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Biology

Formation osseuse intégrée par ossification endochondrale in vivo à l’aide de cellules souches mésenchymateuses

Published: July 14, 2023 doi: 10.3791/65573
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,3
1Department of Molecular Craniofacial Embryology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Maxillofacial Surgery, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 3Department of Regenerative and Reconstructive Dental Medicine, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

Summary

La thérapie osseuse par ossification endochondrale par implantation de tissu cartilagineux artificiel produit à partir de cellules souches mésenchymateuses a le potentiel de contourner les inconvénients des thérapies conventionnelles. Les hydrogels d’acide hyaluronique sont efficaces pour mettre à l’échelle des greffes de cartilage uniformément différenciées ainsi que pour créer un os intégré avec vascularisation entre les greffons fusionnés in vivo.

Abstract

La thérapie conventionnelle de régénération osseuse utilisant des cellules souches mésenchymateuses (CSM) est difficile à appliquer aux défauts osseux supérieurs à la taille critique, car elle n’a pas de mécanisme pour induire l’angiogenèse. L’implantation de tissu cartilagineux artificiel fabriqué à partir de CSM induit l’angiogenèse et la formation osseuse in vivo via l’ossification endochondrale (ECO). Par conséquent, cette approche médiée par l’ECO peut être une thérapie de régénération osseuse prometteuse à l’avenir. Un aspect important de l’application clinique de cette approche médiée par l’ECO est l’établissement d’un protocole de préparation d’une quantité suffisante de cartilage à implanter pour réparer le défaut osseux. Il n’est surtout pas pratique de concevoir une seule masse de cartilage greffé d’une taille conforme à la forme du défaut osseux réel. Par conséquent, le cartilage à transplanter doit avoir la propriété de former de l’os intégralement lorsque plusieurs morceaux sont implantés. Les hydrogels peuvent être un outil intéressant pour la mise à l’échelle des greffons d’ingénierie tissulaire pour l’ossification endochondrale afin de répondre aux exigences cliniques. Bien que de nombreux hydrogels d’origine naturelle favorisent la formation de cartilage MSC in vitro et ECO in vivo, le matériau d’échafaudage optimal pour répondre aux besoins des applications cliniques n’a pas encore été déterminé. L’acide hyaluronique (AH) est un composant crucial de la matrice extracellulaire cartilagineuse et est un polysaccharide biodégradable et biocompatible. Ici, nous montrons que les hydrogels d’AH ont d’excellentes propriétés pour soutenir la différenciation in vitro du tissu cartilagineux à base de CSM et favoriser la formation osseuse endochondrale in vivo.

Introduction

L’os autologue est toujours la référence en matière de réparation des défauts osseux dus à des traumatismes, des malformations congénitales et de la résection chirurgicale. Cependant, la greffe osseuse autogène présente des limites importantes, notamment la douleur du donneur, le risque d’infection et le volume osseux limité qui peut être isolé des patients 1,2,3,4. De nombreux biomatériaux ont été développés comme substituts osseux, combinant des polymères naturels ou synthétiques avec des matériaux minéralisés tels que le phosphate de calcium ou l’hydroxyapatite 5,6. La formation osseuse dans ces matériaux d’ingénierie est généralement réalisée en utilisant le matériau minéralisé comme matériau d’amorçage pour permettre aux cellules souches de se différencier directement en ostéoblastes par le processus d’ossification intramembranaire (IMO)7. Ce processus n’a pas d’étape angiogénique, ce qui entraîne une vascularisation in vivo insuffisante du greffon après l’implantation 8,9,10 et, par conséquent, les approches utilisant un tel processus peuvent ne pas être optimales pour traiter les grands défauts osseux 11.

Il a été démontré que les stratégies appliquées pour récapituler le processus d’ossification endochondrale (ECO), un mécanisme inné de la squelétogenèse au cours du développement, permettent de surmonter des problèmes importants associés aux approches traditionnelles basées sur l’OMI. Dans l’ECO, les chondrocytes de la matrice cartilagineuse libèrent le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF), qui favorise l’infiltration vasculaire et le remodelage de la matrice cartilagineuse dans l’os12. L’approche de l’ostéogenèse médiée par l’ECO via le remodelage du cartilage et l’angiogenèse, qui est également activée lors de la réparation des fractures, utilise du tissu cartilagineux créé artificiellement dérivé des CSM comme matériau d’amorçage. Les chondrocytes peuvent tolérer l’hypoxie dans les défauts osseux, induire l’angiogenèse et convertir une greffe de cartilage sans système vasculaire en tissu angiogénique. De nombreuses études ont rapporté que les greffes de cartilage à base de CSM génèrent de l’os in vivo en mettant en œuvre un tel programme ECO 13,14,15,16,17,18,19,20,21.

Une condition essentielle pour l’application clinique de cette approche médiée par l’ECO est de savoir comment préparer la quantité souhaitée de greffe de cartilage dans un cadre clinique. Il n’est pas pratique de préparer un cartilage clinique d’une taille adaptée au défaut osseux réel. Par conséquent, le cartilage du greffon doit former intégralement de l’os lorsque plusieurs fragments sont implantés22. Les hydrogels peuvent être un outil intéressant pour la mise à l’échelle des greffons d’ingénierie tissulaire pour l’ossification endochondrale. De nombreux hydrogels d’origine naturelle soutiennent la formation de cartilage MSC in vitro et ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32 ; Cependant, le matériau de support optimal pour répondre aux exigences de l’application clinique n’a pas encore été déterminé. L’acide hyaluronique (AH) est un polysaccharide biodégradable et biocompatible présent dans la matrice extracellulaire du cartilage33. L’AH interagit avec les CSM via des récepteurs de surface tels que CD44 pour soutenir la différenciation chondrogénique 25,26,28,30,31,32,34. De plus, les échafaudages à base d’AH favorisent la différenciation ostéogénique médiée par l’OMI des cellules souches de la pulpe dentaire humaine35, et les échafaudages combinés au collagène favorisent l’ostéogenèse médiée par l’ECO36,37.

Nous présentons ici une méthode de préparation d’hydrogels d’AH à l’aide de CSM humaines adultes dérivées de moelle osseuse et leur utilisation pour la chondrogenèse hypertrophique in vitro et l’ossification endochondrale ultérieure in vivo38. Nous avons comparé les caractéristiques de l’AH avec celles du collagène, un matériau largement utilisé dans l’ingénierie du tissu osseux avec les CSM et un matériau utile pour la mise à l’échelle des greffons artificiels pour l’ossification endochondrale17. Dans un modèle de souris immunodéprimées, les constructions d’AH et de collagène ensemencées avec des CSM humaines ont été évaluées pour leur potentiel ECO in vivo par implantation sous-cutanée. Les résultats montrent que les hydrogels d’AH sont excellents comme échafaudage pour les CSM afin de créer des greffes de cartilage artificiel qui permettent la formation osseuse par ECO.

Le protocole est divisé en deux étapes. Tout d’abord, des constructions de CSM humaines ensemencées sur de l’hydrogel d’acide hyaluronique sont préparées et différenciées en cartilage hypertrophique in vitro. Ensuite, les constructions différenciées sont implantées par voie sous-cutanée dans un modèle nu pour induire une ossification endochondrale in vivo (Figure 1).

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Protocol

Ce protocole utilise des souris nues mâles âgées de 4 semaines. Hébergez quatre souris dans une cage soumise à un cycle lumière/obscurité de 12 h à 22−24 °C et à une humidité relative de 50 % à 70 %. Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux directives approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université médicale et dentaire de Tokyo (ID d’approbation : A2019-204C, A2020-116A et A2021-121A).

1. Préparation des tampons et des réactifs

  1. Préparez le milieu de croissance des cellules souches mésenchymateuses (milieu de croissance MSC) en ajoutant le kit de supplément de milieu de croissance MSC au milieu basal MSC et conservez-le à 4 °C.
  2. Préparez le milieu Eagle modifié de Dulbecco et le milieu F12 (DMEM/F-12) de Ham’s en ajoutant 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 50 μg/mL de gentamicine, 200 μM de L-alanyl-L-glutamine et 1 ng/mL de facteur de croissance fibroblastique basique au milieu et conservez-le à 4 °C.
  3. Préparer le milieu chondrogénique en ajoutant 1 % de supplément ITS-G, 0,12 % d’albumine sérique bovine, 50 μg/mL de gentamicine, 0,35 mM de L-proline, 100 nM de dexaméthasone et 10 ng/mL de TGF-β3 au DMEM juste avant l’utilisation.
  4. Préparer le milieu hypertrophique en ajoutant 10 mM de β-glycérophosphate, 0,12 % d’albumine sérique bovine, 10 nM de dexaméthasone, 200 μM d’ascorbate-2-phosphate, 50 nM de L-thyroxine, 50 μg/mL de gentamycine et 50 pg/mL d’IL-1β au DMEM juste avant utilisation.
  5. Enduire une boîte de culture à 24 puits de 200 μL de paraffine fondue préchauffée à 60 °C. Laisser reposer à température ambiante jusqu’à ce que la paraffine soit prise.

2. Expansion des CSM humaines

NOTA : Avant de commencer les expériences, les CSM présentant un potentiel élevé de chondrogenèse des CSM doivent être sélectionnées en microculture de masse comme décrit en17.

  1. Selon les instructions du fabricant, cultiver des CSM primaires dérivées de la moelle osseuse humaine (passage 2) avec un milieu de croissance CSM dans une boîte de 10 cm à une densité de 5 x 103 cellules/cm 2 à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 et à 95 % d’air humidifié.
  2. Changez le support tous les 2-3 jours. Une fois que les cellules ont atteint 80 à 90 % de confluence, aspirez le milieu de la boîte de culture cellulaire à l’aide d’une pompe à vide, lavez avec 5 ml de PBS, puis aspirez la solution avec une pompe à vide.
  3. Ajouter 1 mL de solution de trypsine à 0,05 % et d’EDTA à 0,02 % dans le plat. Incubez le plat pendant 5-10 min à 37 °C.
  4. Ajouter 1 mL de milieu de croissance MSC pour arrêter la réaction enzymatique. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 50 ml.
  5. Mélangez la suspension cellulaire d’autres plats dans le tube de 50 ml et conservez-la sur de la glace.
  6. Utilisez le compteur de cellules pour compter les cellules en mélangeant 10 μL de la suspension cellulaire avec 10 μL de colorant bleu trypan à 0,4 %.
  7. Centrifuger la suspension cellulaire restante à 220 x g pendant 3 min à température ambiante. Retirer le surnageant et ajouter la solution de cryoconservation à une concentration de 1,0 x 106 cellules par mL.
  8. Verser 1 mL de la suspension cellulaire dans chaque cryotube et conserver à -80 °C pendant 12 h avant de passer à l’azote liquide. Les stocks congelés qui en résultent (passage 3) sont utilisés pour ce protocole.
  9. Pour les expériences, semer les CSM ensemencées dans une boîte de 10 cm à une densité de 5 x 103 cellules/cm2. Cellules de culture jusqu’à 80%-90% confluentes (passage 4) en milieu DMEM/F-12.

3. Préparation d’hydrogels encapsulés dans le CSM

  1. Trypsiniser les cellules et préparer la suspension cellulaire comme décrit aux étapes 2.3 à 2.6.
  2. Pour faire 10 constructions (2,5 x 105 cellules par construction), aliquote la suspension cellulaire contenant 2,5 x 106 cellules dans un microtube de 1,5 mL.
  3. Centrifuger la suspension à 220 x g pendant 3 min, retirer le surnageant à l’aide d’une pompe à vide et le maintenir sur la glace.
  4. Amenez l’acide hyaluronique (AH) modifié au thiol, la réticulation réactive au thiol, le diacrylate de polyéthylène glycol et les bouteilles d’eau dégazées à température ambiante.
  5. Dans des conditions stériles, ajouter 1,0 mL d’eau dégazée dans le flacon contenant de l’AH (voir les instructions du fabricant) à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille.
  6. Tourbillon se réchauffant de temps en temps jusqu’à 37 °C jusqu’à ce que la solution devienne claire, puis placez-le sur de la glace. Il faut moins de 30 minutes pour que les solides se dissolvent complètement.
  7. Dans des conditions stériles, ajoutez 0,5 mL d’eau dégazée dans le flacon de réticulation à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille. Dissoudre en retournant plusieurs fois, puis placer sur de la glace.
  8. Ajouter 120 μL de la solution d’AH dissoute à la pastille alizée (2,5 x 106 cellules). Remettez en suspension la pastille de cellule en pipetant d’avant en arrière.
  9. Ajouter 30 μL de la solution de réticulation dissoute dans le tube contenant l’AH et les cellules (étape 3.8) et mélanger en tapotant le tube, puis faire tourner brièvement. Combinez la solution HA et la solution de réticulation dans un rapport de 4 :1.
  10. Déposez 15 μL de la solution combinée contenant des CSM (2,5 x 105 cellules) sur la plaque à 24 puits recouverte de paraffine et laissez-la se solidifier à 37 °C pendant 30 min (Figure 2). En raison de la viscosité élevée, préparez au moins 10 % de quantité supplémentaire de mélange cellule/hydrogel par rapport à nécessaire.
    REMARQUE : Les caractéristiques de l’hydrogel ont été décrites précédemment39.

4. Conditions de différenciation in vitro

  1. Ajouter 0,5 mL de milieu de différenciation chondrogénique à une construction d’hydrogels d’AH semés par MSC. Changez le support tous les 2-3 jours.
  2. Après 3 semaines, passer à un milieu de différenciation hypertrophique (0,5 mL par puits) et cultiver les constructions pendant 2 semaines supplémentaires.

5. Implantation in vivo de CSM

  1. Après un total de 5 semaines de culture in vitro, implanter les constructions par voie sous-cutanée dans le dos des souris nues comme décrit précédemment38,40.
  2. Peser les souris et administrer un anesthésique combiné préparé avec 0,75 mg/kg de poids corporel (p.c.) de médétomidine, 4,0 mg/kg p.c. de midazolam et 5,0 mg/kg p.c. de butorphanol par injection intrapéritonéalecomme décrit 38.
  3. Confirmez l’anesthésie adéquate par immobilité aux stimuli chirurgicaux et surveillez la profondeur respiratoire par des mouvements thoraciques lents et réguliers et un apport adéquat d’oxygène par la couleur de la muqueuse rose périodiquement pendant l’opération. Utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse pendant l’anesthésie.
  4. Placez la souris sur un champ chirurgical stérile en position couchée, stérilisez le site d’incision avec 50 ppm d’eau d’acide hypochloreux (pH 5,0 ; HAW), et placez un champ chirurgical perforé sur la souris.
    REMARQUE : Stérilisez tout le matériel chirurgical dans un autoclave, de l’oxyde d’éthylène gazeux ou HAW. Les chirurgiens doivent se laver les doigts et porter des blouses et des gants chirurgicaux.
  5. Faites deux incisions cutanées de 5 mm de long à 2 cm d’intervalle dans les zones des épaules et des hanches le long de la ligne médiane de la colonne vertébrale à l’aide de ciseaux.
  6. Insérez une spatule par voie sous-cutanée à travers l’incision pour créer une poche sous-cutanée.
  7. Insérez deux à trois constructions (~15 μL chacune, étape 5.1) dans chaque poche à l’aide d’une pince. Les constructions d’AH implantées dans la même poche sont sujettes à la fusion très fréquemment. Pour éviter la fusion, insérez une construction HA dans chaque poche.
  8. Fermez les incisions avec des sutures en soie tressée 4-0. Injecter à la souris un antagoniste des anesthésiques préparé avec 0,75 mg/kg p.c. d’atipamézole comme décrit38.
  9. Pendant que les souris se remettent de l’anesthésie, placez-les dans des cages de récupération stériles contenant une litière stérile au sol sans nourriture ni bouteilles d’eau et surveillez en permanence la température corporelle, le pouls et la respiration.
  10. Ne laissez pas les souris sans surveillance jusqu’à ce qu’elles aient repris suffisamment conscience pour maintenir leur décubitus sternal. Une fois complètement rétablis, remettez les animaux dans la salle d’élevage avec les autres animaux.
  11. Surveillez les animaux tous les deux jours pendant la période de guérison pour détecter toute complication possible. Euthanasier les souris par inhalation de dioxyde de carbone avec peu de souffrance à 4 et 8 semaines après l’implantation.
  12. Inciser la peau au niveau des sites greffés et retirer les constructions implantées à l’aide d’une pince. Fixez les constructions dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 16 h, puis soumettez-les à l’analyse.

6. Analyse statistique

  1. Déclarez les données quantitatives sous forme de moyenne ±écart-type (ET). Effectuer des analyses statistiques à l’aide d’un logiciel commercial.
  2. Utilisez le test t de Student ou l’ANOVA à un facteur suivi du test de comparaisons multiples de Tukey pour déterminer les différences significatives entre les groupes. p<0,05 et p<0,01 indiquent des différences significatives entre deux groupes.

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Representative Results

Les hydrogels d’AH encapsulés dans MSC ont été cultivés dans un milieu chondrogénique supplémenté en TGFβ3, un inducteur de la chondrogenèse41 (étape 4.1). Nous avons comparé les propriétés de l’AH avec celles du collagène, qui s’est avéré efficace dans la création de greffes de cartilage artificiel à base de CSM pour l’ossification endochondrale, comme décrit précédemment38. Les CSM indifférenciées n’ont pas été incluses comme témoins négatifs dans cette étude, car il a été démontré que les CSM indifférenciées nécessitent des surfaces minéralisées comme substrat d’amorçage pour générer de l’os par différenciation ostéogénique (c.-à-d. ossification intramembranaire)7.

La taille des hydrogels d’acide hyaluronique n’a pas changé tout au long de la période de culture in vitro , comme on peut le constater sur la base des diamètres mesurés au microscope inversé, tandis que les hydrogels de collagène utilisés pour la comparaison ont commencé à rétrécir peu de temps après le début de la culture. Pour réduire la différence de taille entre les constructions d’AH et de collagène après culture in vitro , le nombre de CSM et le volume du gel utilisé pour créer les hydrogels d’AH ont été divisés par deux par rapport à ceux utilisés pour les hydrogels de collagène. Cependant, le poids humide des constructions HA après 3 semaines de culture cartilagineuse était 4 fois plus lourd que celui des constructions de collagène.

Différenciation chondrogénique et hypertrophique in vitro.
Après différenciation chondrogénique (à la semaine 3 de culture in vitro ), glycosaminoglycanes sulfatés (sGAG) positifs (safranine O/coloration verte rapide ; Graphique 3A) et une matrice extracellulaire positive au collagène de type II a été observée dans les deux constructions, indiquant que l’AH et les hydrogels de collagène soutenaient la chondrogenèse. Cependant, par rapport à la construction du collagène, la distribution du sGAG, du collagène de type II (Col II) et du collagène de type X (Col X) était plus homogène dans tout le tissu dans les constructions HA. Des différences entre les deux constructions étaient également apparentes dans la morphologie cellulaire : des cellules avec une morphologie arrondie semblable à celle d’un chondrocyte étaient réparties dans tout le tissu dans les constructions HA. Dans les constructions de collagène, cependant, les cellules de la périphérie ont montré une morphologie hétérogène, allant d’une morphologie irrégulière/étirée à une morphologie arrondie. Dans le même ordre d’idées, la rondeur moyenne des cellules dans les constructions HA était plus élevée que dans les constructions de collagène, à la fois dans les régions périphériques et centrales (34 % contre 77,6 % (p<0,01) et 78,3 % contre 100 % (p<0,05), respectivement ; Graphique 3B). À 5 semaines de culture, des dépôts de calcium ont été détectés sur les bords extérieurs dans les deux constructions (rouge d’alizarine ; Graphique 3C). De plus, l’expression de marqueurs chondrogéniques (Sox-9, aggrécan (ACAN), Col II), hypertrophiques (Col X, métallopeptidase matricielle 13 (MMP-13)) et ostéogéniques (collagène de type I (Col I), sialoprotéine osseuse (BSP), ostéocalcine (OCN))14 a été détectée par RT-PCR quantitative en temps réel, confirmant la progression de la différenciation chondrogénique et hypertrophique au cours de la culture in vitro (Figure 4).

Ossification endochondrale de constructions implantées par voie sous-cutanée in vivo.
Des poches sous-cutanées ont été créées sur le dos de souris nues, et deux à trois constructions ont été implantées dans chaque poche après différenciation hypertrophique (à la semaine 5 de culture in vitro). À 4 ou 8 semaines après l’implantation, toutes les constructions d’AH étaient attachées les unes aux autres dans les poches implantées (tableau 1). Dans les constructions de collagène, l’adhérence a été observée dans 60% des poches, tandis que dans les poches restantes, les greffons étaient indépendants les uns des autres. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) a révélé que dans les deux constructions, à 8 semaines après l’implantation, du tissu ostéoïde à morphologie lamellaire s’est formé dans les régions externes des constructions (Figure 5Aa,f). La coloration sGAG a disparu dans les constructions HA, indiquant la perte de leur phénotype cartilagineux (Figure 5Ah). Dans les deux constructions, un composant de la moelle osseuse contenant des cellules hématopoïétiques et du tissu adipeux s’est formé entre le cartilage interne et les tissus ostéoïdes externes. Dans toutes les constructions d’AH, les tissus osseux des constructions fusionnées étaient connectés et entourés de tissu fibreux articulaire et de moelle osseuse développée le long de l’espace entre les deux constructions adhérentes, ce qui indique que les constructions d’AH multiples ont tendance à former du tissu osseux intégré (Figure 5Ag). Les constructions de collagène adhérées ont été intégrées de manière similaire dans deux des trois cas fusionnés, mais dans le troisième cas, le tissu osseux des deux constructions n’était pas connecté (tableau 1 et figure 5Ab). Dans les deux constructions, des vaisseaux identifiés par des cellules endothéliales CD31 positives42 ont été observés dans la moelle osseuse (figures 5Ad,i), et les régions cartilagineuses internes étaient entourées de cellules multinucléées TRAP-positives de la lignée ostéoclaste, ce qui indique que le tissu cartilagineux était sujet à un remodelage (figures 5Ae,j).

Le minéral s’est déposé dans la région ostéoïde externe dans les constructions d’AH et de collagène (Figure 5B). Bien que la densité minérale totale du nouvel os soit similaire entre les constructions d’AH et de collagène, le volume minéral était significativement plus élevé dans les constructions d’AH que dans les constructions de collagène, ce qui peut refléter le fait que les hydrogels d’AH n’ont pas rétréci pendant la culture in vitro , ce qui a donné des constructions plus grandes que les hydrogels de collagène (Figure 5C, D).

Figure 1
Figure 1 : Plan d’expérience. La première étape de ce protocole consiste à encapsuler des CSM expansées dans des hydrogels d’AH afin de favoriser la différenciation chondrogénique et hypertrophique in vitro. Les constructions sont cultivées dans des conditions de différenciation chondrogénique pendant 3 semaines, suivies de 2 semaines supplémentaires dans des conditions de différenciation hypertrophique. La deuxième étape de ce protocole consiste à implanter les constructions par voie sous-cutanée dans des souris nues à la semaine 5 de culture in vitro pour subir une ossification endochondrale in vivo pendant 8 semaines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Préparation d’hydrogels semés par des CSM. Déposer une solution modifiée d’AH/réticulant contenant des CSM sur une plaque à 24 puits enrobée de paraffine et laisser se solidifier à 37 °C pendant 30 min. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Analyse histologique et immunohistochimique des constructions d’AH et de collagène après culture in vitro 22. (A) Les constructions à 3 semaines (3W) de culture in vitro ont été colorées pour le sGAG (safranine O/vert rapide), le collagène de type II (Col II) et le collagène de type X (Col X). (B) Les valeurs moyennes de circularité des cellules à 3 semaines de culture in vitro (n = 5). Les barres ouvertes et grises indiquent respectivement les constructions de collagène et d’AH. Les groupes sans lettre commune sont statistiquement différents (a versus b, p<0,01 ; b versus c, p<0,05). (C) Les constructions à 5 semaines (5W) de culture in vitro ont été colorées pour le calcium (rouge d’alizarine). Toutes les images ont été capturées avec le même grossissement (barre d’échelle : 200 μm). Une vue d’ensemble à faible grossissement de l’ensemble des tissus est présentée dans les encarts (barre d’échelle : 1 mm). Les barres d’erreur représentent la moyenne ±écart-type (ET). L’ANOVA à un facteur suivie du test de comparaisons multiples de Tukey a été utilisée pour déterminer les différences significatives entre les groupes. Ce chiffre a été modifié par rapport à38. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Analyse de l’expression génique de l’AH et des constructions de collagène à 3 et 5 semaines de culture in vitro. (A) Marqueurs chondrogènes et hypertrophiques. (B) Marqueurs ostéogéniques. Les valeurs sont présentées sous forme de moyenne ±écart-type (ET) (n = 3). Les CSM indifférenciées ont exprimé des niveaux élevés de Col I et de MMP-13 et de faibles niveaux de Sox-9 et de Col X ; ils n’ont pas exprimé (#) ACAN, Col II, BSP et OCN. Les barres d’erreur représentent la moyenne ±écart-type (ET). Ce chiffre a été modifié par rapport à38. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Analyse immunohistochimique et calcification de l’AH et du collagène post-implantation à 8 semaines. (A) Les constructions ont été colorées pour l’hématoxyline et l’éosine (H&E, a, b, f et g), la safranine O/Fast Green (c et h), les cellules endothéliales (cluster de différenciation 31, CD31) (d et i) et la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP, e et j). (a et f) Vue d’ensemble de l’ensemble des tissus (barre d’échelle = 500 μm). H&E, safranine O, CD31 : barre d’échelle = 200 μm ; PIÈGE : barre d’échelle = 50 μm. Les flèches indiquent les cellules endothéliales CD31 positives. Abréviations : c = tissu cartilagineux interne ; o = tissu ostéoïde externe. (B) Imagerie MicroCT (μCT) des constructions de collagène et d’AH (barres d’échelle de l’image principale et de l’image insérée = 2 mm). (C,D) La densité minérale totale (C) et le volume (D) de l’AH et du collagène sont constitués (n = 4). ** indique des différences significatives ; p <0,01. Quatre constructions ont été analysées par groupe à l’aide de μCT. Les barres d’erreur représentent la moyenne ±écart-type (ET). Le test t de Student a été utilisé pour déterminer les différences significatives entre les groupes. Ce chiffre a été modifié par rapport à38. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Stratégie de facilitation des ECO à l’aide de cartilage artificiel à base d’AH. Diagramme schématique de l’ossification et du développement de la moelle osseuse sans et avec fragmentation (μ-pastilles) des constructions d’AH implantées. (A) Les hydrogels d’AH ont une excellente tendance à la fusion pour former un os intégré avec vascularisation et développement de la moelle entre les greffons fusionnés in vivo. Le tissu implanté qui en a résulté, cependant, est resté principalement à l’état de cartilage même 8 semaines après l’implantation. (B) Compte tenu de la tendance des constructions d’AH à fusionner pour former de l’os intégré, la transformation des constructions d’AH en μ-pastilles peut accélérer le taux de remodelage des tissus transplantés et favoriser la formation osseuse. La micronisation des constructions augmente la surface, ce qui peut favoriser la résorption du tissu cartilagineux et la formation de tissu osseux et peut également favoriser l’angiogenèse et le développement de la moelle osseuse en raison de l’espace accru pour l’infiltration des cellules hôtes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Hydrogel Expériences Respectées Uni % Unis
Collagène 5 3 2 40
HA 5 5 5 100

Tableau 1 : Taux d’unification lorsque plusieurs constructions ont été implantées dans une seule poche. Deux ou trois constructions ont été implantées par voie sous-cutanée dans une seule poche. Les constructions ont été récoltées 4 ou 8 semaines après l’implantation et examinées histologiquement.

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Discussion

L’utilisation de matériaux d’échafaudage appropriés qui favorisent la transition du cartilage hypertrophique à l’os est une approche prometteuse pour mettre à l’échelle les greffes de cartilage hypertrophique à base de CSM et traiter les défauts osseux de taille cliniquement significative. Ici, nous montrons que l’AH est un excellent matériau d’échafaudage pour soutenir la différenciation du tissu cartilagineux hypertrophique à base de CSM in vitro et pour favoriser la formation osseuse endochondrale in vivo38. De plus, in vivo, il a été démontré que les constructions d’AH facilitent la fusion de plusieurs constructions implantées dans la même poche pour former un seul os intégré. Étant donné que l’interaction des CSM avec les matériaux d’échafaudage affecte de manière significative le cartilage et la chondrogenèse hypertrophique, il est important de choisir un matériau d’échafaudage approprié pour les ECO afin de générer des greffes de cartilage issues de l’ingénierie tissulaire cliniquement efficaces. Les cellules incorporées dans les hydrogels d’AH présentent uniformément une morphologie arrondie caractéristique des chondrocytes du centre à la périphérie, indiquant que l’acide hyaluronique fournit un environnement propice à la formation uniforme de cartilage dans tout l’hydrogel21,30. Contrairement à l’AH, le collagène interagit avec les CSM via des séquences de liaison à l’intégrine (RGD) ; cependant, la persistance de cette interaction empêche les CSM de se différencier davantage dans la voie chondrogénique43, ce qui peut expliquer la morphologie non typique des cellules chondrocytes qui est proéminente à la périphérie des constructions de collagène.

Si plusieurs greffons s’unissent pour former un seul os, cette approche médiée par l’ECO peut être étendue à des défauts osseux plus pertinents sur le plan clinique. Lorsque plusieurs cartilages hypertrophiques à base de CSM et sans échafaudage ont été appliqués à un seul défaut osseux, il a été rapporté que les greffes de cartilage se sont intégrées au défaut osseux. Cependant, les greffons adjacents ne se sont pas intégrés les uns aux autres22. L’approche présentée ici peut offrir une solution possible pour surmonter cette limitation. Par rapport aux constructions de collagène, les greffes multiples de constructions d’AH avaient une plus grande tendance à fusionner pour former un seul os. De plus, la moelle osseuse s’est formée entre les constructions d’AH fusionnées, ce qui peut être lié au fait que l’AH favorise une différenciation uniforme du cartilage dans tout l’hydrogel, car le cartilage hypertrophique sécrète du VEGF et fournit un environnement pour la niche des cellules souches hématopoïétiques dans le développement de la moelle osseuse 44.

La clé de la réussite d’une expérience utilisant ce protocole est la qualité des CSM. Il est recommandé de confirmer à l’avance que les CSM à utiliser ont un potentiel de différenciation chondrogénique suffisamment élevé. Deuxièmement, la taille de chaque construction ne doit pas être trop grande. D’après notre expérience, le volume d’une seule construction est limité à 10-15 μL. Des constructions plus grandes peuvent entraîner une pénétration insuffisante de l’oxygène et des nutriments dans les constructions, entraînant une nécrose et une mauvaise différenciation au centre des constructions. Par conséquent, l’épaisseur du gel doit être réduite pour améliorer la pénétration de l’oxygène et des nutriments. Afin de réduire l’épaisseur du gel, il peut être utile de créer des gels minces sur la membrane poreuse des inserts Transwell14,45. Alternativement, étant donné que les constructions HA ont tendance à fusionner et à former un os intégré, il peut être adéquat d’implanter de nombreuses constructions plus petites plutôt qu’une seule grande construction, comme indiqué ci-dessous.

Les limites de cette étude incluent la nécessité d’accélérer le taux de remodelage des tissus implantés pour faciliter la formation osseuse. Le tissu artificiel implanté est resté principalement dans un état de cartilage calcifié hypertrophique même 8 semaines après l’implantation. Dans la formation osseuse via la voie ECO, les cellules dérivées de l’hôte jouent un rôle essentiel dans la promotion de l’ECO16,46. Il a été rapporté que l’apport de canaux supplémentaires dans les greffes de cartilage hypertrophique favorise l’invasion vasculaire et la minéralisation du greffon in vivo20. Ces canaux servent de conduits pour l’infiltration des cellules hôtes, y compris les ostéoblastes, les ostéoclastes et les précurseurs hématopoïétiques, pour former de nouveaux tissus au sein de la construction. Alternativement, il a été rapporté que plusieurs petites pastilles encapsulées dans la fibrine (μ-pastilles) composées de CSM différenciées chondrogènes peuvent être implantées pour former de l’osintégré 47. La transformation des constructions d’AH en pastilles de μ pourrait augmenter la surface entourée d’ostéoclastes TRAP-positifs, favorisant ainsi le taux de remodelage du tissu cartilagineux et améliorant l’ostéogenèse (Figure 6)21,48. De plus, l’implantation de granules de μ augmenterait l’espace d’infiltration des cellules hôtes, facilitant ainsi l’angiogenèse et le développement de la moelle osseuse et générant une formation osseuse intégrale avec une vascularisation abondante. Ainsi, compte tenu de la tendance des constructions d’AH à fusionner et à créer de l’os intégré, cette stratégie de régénération osseuse μ-construite peut accélérer le processus ECO des greffes de cartilage hypertrophique à l’aide d’hydrogels d’AH.

En conclusion, les hydrogels d’AH sont efficaces pour mettre à l’échelle des greffons d’ingénierie tissulaire avec moins de cellules et de gels que les hydrogels de collagène. De plus, les hydrogels d’AH ont une excellente sensibilité à la fusion et produisent un os intégré avec vascularisation et développement de la moelle entre les greffons fusionnés. Par conséquent, la modification des constructions de l’AH pour favoriser l’infiltration de la cellule hôte et le remodelage du greffon peut conduire au développement de matériaux implantables qui peuvent favoriser davantage la vascularisation et le développement de la moelle osseuse. Avec une optimisation plus poussée, cette approche pourrait être une alternative prometteuse aux thérapies osseuses actuelles en chirurgie maxillo-faciale et orthopédique.

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Disclosures

Les auteurs ont déclaré qu’il n’y avait pas d’intérêts concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par une subvention d’aide à la recherche scientifique (KAKENHI) de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) (subvention nos. JP19K10259 et 22K10032 à MAI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution FUJIFILM Wako Pure Chemical  209-16941
Antisedan Nippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphate Nacalai Tesque 13571-14
Bambanker GC Lymphotec CS-02-001
basic fibroblastic growth factor Reprocell RCHEOT002 
bovine serum albumin FUJIFILM Wako Pure Chemical  012-23881 7.5 w/v%
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% Invitrogen C10283
dexamethasone Merck D8893
Domitor Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum Astellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle Medium Merck D6429 high glucose
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Merck D6421
Fetal bovine serum Hyclone SH30396.03
Gentamicin sulfate FUJIFILM Wako Pure Chemical  1676045  10 mg/mL
Haccpper Generator TechnoMax CH-400-5QB 50 ppm hypochlorous acid water
Human Mesenchymal Stem Cells Lonza PT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold Kit Merck HYS020
IL-1ß PeproTech AF-200-01B
ITS-G supplement FUJIFILM Wako Pure Chemical  090-06741 ×100
L-Alanyl-L-Glutamine FUJIFILM Wako Pure Chemical  016-21841 200mmol/L (×100)
L-proline Nacalai Tesque 29001-42
L-Thyroxine Merck T1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium
BulletKit		 Lonza PT-3001
paraffin FUJIFILM Wako Pure Chemical  165-13375
PBS / pH7.4 100ml Medicago 09-2051-100
TGF-β3  Proteintech HZ-1090
Vetorphale Meiji Seika Kaisha
Visiocare Ointment SAVAVET/SAVA Healthcare
β-glycerophosphate FUJIFILM Wako Pure Chemical  048-34332

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Yamazaki, S., Lin, Y., Marukawa, E., Ikeda, M. A. Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (197), e65573, doi:10.3791/65573 (2023).

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