Summary
I denne undersøgelse blev en roman inden for planta-genekspression og genredigeringsmetode medieret af Agrobacterium udviklet i bambus. Denne metode forbedrede i høj grad effektiviteten af genfunktionsvalidering i bambus, hvilket har betydelige konsekvenser for at fremskynde processen med bambusavl.
Abstract
En ny planta gentransformationsmetode blev udviklet til bambus, som undgår behovet for tidskrævende og arbejdskrævende callus induktions- og regenereringsprocesser. Denne metode involverer Agrobacterium-medieret genekspression via sår og vakuum til bambusplanter. Det demonstrerede med succes ekspressionen af eksogene gener, såsom RUBY-reporteren og Cas9-genet, i bambusblade. Den højeste transformationseffektivitet til akkumulering af betalain i RUBY-frøplanter blev opnået ved anvendelse af GV3101-stammen med en procentdel på 85,2% efter infektion. Selvom det fremmede DNA ikke blev integreret i bambusgenomet, var metoden effektiv til at udtrykke de eksogene gener. Desuden er der også udviklet et genredigeringssystem med en indfødt reporter ved hjælp af denne metode, hvorfra en in situ-mutant genereret af det redigerede bambusviolaxanthin de-epoxidase-gen (PeVDE) i bambusblade med en mutationshastighed på 17,33%. Mutationen af PeVDE resulterede i reducerede ikke-fotokemiske slukningsværdier (NPQ) under højt lys, som kan detekteres nøjagtigt af et fluorometer. Dette gør den redigerede PeVDE til en potentiel indfødt reporter for både eksogene og endogene gener i bambus. Med reporteren fra PeVDE blev et cinnamoyl-CoA-reduktasegen med succes redigeret med en mutationshastighed på 8,3%. Denne operation undgår processen med vævskultur eller callusinduktion, hvilket er hurtigt og effektivt til at udtrykke eksogene gener og endogen genredigering i bambus. Denne metode kan forbedre effektiviteten af genfunktionsverifikation og vil hjælpe med at afsløre de molekylære mekanismer i vigtige metaboliske veje i bambus.
Introduction
Undersøgelsen af genfunktionen i bambus er meget lovende for den avancerede forståelse af bambus og frigør dets potentiale for genetisk modifikation. En effektiv måde at opnå dette på kan opnås gennem processen med Agrobacterium-medieret infektion i bambusblade, hvorved T-DNA-fragmentet indeholdende eksogene gener indføres i cellerne, hvilket efterfølgende fører til ekspression af generne i bladcellerne.
Bambus er en værdifuld og vedvarende ressource med en bred vifte af anvendelser inden for fremstilling, kunst og forskning. Bambus besidder fremragende træegenskaber såsom høj mekanisk styrke, sejhed, moderat stivhed og fleksibilitet1, som nu er meget udbredt i en række husholdnings- og industrielle forsyninger, herunder tandbørster, sugerør, knapper, engangsservice, underjordiske rørledninger og køletårnfyldstoffer til termisk elproduktion. Derfor spiller bambusavl en afgørende rolle i at opnå bambussorter med fremragende træegenskaber til erstatning af plast og reduktion af plastforbrug, beskyttelse af miljøet og håndtering af klimaændringer samt generering af betydelig økonomisk værdi.
Imidlertid står traditionel bambusavl over for udfordringer på grund af det lange vegetative vækststadium og usikre blomstringsperiode. Selvom molekylære avlsteknikker er blevet udviklet og anvendt til bambusavl, er processen med bambusgentransformation tidskrævende, arbejdskrævende og kompliceret på grund af callus-induktions- og regenereringsprocesserne 2,3,4,5. Stabil genetisk transformation kræver ofte Agrobacterium-medierede metoder, som involverer vævskulturprocesser såsom callus induktion og regenerering. Imidlertid har bambus en lav evne til regenerering af hård hud, hvilket i høj grad begrænser anvendelsen af stabil genetisk transformation i bambus. Efter at Agrobacterium inficerer planteceller, kommer T-DNA-fragmentet ind i plantecellerne, hvor størstedelen af T-DNA-fragmenterne forbliver ikke-integrerede i cellerne, hvilket resulterer i forbigående ekspression. Kun en lille del af T-DNA-fragmenter integreres tilfældigt i dets kromosom, hvilket fører til stabilt udtryk. De forbigående ekspressionsniveauer viser en akkumuleringskurve, der kan variere for hvert gen udtrykt fra et Agrobacterium-leveret T-DNA. I de fleste tilfælde forekommer de højeste ekspressionsniveauer 3-4 dage efter infiltration og falder hurtigt efter 5-6 dage 6,7. Tidligere undersøgelser har vist, at mere end 1/3 af mutationerne i genredigerede planter opnået uden selektionstryk for resistens kommer fra den forbigående ekspression af CRISPR/Cas9, mens de resterende mindre end 2/3 kommer fra stabil ekspression efter DNA-integration i genomet8. Dette indikerer, at T-DNA-integration i plantegenomet ikke er nødvendig for genredigering. Desuden hæmmer selektionstryk for resistens signifikant væksten af ikke-transgene celler, hvilket direkte påvirker regenereringsprocessen af inficerede eksplanter. Ved at bruge forbigående ekspression uden selektionstryk for resistens i bambus er det derfor muligt at opnå ikke-integreret ekspression af eksogene gener og studere genfunktion direkte i planteorganer. Derfor kan der udvikles en nem og tidsbesparende metode til eksogen genekspression og redigering i bambus9.
Den udviklede eksogene genekspressions- og genredigeringsmetode er kendetegnet ved sin enkelhed, omkostningseffektivitet og fraværet af dyrt udstyr eller komplekse procedurer9. I denne metode blev bambusendogent violaxanthin de-epoxidase-genet (PeVDE) brugt som reporter til eksogen genekspression uden selektionstryk. Dette skyldes, at den redigerede PeVDE i bambusblade reducerer fotobeskyttelsesevnen under højt lys og demonstrerer et fald i den ikke-fotokemiske slukningsværdi (NPQ), som kan detekteres gennem klorofylfluorescensbilleddannelse. For at demonstrere effektiviteten af denne metode blev et andet bambusendogent gen, cinnamoyl-CoA-reduktasegenet (PeCCR5)9, slået ud ved hjælp af dette system og genererede med succes mutanter af dette gen. Denne teknik kan bruges til funktionel karakterisering af gener, der har funktioner i bambusblade. Ved at overudtrykke disse gener forbigående i bambusblade kan deres ekspressionsniveauer forbedres, eller ved genredigering kan deres ekspression slås ned, hvilket giver mulighed for undersøgelse af nedstrøms genekspressionsniveauer, bladfænotyper og produktindhold. Dette giver en mere effektiv og gennemførlig tilgang til genfunktionsforskning i bambus. Denne teknik kan anvendes til funktionel karakterisering af gener, der fungerer i bambusblade. Ved at overudtrykke disse gener forbigående i bambusblade kan deres ekspressionsniveauer forbedres, eller ved genredigering kan deres ekspression slås ned, hvilket giver mulighed for undersøgelse af nedstrøms genekspressionsniveauer, bladfænotyper og produktindhold. Derudover er det vigtigt at bemærke, at på grund af omfattende polyploidisering er størstedelen af kommercielt vigtige gener i bambusgenomer til stede i flere kopier, hvilket resulterer i genetisk redundans. Dette udgør en udfordring for at udføre multiplex genomredigering i bambus. Før anvendelsen af stabil genetisk transformation eller genredigeringsteknikker er det afgørende hurtigt at validere genfunktioner. Ved behandling af spørgsmålet om flere genkopier er en tilgang at analysere transkriptomekspressionsprofiler for at identificere gener, der aktivt udtrykkes i bestemte faser. Desuden giver målretning mod de bevarede funktionelle domæner af disse genkopier mulighed for design af fælles målsekvenser eller inkorporering af flere målsteder i den samme CRISPR / Cas9-vektor, hvilket muliggør samtidig knockout af disse gener. Dette giver en mere effektiv og gennemførlig tilgang til genfunktionsforskning i bambus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af bambusplanter
- Forbered moso bambus (Phyllostachys edulis) frøplanter ved hjælp af frø høstet i Guilin, Guangxi, Kina. Begynd med at lægge frøene i blød i vand i 2-3 dage, og sørg for at skifte vand dagligt. Opret derefter et substrat ved at blande jord og vermikulit i et forhold på 3: 1.
- Så de gennemblødte frø i substratet til spiring. Vedligehold kimplanterne under laboratorieforhold, og hold temperaturen mellem 18-25 °C. Sørg for en 16 timers lys/8 timers mørk fotoperiode med en lysintensitet på 250-350 μmol/m2/s i lysfasen.
- Oprethold en relativ luftfugtighed på ca. 60%. Til Agrobacterium-infektion skal du bruge frøplanter, der er 15 dage gamle og har en højde på 2-10 cm, hvilket er det bedste stadium for transformation.
BEMÆRK: Fordi bambusblomstring er uforudsigelig, er frø ikke tilgængelige hvert år. Frøene opbevares normalt i 2-3 år ved 4 °C i tørre omgivelser og kan stadig opretholde en levedygtighed på over 20%.
2. Fremstilling af plasmider og Agrobacterium
- Plasmider: For at validere den forbigående ekspressionseffekt skal du anvende pHDE-35S::RUBY-konstruktionen, der indeholder et synligt reportergen drevet af CaMV 35S-promotoren 10. Til genredigering skal du bruge konstruktionen pCambia1300-Ubi::Cas9, som bærer Cas9-genet drevet af majs Ubi-promotoren 11. Indsæt sgRNA-styresekvenserne af PeVDE og andre målgener mellem de to AarI-steder i pCambia1300-Ubi::Cas9 konstruktion9.
- Indsæt CRISPR / Cas9 guide RNA-sekvenserne mellem de to AarI-restriktionsendonukleasesteder i pCambia1300-Ubi:: Cas9-konstruktionen , inklusive PeVDE - og PeCCR5-målgener .
- Tilføj GGCA til 5'-enden af 20-nukleotidsekvensen og syntetiser en enkeltstrenget DNA-sekvens. Omvendt komplementere 20-nukleotidsekvensen og tilføj AAAC til 5'-enden, syntetiser derefter en anden enkeltstrenget DNA-sekvens.
- Begge enkeltstrengede DNA-sekvenser fortyndes til en koncentration på 10 nM/l i fortyndet vand, blandes grundigt og opvarmes til 95 °C i 5 minutter. Lad blandingen afkøle til stuetemperatur, hvilket resulterer i dannelse af dobbeltstrengede adaptere.
- Forbind adapterne med det lineære pCambia1300-Ubi::Cas9-fragment fordøjet af AarI-endonuklease ved hjælp af T4 DNA-ligase og sekvenser den konstruerede CRISPR/Cas9-vektor for at opnå den ønskede genmålretningskonstruktion.
- For at omdanne plasmider til Agrobacterium skal du bruge fryse-optøningsmetoden som følger: Bland 1 μL plasmiderne (koncentration: 10 - 1.000 ng / μL) med 100 μL Agrobacterium-kompetente celler (translationseffektivitet: > 1 x 10 4 kolonidannende enheder / μg) og bland dem forsigtigt. Anbring blandingen på is i 5 min. Overfør blandingen til flydende nitrogen i 5 min.
- Optø blandingen i et 37 °C vandbad i 5 min. Der tilsættes 500 μL Luria-Bertani (LB)-substrat til blandingen og inkuberes på en rysteinkubator ved 28 °C ved 200 rpm i 2-3 timer. For pHDE-35S::RUBY-plasmider introduceres dem individuelt i AGL1-, GV3101-, LBA4044- og EHA105-stammerne af Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens)12. For CRISPR / Cas9 plasmider, introducer dem i GV3101 stammen af A. tumefaciens.
- Agrobacterium dyrkes i gærekstraktpeptonmedium (YEP) (10 g oksekødekstrakt, 10 g gærekstrakt og 5 g NaCl pr. L) med de tilsvarende antibiotika (spectinomycin til 35S::RUBY og kanamycin til CRISPR/Cas9) ved 28 °C. De enkelte kolonier blev observeret 36-48 timer efter dyrkning.
- Pluk og overfør kolonierne til flydende YEP-medium (med tilsvarende antibiotika) for yderligere vækst. Efter 24-36 timer skal du bruge primerne af RUBY-F og RUBY-R (tabel 1) til at udføre PCR for at bekræfte den vellykkede overførsel af plasmider til Agrobacterium.
- Overfør 1 ml af den vellykkede omdannede Agrobacterium til 100 ml frisk flydende YEP-medium (med tilsvarende antibiotika) og voks derefter natten over ved 28 ° C til en OD600 på 0,8.
- Bakteriesuspensionen centrifugeres ved 4.000 x g i 5 minutter ved 4 °C, bakteriepelletsen vaskes én gang med suspensionsinfiltrationsmedium (10 mMMgCl2 og 10 mM MES-KOH [pH 5,6]), og centrifugeres derefter igen. Resuspender bakteriepillen i et suspensionsinfiltrationsmedium til en OD600 på 0,6 til bambustransformation.
3. Agrobacterium -medieret i planta transformationssystem
- Forbered dig på transformation; Fjern forsigtigt frøplanterne med jordbundne rødder fra underlaget, og sørg for, at rødderne forbliver intakte. Pakk frøplanterne med stanniol for at opretholde fugt og forhindre jordfrigørelse (figur 1A).
- Overfør de indpakkede frøplanter til et miljø med højere luftfugtighed (relativ luftfugtighed >90%) og lavere belysning (intensitet mindre end 50 μmol / m 2 / s) i en varighed på2 timer.
- Brug en skarp nål fra en sprøjte til at vikle den øverste del af krøllede umodne blade (ca. 1-2 cm fra toppen) af bambusplanterne en eller to gange (som angivet med de røde trekanter i figur 1A).
- Derefter dyppes den sårede øverste del af kimplanterne i suspensioner af Agrobacterium. Udfør hele processen, fra sår til dypning i Agrobacterium hurtigt, da det friske sår vil øge podningseffektiviteten.
- Overfør straks frøplanterne til et vakuumkammer med et tryk på 25-27 mmHg i 2 minutter (figur 1B).
- Efter støvsugning skal du forsigtigt pakke frøplanterne ud og genplante dem i underlaget. Placer frøplanterne i svagt lys eller mørke (<50 μmol / m 2 / s) med høj luftfugtighed (RH > 90%) ved stuetemperatur (18-25 ° C) i2 dage. Derefter dyrkes frøplanterne under normale vækstbetingelser og vandes hver 5-7 dage. Overhold deres fænotyper for at tilvejebringe materialer til efterfølgende eksperimenter.
4. Design af single guide RNA'er (sgRNA'er) til genredigering
- Identificer et protospacer tilstødende motiv (PAM) sted placeret nær et specifikt og bevaret domæne af målgensekvensen. Sørg for, at den specifikke PAM-sekvens er NGG i dette CRISPR/Cas9-system. Kontroller specificiteten på målet af den valgte sekvens ved at udføre en BlastN-søgning mod bambusgenomdatabasen. Sørg for, at sgRNA'et er unikt, især i opstrømsområdet og tæt på PAM 9,11.
BEMÆRK: Denne sammenligning vil effektivt reducere potentielle off-target steder i genomet, der påvirkes af genredigeringsprocessen. - Design to sgRNA'er (sgRNA-1 og sgRNA-2) på den første exon af PeVDE-genet 13. Inkluder alderI-restriktionssteder opstrøms for PAM i sgRNA-1 og XbaI-restriktionssteder opstrøms for PAM i sgRNA-2. Design et sgRNA på den fjerde exon af PeCCR5-genet , som koder for det konserverede motiv af KNWYCYGK. Dette motiv er afgørende for katalysen af CCR14.
- Design en 20 nukleotidafstandssekvens ved siden af PAM-stedet. Denne afstandssekvens vil lede Cas9-enzymet til målstedet for DNA-spaltning og efterfølgende genredigering.
BEMÆRK: Det anbefales at vælge et målområde opstrøms for endonukleaseenzymspaltningsstedet inden for PAM-stedet. Dette vil lette valideringen af genredigeringseffektiviteten.
5. Primerdesign og PCR
- Design manuelt specifikke primere til forstærkning af PeVDE - og PeCCR5-fragmenterne . Design opstrøms og nedstrøms primere til at være placeret mindst 100 bp uden for målstedet med en længdeforskel på over 100 bp for at muliggøre tydelig båndadskillelse under elektroforese. Design primere til amplifikation af RUBY inden for de første 500 bp af genet. En liste over alle anvendte primere findes i tabel 1.
- Brug en high-fidelity DNA-polymerase til PCR. I dette tilfælde skal du bruge DNA-polymerase med høj troskab og effektiv amplifikation i genkloning.
- PCR-reaktionsblandingen fremstilles som følger: 5x buffer (Mg2+ Plus): 4 μL; dNTP-blanding (2,5 mM hver): 1,6 μL; Fremadgående og baglæns primere (10 pmol hver): 1 μL hver; bambus genom-DNA (ca. 50 ng); DNA-polymerase (2,5 U / μL): 0,2 μL; Fortynd vand til et samlet volumen på 20 μL.
- Følg PCR-kørselsbetingelserne: Indledende denaturering ved 98 ° C i 5 minutter; Denaturering ved 98 °C i 10 s; Udglødning ved 56 °C i 5 s; Forlængelse ved 72 °C i 30 s; Gentag denaturering til forlængelse i 32 cyklusser; Endelig forlængelse ved 72 °C i 5 min; Opbevares ved 4 °C på ubestemt tid.
BEMÆRK: PCR-betingelser er angivet som et eksempel og skal muligvis optimeres til specifikke applikationer eller mål.
6. DNA-ekstraktion, endonukleaseenzymfordøjelse og sekventering
- Adskil regionen med lavere NPQ-værdier fra friske bambusbladblade ved hjælp af en saks, som identificeret af billeddannelses-PAM-fluorometeret (se trin 7.4). Frys bladprøverne med flydende nitrogen og overfør de frosne bladprøver til en mørtel. Mal prøverne til et fint pulver ved hjælp af en støder, og tilsæt nok flydende nitrogen under slibeprocessen. Dette trin hjælper med at frigive det cellulære indhold, herunder DNA.
- Genomisk DNA ekstraheres fra det pulveriserede blad ved hjælp af Cetyltrimethylammoniumammoniumbromid (CTAB) metoden. Der tilsættes 50 mg bladpulverprøver til 800 μL af en 2% CTAB-opløsning. Prøven blandes grundigt og inkuberes ved 65 °C i 30 minutter under forsigtig omrystning hvert 5. minut.
- Der tilsættes en tilsvarende mængde chloroform/isoamylalkohol (24:1, v/v), og blandingen rystes kraftigt. Efter centrifugering ved 8.000 g i 8 minutter overføres supernatanten til et nyt glas.
- Der tilsættes en tilsvarende mængde chloroform/isoamylalkohol, og trin 6.3 gentages. Der tilsættes en tilsvarende mængde iskold isopropanol, og vend glasset på hovedet flere gange, før det anbringes ved -20 °C i 30 minutter. Efter centrifugering ved 8.000 x g i 5 minutter kasseres supernatanten.
- DNA-pillen vaskes 2x med 75% ethanol ved 4 °C, og opløses derefter i 50 μL vand.
- Forstærk det genomiske DNA, der indeholder målstedet for målgenerne fra både vildtype- og Agrobacterium-inficerede bambusblade med protokollen i trin 5.4.
- Udfør endonukleaseenzymfordøjelse af PCR-produkterne. Vælg et specifikt enzym, der genkender de ønskede restriktionssteder inden for de amplificerede DNA-fragmenter. Brug Age Iog XbaI endonukleaser til fordøjelsen.
- Der fremstilles en reaktionsblanding bestående af alderI eller XbaI (20 enheder/μL)- 1 μL, 1 μg PCR-produkter, 10x buffer- 5 μL, og der tilsættes vand til et samlet volumen på 50 μL. Der inkuberes ved 37 °C i 1 time.
- Analyser andelen af fordøjede DNA-fragmenter ved hjælp af gelelektroforese. Sammenlign de fordøjede fragmenter fra vildtype- og Agrobacterium-inficerede prøver for at vurdere genredigeringseffektiviteten.
- Sekvenserne TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGAG og GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGAG mærker til 5'-enden af henholdsvis de fremadgående og omvendte primere til forstærkning af PeVDE- og PeCCR5-fragmenterne 9,15. Brug protokollen beskrevet i trin 5.4 til forstærkning. Forbered PCR-produkterne (før fordøjelse) til dyb sekventering.
7. Måling af klorofylfluorescens af NPQ-værdier i blade
- Før målingerne udsættes bambusplanterne for forhold med høj lysintensitet på 1200 μmol / m 2 / s i2 timer. Denne eksponering øger mængden af absorberet lyskvantum og aktiverer fotobeskyttelsessystemet i bladene.
- Brug et billeddannende PAM-fluorometer til at måle in vivo PS II-klorofylfluorescensen af bambusblade. Indstil den aktiniske lysintensitet til 800 μmol/m2/s for 6 minutters fluorescensmålinger. I løbet af denne periode skal du anvende en mættende puls hver 30. s for at opnå klorofylfluorescenskurver. De stabile værdier af kurverne vil blive brugt til beregninger13.
- Beregn den ikke-fotokemiske slukning (NPQ) ved hjælp af formlen:
NPQ = (F m - F m') / F m'
hvor F m repræsenterer den maksimale fluorescens i mørk tilpasset tilstand, og Fm' repræsenterer den maksimale fluorescens i enhver lystilpasset tilstand. - Overvåg NPQ-værdierne fra billedbehandlingssoftwarens visuelle grænseflade. Softwaren tillader realtidsanalyse og visning af fluorescensdata, herunder NPQ-værdierne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Agrobacterium-medieret i planta genekspression i bambusblade
RUBY reporter-genet har vist sig at være effektivt til at visualisere forbigående genekspression på grund af dets evne til at producere levende rød betalain fra tyrosin10. I denne undersøgelse blev Agrobacterium-medieret transformation brugt til forbigående at udtrykke det eksogene RUBY-gen i bambusblade (figur 1). På de 3. dage efter infektion blev der observeret rød farve i de umodne foldede blade, som blev mere levende på den 5. dag, når bladene var foldet ud (blå trekant, figur 1C). Disse resultater viser, at Agrobacterium med succes medierede ekspressionen af det eksogene RUBY-gen i bambusblade, og at betalainsyntese opstod.
Desuden blev fire stammer af Agrobacterium (AGL1, LBA4404, EHA105 og GV3101) sammenlignet og fandt, at GV3101-stammen forårsagede den mest signifikante betalain-akkumulering i inficerede bambusblade, med den højeste procentdel på 85,2% af frøplanter akkumuleret betalain efter at være inficeret, efterfulgt af AGL1 (76,9%) og derefter EHA105 (49,1%) og LBA4404 (31,3%; Figur 1D). Dette tyder på, at GV3101 er den mest egnede stamme til dette formål. High-fidelity PCR blev udført for at detektere, om det Agrobacterium-medierede T-DNA-fragment var integreret i bambuskromosomet. Efter 40 cyklusser med PCR blev der ikke påvist bånd af RUBY-genet, hvilket indikerer, at T-DNA-fragmentet ikke integrerede eller var integreret i et så lavt antal, at det ikke kunne detekteres. Disse resultater konkluderer således, at denne genekspression er forbigående.
Samlet set viser disse resultater gennemførligheden af Agrobacterium-medieret forbigående i planta-genekspression i bambus ved hjælp af RUBY-reportergenet. Den røde betalainfarve viste sig imidlertid at være ustabil og forsvandt efter 3 måneders infektion, hvilket indikerer, at det forbigående ekspressionssystem ikke er stabilt til langvarig observation.
I planta genredigering af bambus violaxanthin de-epoxidase gen (PeVDE)
Agrobacterium-medieret i planta genekspression er en forbigående metode til genekspression i bambus. For at undersøge, om et forbigående CRISPR/Cas9-system kunne opnå genredigering i bambusblade, blev nøgleenzymet i bambus' xanthophyllcyklus, violaxanthin de-epoxidase (PeVDE), udvalgt som mål for forsøgsgenredigering. Single guide RNA'er (sgRNA'er) blev designet på den første exon af PeVDE-genet (sgRNA-1), som indeholder restriktionssteder for alderI opstrøms for protospacerens tilstødende motiv (PAM) for at lette genredigeringsvalidering (figur 2A).
CRISPR/Cas9-konstruktionen, der bærer sgRNA-1, blev transfekteret til Agrobacterium for at omdanne bambusblade. Efter infektion af Agrobacterium indeholdende CRISPR / Cas9-konstruktionerne, der bærer sgRNA-1 i 5 dage, blev bambusplanter udsat for høj lysbehandling, og efterfølgende blev klorofylfluorescensparameterdetektion udført. Visse områder af bladblade blev fundet, der havde lavere ikke-fotokemiske slukningsværdier (NPQ) (figur 2B), hvilket indikerer, at fotobeskyttelsesevnen i disse områder blev reduceret under intenst lys. Da PeVDE-genet har kapacitet til at sprede overskydende absorberet lysenergi13, er disse områder med lavere NPQ-værdier sandsynligvis de regioner, hvor PeVDE-genet blev redigeret. Derefter blev enzymfordøjelse og sekventeringsanalyse udført af PeVDE-genfragmentet i disse områder af bladbladene (figur 2C-D), og det blev fundet, at mutationshastigheden for sgRNA-1 var 17,33%, hvilket indikerer, at genredigering var vellykket i disse områder af PeVDE-genet.
Derudover blev et andet sgRNA-målretningssted, sgRNA-2, der indeholder et XbaI-restriktionssted, designet på den første exon af PeVDE. For at undersøge muligheden for lang fragmentdeletion med dobbelt sgRNA-målretning blev der udført genredigering på begge målsteder, hvilket resulterede i lang fragmentdeletion (figur 2E).
Redigeret PeVDE-mutant brugt som reporter i det forbigående genredigeringssystem
Hvorvidt PeVDE sgRNA kunne fungere som reporter i det forbigående genredigeringssystem blev undersøgt. Cinnamoyl-CoA-reduktasen (PeCCR5) genet (Gen-ID: PH02Gene42984.t1) blev tilfældigt udvalgt til at evaluere PeVDE-reporteren . Et sgRNA-mål for PeCCR5 blev designet i sit konserverede motiv på den fjerde exon. CRISPR/Cas9-konstruktionen, der bærer begge sgRNA'er, PeVDE og PeCCR5, blev omdannet til bambusblade (figur 3A).
Efter Agrobacterium-infektion i 30 dage blev frøplanterne behandlet med højintensitetslys i 20 minutter. Det blev observeret, at kun bladområderne redigeret for PeCCR5-genet ikke havde nogen effekt på NPQ-værdier, mens bladområderne transfekteret af sgRNA'er af både PeVDE og PeCCR5 udviste lavere NPQ-værdier (figur 3B).
Derefter blev PeCCR5-fragmentet fra bladområderne med lavere NPQ-værdier amplificeret og sekventeret og fandt en mutationseffektivitet på 8,3% ved hjælp af dyb sekventering. Derfor fungerede PeVDE-reporteren med succes som en forbigående genredigeringsreporter og kan bruges til at screene for genredigering af andre endogene bambusgener.
Samlet set viser disse resultater gennemførligheden af bambusgenredigering ved hjælp af CRISPR/Cas9 i bambus.
Figur 1: I planta ekspression af RUBY-gen og betalain-akkumulering i moso bambusblade. (A) Moso bambusplanter pakket ind i stanniol og klar til Agrobacterium-infektion, med røde trekanter, der angiver positioner, der blev såret af en skarp nål fra en sprøjte. (B) Vakuuminfiltrationsproces af bambusplanter. (C) Ophobning af betalain i bambusblade efter 3 dages infektion observeret gennem fænotypiske ændringer. (D) Her blev fire Agrobacterium-stammer, AGL1, LBA4404, EHA105 og GV3101 medieret RUBY-gentransformation i bambusblade, udført. GV3101, der huser GFP-konstruktionen, blev brugt som en negativ kontrol. Dette tal er ændret fra9. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: I planta ekspression og genredigering af PeVDE gen i bambusblade . (A) Placerings- og målsekvensinformation af sgRNA i PeVDE-genet . Røde trekanter angiver fremadgående og omvendte primeres positioner for fragmentforstærkning. (B) NPQ og rå billeddannelse af bambusblade efter infektion. Tal i NPQ-billedet repræsenterer NPQ-værdier i billedbehandlingssoftwarens skærm. (C) Elektroforese resultater af PeVDE-fragment før og efter alderI fordøjelse. WT betegner de vildtype, ikke-inficerede blade, og + og - repræsenterer PeVDE-fragmenter med eller uden henholdsvis alderI-fordøjelse. (D) Dybe sekventeringsresultater af PeVDE-fragmentet i blade med lavere NPQ-værdi. De røde, blå og grå skrifttyper i sekvenserne repræsenterer henholdsvis målwebstederne, PAM og indsættelser. De røde bindestreger angiver slettede nukleotider. (E) Sanger-sekventeringsresultater af PeVDE-fragmentet efter redigering af både sgRNA-1 og sgRNA-2. Dette tal er ændret fra9. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: PeVDE sgRNA som reporter til screening af genredigering af PeCCR5. (A) Skematisk repræsentation af CRISPR/Cas9-konstruktioner indeholdende PeVDE- og PeCCR5-sgRNA'er. (B) NPQ og rå billeder af bambusblade efter infektion med konstruktionerne i (A). Hvide trekanter angiver områder med lavere NPQ-værdier. Regnbuefarven repræsenterer værdien af NPQ / 4, hvor rød svarer til minimumsværdien og lilla svarer til 1. (C) De røde, blå og grå skrifttyper i sekvenserne repræsenterer henholdsvis målstederne, PAM og indsættelser. De røde bindestreger angiver slettede nukleotider. Dette tal er ændret fra9. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Gen navn | Primer sekvens (5'-3') | Ansøgning | ||
| RUBIN | F: ATGGATCATGCGACCCTCG | Til PCR-forstærkning i inficerede bambusblade | ||
| R: GTACTCGTAGAGCTGCTGCAC | ||||
| PeVDE | F: TGTGGCTTCTAAAGCTCTGCAATCT | Til genkloning og sekventering | ||
| R: TGTCAATGCTACAAGTCCTGGCA | ||||
| PeVDE-mål1 | F: GGCATAGCCCTCACGCAGCACCGG | Til design af PeVDE sgRNA-1-mål | ||
| R: AAACCCGGTGCTGCGTGAGGGCTA | ||||
| PeVDE-mål2 | F: GGCACTCCACGGTCCCAAATCTAG | Til design af PeVDE sgRNA-2-mål | ||
| R: AAACCTAGATTTGGGACCGTGGAG | ||||
| PeCCR5-mål | F: GGCACTGGTACTGCTACGCTAAGA | Til design af PeCCR5 sgRNA-mål | ||
| R: AAACTCTTAGCGTAGCAGTACCAG | ||||
Tabel 1: Sekvensinformationen for primere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metode reducerer signifikant den krævede tid sammenlignet med traditionelle genetiske transformationsmetoder, som typisk tager 1-2 år, og opnår forbigående ekspression af eksogene gener og genredigering af endogene gener inden for 5 dage. Denne metode har dog begrænsninger, da den kun kan omdanne en lille del af cellerne, og de genredigerede blade er kimære og mangler evnen til at regenerere til komplette planter. Ikke desto mindre giver dette i planta genekspression og genredigeringsteknologi en kraftfuld tilgang til funktionel verifikation af endogene bambusgener.
I øjeblikket kan genekspression og genredigeringsteknologi i planta kun udføres i umodne (krøllede) blade, ikke i modne blade. Efterhånden som bladene folder sig ud og forstørres, øges antallet af genredigerede celler, der gennemgår deling, hvilket giver mulighed for genredigering i bestemte bladområder. Den anvendte Agrobacterium-medierede transformationsmetode resulterer imidlertid ikke i indsættelse af det eksogene T-DNA i bambuskromosomet, hvilket gør det vanskeligt at anvende stabile markørgener i bambus 6,9. Derfor er det udfordrende at bestemme de nøjagtige placeringer af disse regioner. For at løse dette blev PeVDE-genet redigeret, og det redigerede område udviste en nedsat fotobeskyttelsesevne under høj lysbehandling, som angivet ved lavere NPQ-værdier, som let kan detekteres ved hjælp af et klorofylfluorometerbilleddannelse-PAM. Således blev PeVDE udviklet som en markør i bambus for at detektere forekomsten af eksogen genekspression og genredigering. På grund af den høje bevarelse af dette gen på tværs af forskellige arter 13 kan det også anvendes bredt på andre planter.
På grund af aflejringen af et kutikulært vokslag på epidermis af bambusblade kombineret med den karakteristiske krøllede og tæt indpakkede morfologi af umodne blade hindres tilgængeligheden af Agrobacterium til bladceller betydeligt. For at forbedre effektiviteten af Agrobacterium infektion, fysiske tilgange, herunder sår og vakuum infiltration, er blevet udnyttet til at fremme indtrængen af Agrobacterium i de lukkede krøllede bambus blade. Denne proces muliggør nærhed mellem Agrobacterium og bladcellerne og derved forbedrer effektiviteten af genetisk transformation. I mellemtiden har dette genredigeringssystem hidtil været begrænset til bambusblade og kan ikke udtrykkes i organer med reproduktionsevne, såsom frø og laterale knopper, der kan arves af den næste generation. Fremtidige anvendelser af teknikken vil blive optimeret til at opnå in-planta genekspression og genredigeringsteknologi i organer med reproduktionsevne med det formål at opnå stabilt arvelige regenererende planter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke National Key Research and Development Program of China (bevilling nr. 2021YFD2200502), National Natural Science Foundation of China (bevilling nr. 31971736) for den økonomiske støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35S::RUBY | Addgene, United States | 160908 | Plamid construct |
| Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1 | Biomed, China | BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01 | For Agrobacterium infection |
| CTAB | Sigma-Aldrich, United States | 57-09-0 | DNA extraction |
| Imaging-PAM fluorometer | Walz, Effeltrich, Germany | Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves | |
| ImagingWin | Walz, Effeltrich, Germany | Software for Imaging-PAM fluorometer | |
| Paq CI or Aar I | NEB, United States | R0745S | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
| PrimeSTAR Max DNA polymerase | Takara, Japan | R045Q | For gene cloning |
| T4 DNA ligase | NEB, United States | M0202V | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
References
- Jiang, Z. H. World Bamboo and Rattan (in Chinese). , Liaoning Science and Technology Publishing House. Shenyang, China. (2002).
- Ye, S., et al. An efficient plant regeneration and transformation system of ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) started from young shoot as explant. Frontiers in Plant Science. 8, 1298 (2017).
- Ye, S., et al. Robust CRISPR/Cas9 mediated genome editing and its application in manipulating plant height in the first generation of hexaploid Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro). Plant Biotechnology Journal. 18 (7), 1501-1503 (2020).
- Xiang, M., et al. Production of purple Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) with enhanced drought and cold stress tolerance by engineering anthocyanin biosynthesis. Planta. 254 (3), 50 (2021).
- Huang, B., et al. An efficient genetic transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing system for moso bamboo (Phyllostachys edulis). Frontiers in Plant Science. 13, 822022 (2022).
- Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods in Molecular Biology. 323, 225-229 (2006).
- Canto, T. Transient expression systems in plants: potentialities and constraints. Advances in Experimental Medicine and Biology. 896, 287-301 (2016).
- Chen, L., et al. A method for the production and expedient screening of CRISPR/Cas9-mediated non-transgenic mutant plants. Horticulture Research. 5, 13 (2018).
- Sun, H., et al. A new biotechnology for in-planta gene editing and its application in promoting flavonoid biosynthesis in bamboo leaves. Plant Methods. 19 (1), 20 (2023).
- He, Y., Zhang, T., Sun, H., Zhan, H., Zhao, Y. A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation. Horticulture Research. 7 (1), 152 (2020).
- Wang, C., Shen, L., Fu, Y., Yan, C., Wang, K. A simple CRISPR/Cas9 system for multiplex genome editing in rice. Journal of Genetics and Genomics. 42 (12), 703-706 (2015).
- McCormick, S., et al. Leaf disc transformation of cultivated tomato (L. esculentum) using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Reports. 5 (2), 81-84 (1986).
- Lou, Y., et al. a violaxanthin de-epoxidase gene from moso bamboo, confers photoprotection ability in transgenic Arabidopsis under high light. Frontiers in Plant Science. 13, 927949 (2022).
- Zhou, R., et al. Distinct cinnamoyl CoA reductases involved in parallel routes to lignin in Medicago truncatula. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17803-17808 (2010).
- De Roeck, A., et al. Deleterious ABCA7 mutations and transcript rescue mechanisms in early onset Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 134 (3), 475-487 (2017).
