data eller forstyrrende effekter48.
Videre er det ytterligere optimaliseringstrinn involvert i vertssymbiont-separasjonsprosedyren: 1) optimalisering av antall vasker for den spesifikke korallarten; og 2) identifisere den optimale biomassen som skal ekstraheres fra begge fraksjonene for GC-MS-analyse. Begge trinnene må inkluderes før den endelige prøvebehandlingen kan starte, og dermed øke både forbruks- og analysekravene for materiale, tid og kostnader. I dette arbeidet kan metabolitttap fra verten og symbiontekstraksjoner på grunn av tilleggstrinnene ha bidratt til høyere relative forekomster av noen metabolitter observert i holobiont i forhold til enten verten eller symbionten, slik som glykolsyre, 1-heksadekanol og dodekansyre. Den store variasjonen innenfor gruppen i holobiontgruppen for disse metabolittene er imidlertid som nevnt en alternativ årsak til disse observerte mønstrene.
Anvendelsen av metabolomics-tilnærminger, selv om den er relativt ny, har hatt en dyp innvirkning på vår evne til å belyse funksjonen til spesifikke symbioser. For eksempel har denne tilnærmingen avslørt bidraget fra fytoplanktonvekstfremmende hormon indol-3 eddiksyre, som syntetiseres av bakterier i Pseudo-nitzschia multiseries-Sulfitobacter-symbiosen. Videre har denne tilnærmingen belyst vertsavledet og symbiontavledet translokasjon i koraller 11,27,28,29, som har spennende potensial for bevaring og restaurering av korallrev3, for eksempel gjennom biomarkørdeteksjon19. Her har vi gitt en prosedyre for begge tilnærmingene med håp om at dette vil lette og akselerere anvendelsen av metabolomics for fremtidige korallrevundersøkelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
J.L.M. ble støttet av et UTS Chancellor's Research Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% LC-grade methanol | Merck | 439193 | LC grade essential |
| 2 mL microcentrifuge tubes, PP | Eppendorf | 30121880 | Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes |
| 2030 Shimadzu gas chromatograph | Shimadzu | GC-2030 | |
| 710-1180 µm acid-washed glass beads | Merck | G1152 |
This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells |
| AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler | Shimadzu | AOC6000 | |
| Bradford reagent | Merck | B6916 | Any protein colourimetric reagent is acceptable |
| Compressed air gun | Ozito | 6270636 | Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical. |
| DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness | Agilent | 122-5013 | |
| DMF | Merck | RTC000098 | |
| D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine | Merck | 605514/ 600148 | Either or both internal standards can be added to the methanol. |
| Flat bottom 96-well plate | Merck | CLS3614 | |
| Glass scintillation vials | Merck | V7130 | 20 mL, with non-plastic seal |
| Immunoglogin G | Merck | 56834 | if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable |
| Primer | v4 | ||
| R | v4.1.2 | ||
| Shimadzu LabSolutions Insight software | v3.6 | ||
| Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | Pellets to make 1 M solution |
| tidyverse | v1.3.1 | R package | |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | Or similar |
| TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
| UV-96 well plate | Greiner | M3812 | |
| Whirl-Pak sample bag | Merck | WPB01018WA | Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread |
References
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: A critical review and future perspectives. Metabolomics. 5 (1), 3-21 (2008).
- Matthews, J. L., et al. The metabolic significance of symbiont community composition in the coral-algal symbiosis. Applied Environmental Metabolomics. Beale, D. J., Hillyer, K. E., Warden, A. C., Jones, O. A. H. , Academic Press. Cambridge, MA. 211-229 (2022).
- Lawson, C. A., et al. Informing coral reef conservation through metabolomic approaches. Coral Reef Conservation and Restoration in the Omics Age. Coral Reefs of the World. van Oppen, M. J. H., Aranda Lastra, M. , Springer. Cham, Switzerland. 179-202 (2022).
- LaJeunesse, T. C., et al. Systematic revision of Symbiodiniaceae highlights the antiquity and diversity of coral endosymbionts. Current Biology. 28 (16), 2570-2580 (2018).
- Rohwer, F., Seguritan, V., Azam, F., Knowlton, N. Diversity and distribution of coral-associated bacteria. Marine Ecology Progress Series. 243, 1-10 (2002).
- Maire, J., et al. Intracellular bacteria are common and taxonomically diverse in cultured and in hospite algal endosymbionts of coral reefs. The ISME Journal. 15 (7), 2028-2042 (2021).
- Hillyer, K. E., et al. Metabolite profiling of symbiont and host during thermal stress and bleaching in the coral Acropora aspera. Coral Reefs. 36, 105-118 (2016).
- Hillyer, K. E., Tumanov, S., Villas-Bôas, S., Davy, S. K. Metabolite profiling of symbiont and host during thermal stress and bleaching in a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Journal of Experimental Biology. 219 (4), 516-527 (2016).
- Matthews, J. L., et al. Optimal nutrient exchange and immune responses operate in partner specificity in the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (50), 13194-13199 (2017).
- Rosset, S. L., et al. The molecular language of the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Trends in Microbiology. 29 (4), 320-333 (2020).
- Matthews, J. L., et al. Partner switching and metabolic flux in a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Royal Society. 285 (1892), 20182336 (2018).
- González-Pech, R. A., et al. Physiological factors facilitating the persistence of Pocillopora aliciae and Plesiastrea versipora in temperate reefs of south-eastern Australia under ocean warming. Coral Reefs. 41, 1239-1253 (2022).
- Williams, A., et al. Metabolomic shifts associated with heat stress in coral holobionts. Science Advances. 7 (1), (2021).
- Deutsch, J. M., et al. Metabolomics of healthy and stony coral tissue loss disease affected Montastraea cavernosa corals. Frontiers in Marine Science. 8, 1421 (2021).
- Stien, D., et al. A unique approach to monitor stress in coral exposed to emerging pollutants. Scientific Reports. 10 (1), 9601 (2020).
- Lohr, K. E., et al. Resolving coral photoacclimation dynamics through coupled photophysiological and metabolomic profiling. Journal of Experimental Biology. 222 (8), (2019).
- Jorissen, H., et al. Coral larval settlement preferences linked to crustose coralline algae with distinct chemical and microbial signatures. Scientific Reports. 11 (1), 14610 (2021).
- Roach, T. N., Dilworth, J., Jones, A. D., Quinn, R. A., Drury, C. Metabolomic signatures of coral bleaching history. Nature Ecology & Evolution. 5 (4), 495-503 (2021).
- Parkinson, J. E., et al. Molecular tools for coral reef restoration: Beyond biomarker discovery. Conservation Letters. 13 (1), 12687 (2020).
- Jiang, J., et al. How Symbiodiniaceae meets the challenges of life during coral bleaching. Coral Reefs. 40, 1339-1353 (2021).
- Guerra, F. D., Attia, M. F., Whitehead, D. C., Alexis, F. Nanotechnology for environmental remediation: materials and applications. Molecules. 23 (7), 1760 (2018).
- Matthews, J. L., et al. Metabolite pools of the reef building coral Montipora capitata are unaffected by Symbiodiniaceae community composition. Coral Reefs. 39, 1727-1737 (2020).
- Papina, M., Meziane, T., van Woesik, R. Symbiotic zooxanthellae provide the host-coral Montipora digitata with polyunsaturated fatty acids. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 135 (3), 533-537 (2003).
- Kellogg, R., Patton, J. Lipid droplets, medium of energy exchange in the symbiotic anemone Condylactis gigantea: A model coral polyp. Marine Biology. 75, 137-149 (1983).
- Ankrah, N. Y., Chouaia, B., Douglas, A. E. The cost of metabolic interactions in symbioses between insects and bacteria with reduced genomes. mBio. 9 (5), e01433 (2018).
- Kabeya, N., et al. Genes for de novo biosynthesis of omega-3 polyunsaturated fatty acids are widespread in animals. Science Advances. 4 (5), (2018).
- Hillyer, K. E., Dias, D., Lutz, A., Roessner, U., Davy, S. K. 13C metabolomics reveals widespread change in carbon fate during coral bleaching. Metabolomics. 14 (1), 12 (2018).
- Hillyer, K. E., Dias, D. A., Lutz, A., Roessner, U., Davy, S. K. Mapping carbon fate during bleaching in a model cnidarian symbiosis: the application of 13C metabolomics. New Phytologist. 214 (4), 1551-1562 (2017).
- Burriesci, M. S., Raab, T. K., Pringle, J. R. Evidence that glucose is the major transferred metabolite in dinoflagellate-cnidarian symbiosis. Journal of Experimental Biology. 215 (19), 3467-3477 (2012).
- Thurber, R. V., et al. Unified methods in collecting, preserving, and archiving coral bleaching and restoration specimens to increase sample utility and interdisciplinary collaboration. PeerJ. 10, 14176 (2022).
- Grottoli, A. G., et al. Increasing comparability among coral bleaching experiments. Ecological Applications. 31 (4), 02262 (2020).
- Mushtaq, M. Y., Choi, Y. H., Verpoorte, R., Wilson, E. G. Extraction for metabolomics: access to the metabolome. Phytochemical Analysis. 25 (4), 291-306 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Zamer, W. E., Shick, J. M., Tapley, D. W. Protein measurement and energetic considerations: Comparisons of biochemical and stoichiometric methods using bovine serum albumin and protein isolated from sea anemones. Limnology and Oceanography. 34 (1), 256-263 (1989).
- Smart, K. F., Aggio, R. B., Van Houtte, J. R., Villas-Boas, S. G. Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 5 (10), 1709-1729 (2010).
- Pang, Z., et al. Using MetaboAnalyst 5.0 for LC-HRMS spectra processing, multi-omics integration and covariate adjustment of global metabolomics data. Nature Protocols. 17 (8), 1735-1761 (2022).
- Tibshirani, R., Walther, G., Hastie, T. Estimating the number of clusters in a data set via the gap statistic. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Statistical Methodology). 63 (2), 411-423 (2001).
- Chen, W. -N., et al. Diel rhythmicity of lipid-body formation in a coral-Symbiodinium endosymbiosis). Coral Reefs. 31 (2), 521-534 (2012).
- Imbs, A. Fatty acids and other lipids of corals: composition, distribution, and biosynthesis. Russian Journal of Marine Biology. 39 (3), 153-168 (2013).
- Rosset, S., et al. Lipidome analysis of Symbiodiniaceae reveals possible mechanisms of heat stress tolerance in reef coral symbionts. Coral Reefs. 38 (6), 1241-1253 (2019).
- Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Del Angel-Rodriguez, J. A., Perez-Espana, H. Seasonal shifts in fatty acids and sterols in sponges, corals, and bivalves, in a southern Gulf of Mexico coral reef under river influence. Coral Reefs. 40 (2), 571-593 (2021).
- Imbs, A. B., Dang, L. T. Seasonal dynamics of fatty acid biomarkers in the soft coral Sinularia flexibilis, a common species of Indo-Pacific coral reefs. Biochemical Systematics and Ecology. 96, 104246 (2021).
- Oku, H., Yamashiro, H., Onaga, K., Sakai, K., Iwasaki, H. Seasonal changes in the content and composition of lipids in the coral Goniastrea aspera. Coral Reefs. 22 (1), 83-85 (2003).
- Weis, V. M. Cell biology of coral symbiosis: foundational study can inform solutions to the coral reef crisis. Integrative and Comparative Biology. 59 (4), 845-855 (2019).
- Oakley, C., Davy, S. Cell biology of coral bleaching. Coral Bleaching. van Oppen, M., Lough, J. , Springer. Cham, Switzerland. 189-211 (2018).
- Lu, W., et al. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Lawson, C. A., et al. Heat stress decreases the diversity, abundance and functional potential of coral gas emissions. Global Change Biology. 27 (4), 879-891 (2021).
- Olander, A., et al. Comparative volatilomics of coral endosymbionts from one-and comprehensive two-dimensional gas chromatography approaches. Marine Biology. 168 (5), 76 (2021).
- Wuerz, M., et al. Symbiosis induces unique volatile profiles in the model cnidarian Aiptasia. Journal of Experimental Biology. 225 (19), (2022).
