Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

נדן תירס מנותק להדמיית תאים חיים של זיהום על ידי פתוגנים פטרייתיים של תירס פוליארי

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65755
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1,4, 1, 1
1Department of Plant Pathology, University of Kentucky, 2Department of Biological Sciences, University of Cincinnati, 3Bayer Crop Science, 4Everglades Research and Education Center, University of Florida

Summary

כתב יד זה מפרט פרוטוקול חיסון אופטימלי המשתמש בנדן עלי תירס מנותק למחקרים ציטולוגיים, פיזיולוגיים ומולקולריים הניתנים לשחזור של אינטראקציות תירס עם פתוגנים צמחיים פטרייתיים. מעטה העלים מאפשר תצפית בזמן אמת על אינטראקציות תאיות בין הצמח החי לפטרייה ברקמות לא מקובעות.

Abstract

ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקול לחיסון נדן עלי תירס עם פטריות פתוגניות המיביוטרופיות ונקרוטרופיות. השיטה שונה משיטה שיושמה במקור על נדן עלי אורז ומאפשרת תצפית מיקרוסקופית ישירה על גדילה והתפתחות פטרייתיות בתאי צמחים חיים. נדני עלים שנאספו משתילי תירס עם שני צווארוני עלים מלאים מחוסנים בטיפות של 20 μL של 5 x 105 נבגים/מ"ל תרחיפים של נבגים פטרייתיים ומודגרים בתאי לחות ב -23 מעלות צלזיוס תחת אור פלואורסצנטי רציף. לאחר 24-72 שעות, רקמה עודפת מוסרת עם סכין גילוח כדי להשאיר שכבה אחת של תאי אפידרמיס, דגימה שקופה אופטית שניתן לצלם ישירות ללא צורך בקיבוע כימי או ניקוי. תאי צמחים ופטריות נשארים בחיים למשך הניסוי וניתן לדמיין אינטראקציות בזמן אמת. נדן יכול להיות מוכתם או נתון פלסמוליזה כדי לחקור את הציטולוגיה ההתפתחותית ואת הכדאיות של תאים מארח פתוגן במהלך זיהום וקולוניזציה. זנים פטרייתיים שעברו טרנספורמציה כדי לבטא חלבונים פלואורסצנטיים יכולים להיות מחוסנים או מחוסנים במשותף על הנדן לקבלת רזולוציה מוגברת וכדי להקל על הערכת אינטראקציות תחרותיות או סינרגטיות. זנים פטרייתיים המבטאים חלבוני היתוך פלואורסצנטיים יכולים לשמש למעקב וכימות הייצור והמיקוד של חלבונים בודדים אלה בצמח. ניתן לחלץ רקמות מעטפת מחוסנות כדי לאפיין חומצות גרעין, חלבונים או מטבוליטים. השימוש בבדיקות נדן אלה קידם מאוד את המחקרים המפורטים של מנגנוני הפתוגנניות הפטרייתית בתירס וגם של חלבונים פטרייתיים ומטבוליטים משניים התורמים לפתוגנים.

Introduction

ניתוחים מרחביים וזמניים ברמה התאית הם קריטיים להבנת הפיזיולוגיה והציטולוגיה של אינטראקציות פטרייתיות-צמחיות. רקמות פוליאריות שקובעו כימית 1,2,3 או נוקו ומוכתמות4, כמו גם קרומים מלאכותיים 5, שימשו בעבר לחקר הציטולוגיה של התפתחות פתוגן עלווה ואינטראקציות צמחיות-פטרייתיות. עם זאת, חקירת אירועי זיהום ברקמות מארחות חיות בזמן אמת ללא קיבוע או ניקוי היא מאתגרת בשל בעיות טכניות הקשורות להכנת דגימות שקופות אופטית להדמיה.

פרוטוקול חיסון נגד נדן עלים מנותק פותח בסוף שנות ה-40 של המאה ה-20 לצורך חקירה מיקרוסקופית בשדה בהיר של עמידות תאי אפידרמיס אורז חיים לפטריית פיצוץ האורז Magnaporthe oryza6. לאחרונה, תצפיות מולקולריות, פיזיולוגיות וציטולוגיות מפורטות של התיישבות פונדקאי על ידי מיני Colletotrichum ו- Magnaporthe הקלו מאוד על ידי שילוב גרסאות מותאמות של שיטת נדן עלים זו עם טרנספורמנטים פטרייתיים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים, ופרוטוקולי הדמיה של תאים חיים בעלי ביצועים גבוהים, כולל אפיפלואורסצנטיות ומיקרוסקופ קונפוקלי 7,8,9,10,11,12,13.

מאמר זה מפרט פרוטוקול חיסון אופטימלי באמצעות נדן עלי תירס מנותק לתצפית על תהליכי זיהום על ידי פתוגנים פטרייתיים המיביוטרופיים ונקרוטרופיים. השתמשנו בו במיוחד כדי לחקור Colletotrichum graminicola (C. graminicola), הגורם הסיבתי של כתם עלה anthracnose וריקבון גבעול, ו Stenocarpella maydis, אשר גורם לכתם עלה דיפלודיה וריקבון הגבעול. עם זאת, השיטה צריכה להיות ישימה לפתוגנים פטרייתיים אחרים hemibiotrophic ו necrotrophic. תגובות ציטולוגיות ופיזיולוגיות במהלך אירועי זיהום ונשאות בנדני עלים נכרתו אלה דומות לאלו שבלהבי עלים שלמים12,14,15. יתר על כן, התיישבות המיביוטרופית של תאי אפידרמיס מעטפת על ידי C. graminicola דומה להתיישבות של תאי פית גבעול16,17. נדן מנותק מראה סינכרוניות רבה יותר ושחזור ניסיוני של חדירה פטרייתית והתיישבות מאשר להבי עלים או רקמות פית גבעול14,16,17,18. רוב זני התירס יכולים לשמש לפרוטוקול זה. עם זאת, אינברדים או בני כלאיים עם פיגמנטים סגולים מוגזמים בנדן פחות מתאימים מכיוון שהפיגמנטים מפריעים להדמיה. תירס מתוק של יובל הזהב היה שימושי במיוחד במחקרים שלנו מכיוון שזרעים לא מטופלים זמינים מסחרית, הצמחים רגישים מאוד למחלות עלווה רבות, והם גדלים היטב בחממה. המגיפות הראשונות של ריקבון גבעול אנתרקנוז בארצות הברית גרמו לאובדן מוחלט של יבולי תירס מתוקים באינדיאנה בשנות השבעים19,20. ניתן ליישם שיטת חיסון זו של נדן עלים כדי לצפות ולכמת ישירות צמיחה והתפתחות פטרייתיות בתאי צמח חיים לעומת תאי צמח שהומתו באופן מקומי, כדי להדגים תגובות עמידות בתגובות תואמות/לא תואמות לזיהום פטרייתי, וכדי לבדוק אינטראקציות בין זנים פטרייתיים על אותו נדן בזמן אמת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: זרימת העבודה עבור השיטה מוצגת באיור 1.

Figure 1
איור 1: שלבים בפרוטוקול החיסון הממוטב באמצעות נדן עלי תירס מנותק. הכנת תרחיף נבגים, חיסון נדן עלים והכנת דגימה למיקרוסקופ תאים חיים מודגשים בתיבות ירוקות (A), סגולות (B) וכתומות (C), בהתאמה. נוצר באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

1. צמח וחומר פטרייתי

  1. גידול צמחים
    1. גידול שתילי תירס (ראו טבלת חומרים) בחממה (14 שעות אור/27°C ו-10 שעות כהות/22°C) במיכלי SC10 (ראו טבלת חומרים). השתמשו במצע גידול המורכב משלושה חלקים: אדמת עציץ מסחרית (ראו טבלת חומרים) ושני חלקים אדמה עליונה מעוקרת בקיטור.
    2. שתילי מים למשך 2 דקות עם מערכת השקיה עילית פעם ביום, בבוקר.
    3. קציר שתילים בשלב V2 על ידי חיתוך אותם בגובה הקרקע. שלב הצמיחה V2 מגיע כאשר השתילים הם בגובה 5 עד 10 ס"מ ויש להם שני עלים גלויים עם צווארון21.
    4. עטפו את הצמחים במגבת נייר לחה והניחו אותם בשקית ניילון להובלה למעבדה להמשך עיבוד.
  2. תרבויות פטרייתיות
    1. הפעל מחדש תרביות מלאי סיליקה פטרייתיות מאוחסנות בתנאים אספטיים22על ידי פיזור כ -50 גרגירים של הסיליקה השורצת על מדיום אגר מתאים. כדי למנוע שינויים מורפולוגיים ואובדן פתוגניות, תת-תרבית זנים לא יותר מ 3x לאחר הפעלה מחדש. אגר דקסטרוז תפוחי אדמה (PDA; ראו טבלת חומרים) משמש באופן שגרתי לתרבית C. graminicola ואילו אגר שיבולת שועל (OA; ראו טבלת חומרים) משמש לאגר S. maydis.
    2. כדי להכין מחשב כף יד לגידול מלאי פטרייתי, יש להשהות 19.5 גרם של מחשב כף יד מיובש שהוכן באופן מסחרי ב-500 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה (DI). להכנת OA, הרתיחו 36 גרם של OA מיובש שהוכן מסחרית במי DI למשך 15-30 דקות, סננו דרך שלוש שכבות של בד גבינה והביאו את הסינון ל-500 מ"ל עם מי DI. מדיה Autoclave כדי לעקר.
    3. הגדילו את המדיה המותכת והמקוררת עם אנטיביוטיקה מתאימה (למשל, היגרומיצין B, גנטיקין) בעת עבודה עם זנים טרנספורמטיביים. הריכוזים הסופיים של היגרומיצין או גנטיצין ב-500 מ"ל מדיה הם 250 מיקרוגרם/מ"ל ו-100 מק"ג/מ"ל, בהתאמה.
    4. לדגור על תרביות בתנאים אופטימליים עד להתפתחות תפטיר נבג. Colletotrichum graminicola ו- S. maydis גדלים היטב ב 23 °C עם אור פלואורסצנטי רציף ורמות לחות הסביבה. הספורולציה מתרחשת 7 ימים לאחר החיסון (dai) עבור S. maydis או 14 dai עבור C. graminicola.

2. חיסונים נגד נדן עלים

  1. הרכבת יחידת מסנן זכוכית-צמר
    1. השתמש במספריים או גזירים כבדים כדי לחתוך את המכסה וכ- 0.5 מ"מ מהתחתית החרוטית של צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל (ראה טבלת חומרים).
    2. הניחו פיסת צמר זכוכית (בערך 0.5 ס"מ x 0.5 ס"מ; ראו טבלת חומרים) בתוך הצינור החתוך כדי לכסות את החור המרכזי, כפי שמתואר באיור 2.
    3. ללבוש כפפות בעת חיתוך צמר זכוכית, כמו זכוכית borosilicate יכול לגרום לגירוי.
  2. הכנת מתלים לתמיכה בנדן עלים
    1. חתכו לוח PCR ללא חצאית של 96 בארות (ראו טבלת חומרים) לשישה מדפי תמיכה דו-טוריים (8 x 2 בארות) כמתואר באיור 3A.
    2. הפכו את המדפים בעלי שני העמודים כך שהתחתונים החרוטיים של הבארות פונים כלפי מעלה והצמרות השטוחות פונות כלפי מטה (איור 3B).
    3. הניחו כל תמיכה בצלחת פטרי מזכוכית המכילה נייר פילטר לח וכסו אותה במכסה (ראו טבלת חומרים). יחידה זו מתפקדת כתא לחות קטן לנדן.
  3. הכנת Inoculum
    1. עבור כל זן פטרייתי, הניחו יחידת מסנן אחת מורכבת מצמר זכוכית לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי שלם בנפח 1.5 מ"ל כפי שמתואר באיור 2. האחרון מתפקד כצינור איסוף.
    2. תייגו את הצינורות.
    3. קצרו קונידיה מתרביות נבגים על ידי הצפה ראשונה של כל צלחת ב-3-4 מ"ל של מים סטריליים מסוג DI. במקרים מסוימים ייתכן שיהיה צורך ביותר מים כדי לייצר שכבת נוזל על פני המושבה. חומרי הרטבה אינם נחוצים במערכת זו.
    4. שחררו את הנבגים מהאגר על ידי שימוש במזיק סטרילי בעל קצה חרוטי (ראו טבלת חומרים) כדי לגרד באופן שווה על פני הצלחת כולה.
    5. יש למרוח 1 מ"ל של תרחיף הנבגים על יחידת מסנן צמר זכוכית באופן אספטי ולאפשר לנבגים לזרום דרך צינור האיסוף באמצעות כוח הכבידה.
    6. צנטריפוגה את צינורות האיסוף המכילים את מתלי הנבגים המסוננים ב 3,500 x גרם למשך 5 דקות. הנבגים צריכים להיות כדוריים בתחתית צינור מיקרוצנטריפוגה.
      הערה: צנטריפוגה של נבגי C. graminicola במהירויות גבוהות מהמומלץ כאן גורמת לאובדן משמעותי של הכדאיות.
    7. יוצקים את הנוזל למיכל הניתן להרכבה, מוסיפים 1 מ"ל של מים סטריליים DI, ומתסיסים בעדינות כדי להשהות מחדש את הנבגים הכדוריים. צנטריפוגה כמו בשלב 2.3.6.
    8. יש לשטוף נבגים פי 3 כדי להסיר כל מטריצה קונידיאלית שעשויה להכיל מעכבים אוטומטיים שעשויים להפחית נביטה או חדירה.
    9. לאחר השטיפה השלישית, הוסיפו 300-500 מיקרוליטר של מי DI סטריליים כדי להשהות מחדש נבגים לצורך כימות.
    10. השתמש בהמוציטומטר תחת מיקרוסקופ מורכב בהגדלה של 100x כדי לקבוע את ריכוז הנבגים. אין צורך להכתים נבגים לפני הספירה.
    11. הכינו תרחיף 5 x 105 נבגים/מ"ל עם מים סטריליים DI.
      הערה: ניתן לשמור את מתלה הנבג של C. graminicola בטמפרטורת החדר לא יותר מ-4 שעות לפני אובדן מהיר של הכדאיות. קירור קונידיה אינו מגביר את הכדאיות.
  4. חיסוני מעטפת
    1. בדוק שיטות ונהלי בטיחות ביולוגית רלוונטיים לפני חיסון צמחים בזנים פטרייתיים.
    2. הסר את הנדן מהעלה האמיתי הראשון של שתילי V2 על ידי העברת תמונה ממוזערת לאורך השוליים החופפים של הנדן, ושחרר אותו בעדינות מהנבט. שחררו את הנדן משני צידי הצילום לפני שתנסו להסיר אותו.
    3. חותכים את נדני העלים המשוחזרים למקטעים של 3-5 ס"מ. אין צורך לחטא את הנדן לפני החיסון.
    4. פתחו כל מקטע בעדינות רבה כדי לחשוף את שכבת האפידרמיס הפנימית (אדקסיאלית).
    5. בעת הכנת הנדן לחיסון, יש לשמור את שאר הנדן שנכרת עטוף במגבת נייר לחה כדי למנוע התייבשות.
    6. הניחו 20 μL של תרחיף הנבג הפטרייתי על המשטח הפנימי במרכז חתיכת הנדן, ישירות מעל הצלע האמצעית, כפי שמתואר באיור 4.
    7. הניחו את נדן העלים המחוסנים בצורה אופקית, כאשר הצלע האמצעית ממוקמת בתחתית, בתמיכה בתוך צלחת פטרי מזכוכית המכילה נייר סינון לח כפי שמתואר באיור 5.
    8. כל מדף מכיל עד שבעה נדנים. יש לחסן לפחות חמישה נדנים לכל זן כדי לפצות על אובדן העתקים שעלולים להתרחש במהלך הכנת הדגימה או הדגירה.
    9. הכניסו את תאי הלחות הקטנים לקופסת אחסון שקופה מרופדת בנייר נביטה לח (ראו טבלת חומרים).
    10. מכסים את הקופסה במכסה. לדגור את התיבה ב 23 מעלות צלזיוס עם תאורה רציפה עבור מסלול הזמן המיועד, אשר תלוי בפטרייה ובשלבי התפתחות פטרייתית כי יהיה נצפה. סיכום של מסלול הזמן עבור נדן תירס שחוסנו ב-C. graminicola מובא בטבלה 1.
    11. בדוק כל יום סימנים / סימפטומים של מחלה על הנדן ולשמור על נייר נביטה ומסנן לח. נדני עלים יכולים להישמר עד 6 ימים ללא מוות ברור של תאי הצמח או התפרקות בהיעדר חיסון.

Figure 2
איור 2: הכנת יחידת סינון צמר זכוכית. (A) כדור צמר זכוכית בגודל 0.5 ס"מ x 0.5 ס"מ מונח בתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1 שתחתיתו החרוטית מוסרת. (ב-ג) לאחר מכן מכניסים את צינור המסנן לצינור מיקרוצנטריפוגה 2 כדי ליצור יחידת סינון מורכבת להכנת תרחיף נבגים. נוצר באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: שיטה לחיתוך צלחת PCR ללא חצאית של 96 בארות. (A) לוחית PCR חתוכה לשישה ארונות תמיכה, 8 x 2 בארות. דוגמה לתמיכה בנדן יחיד מתוארת ב- (B). נדני העלים מונחים אופקית על התמיכה. נוצר באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: שיטת חיסון מעטפת. טיפה אחת של inoculum מוחל ישירות על פני השטח adaxial של קטע הנדן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: שיטת הדגירה של מעטפת. נדני עלים מחוסנים מונחים אופקית במדף תמיכה בתוך צלחת פטרי זכוכית המכילה נייר סינון לח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. מיקרוסקופ תאים חיים

  1. הכנת דגימה למיקרוסקופ
    1. יש לשטוף את חתיכות הנדן בעדינות במים סטריליים DI כדי להסיר נבגים לא דבוקים או צמיחה פטרייתית שטחית.
    2. הניחו את הנדן על שקופית מיקרוסקופ זכוכית נקייה (ראו טבלת חומרים) כאשר המשטח האדקסיאלי (הפנימי) של הנדן פונה כלפי מטה והמשטח האבקסיאלי (החיצוני) העליון ביותר.
    3. השתמש בסכין גילוח חדש בעל קצה יחיד (ראה טבלת חומרים) כדי לחתוך כ-1 ס"מ מקצות הנדן ולהסיר את רוב רקמת הלמינה משני צדי הצלע האמצעית.
    4. החזיקו את סכין הגילוח בזווית של 90° ביחס לנדן כדי לגלח את הרקמה מהצלע האמצעית האבקסיאלית וחשפו את שכבת האפידרמיס על פני השטח האדקסיאליים מעל הנקודה המחוסנת. נסו לשמור על עובי אחיד. לאחר גילוח נדן העלים, גיזום נוסף אינו מומלץ מכיוון שהדבר עלול לפגוע בדגימה.
    5. ודא שהחלקים המגולחים אינם עולים על 1 ס"מ x 1 ס"מ. הימנעו מלחיצה על מרכז הנדן במהלך תהליך זה. כאשר עובדים עם נדן מחוסן עם מתלים נבגים שונים, לחטא כפפות ולשנות את סכין הגילוח בין דגימות.
    6. הכינו מגלשה של מיקרוסקופ זכוכית נקי. הרימו את קטע הנדן מקצה אחד והעבירו אותו בזהירות לשקופית חדשה. המשטח המחוסן (אדקסיאלי) של הנדן צריך להיות עליון, הקרוב ביותר לעדשה האובייקטיבית. הר חלקים בעדינות כדי למנוע נזק למבנים פטרייתיים.
    7. יש למרוח 60 מיקרוליטר מים סטריליים DI על המקטע ולהוסיף כיסוי זכוכית בגודל 24 מ"מ x 60 מ"מ (ראו טבלת חומרים). עשו זאת לאט כדי למנוע בועות אוויר.
    8. כאשר המוצר מוכן למיקרוסקופיה, אטמו את הכיסוי בלק שקוף (ראו טבלת חומרים) על ידי הנחת טיפה קטנה על כל קצה ולאחר מכן חיבור הטיפות יחד עם מברשת לק ליצירת אטימה חלקה.
      הערה: פרוטוקול נדן זה יכול לשמש עם כתמים ציטולוגיים, למשל, 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), אדום נייטרלי, או כחול טריפאן, או לתצפית של פלסמוליזה התא כדי להעריך את הכדאיות של תאי הצמח. לבדיקת צביעת נדן או פלסמוליזה של תאים, אין לאטום את הכיסוי.
    9. לבדיקות פלסמוליזה, הוסף תמיסה היפרטונית (0.75 M סוכרוז או 1 M נתרן כלורי) לקצה אחד של הכיסוי והשתמש בנייר טישו מקופל ללא מוך כדי למשוך את התמיסה על פני הדגימה לקצה השני של הכיסוי. עבור צביעה, השתמש בשיטה דומה כדי להחיל את תמיסת הכתם.
  2. מיקרוסקופ שדה רחב
    1. לאחר שנדני העלים מורכבים על שקופיות מיקרוסקופ, בדקו אותם להתיישבות פטרייתית באמצעות מיקרוסקופ אור רחב שדה בהגדלה של פי 400.
    2. כדי לצפות במבנים פטרייתיים בפירוט, השתמש במטרה טבילה במים ולא בשמן לקבלת איכות תמונה טובה יותר של הדגימות. סטייה כדורית עקב אי-התאמה של אינדקס השבירה עלולה לגרום לירידה באיכות התמונה. מטרות מים זמינות עבור מיקרוסקופ אור רחב שדה כמו גם מיקרוסקופים קונפוקליים.
    3. כדי לקבוע את הכמות היחסית של התיישבות לנדן, ספרו את מספר תאי התירס שפלשו מכל אתר חדירה פטרייתי באמצעות מיקרוסקופ אור רחב שדה בהגדלה של פי 100. כימות זה הוא שלב סינון מתאים לפני כל ניתוח סטטיסטי המשווה זנים, טיפולים ו / או שלבים התפתחותיים.
  3. מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי
    1. כדי לצפות בחלבונים פלואורסצנטיים ברקמות תירס במהלך התפתחות זנים פטרייתיים טרנסגניים, התאם את הפרמטרים הבסיסיים של רכישת תמונה. זהה את הגדרות העירור/הפליטה הטובות ביותר בהתבסס על סמן הפלואורסצנט שנבחר.
      הערה: יעד מים של פי 60 עדיף בעת ניתוח איחוי פלואורסצנטי הבנוי מחלבונים מופרשים. למיקרוסקופים קונפוקליים מודרניים יש מטרות טבילה מתוקנות מאוד במים כדי למנוע ממצאים וסטיות צורה.
    2. אם הכוונה היא להדמיית תאים חיים של חלבונים פלואורסצנטיים, השתמשו בזנים פטרייתיים שלא עברו טרנספורמציה כאמצעי בקרה לאוטופלואורסצנטיות. השתמש בפרמטרים הבאים של רכישת תמונה כדי ללכוד דינמיקה פטרייתית-מארחת במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך ועבור חלבון פלואורסצנטי mCherry. הגדר עוצמת לייזר של עד 5%, 450-600 מתח גבוה (HV) בהתאם לרמת הביטוי, רווח X 1.375, קיזוז של 3%, מקדם זום אופטי של 1 לניתוח של עד חמישה תאי תירס לכל קטע, ומקדם זום אופטי של 2-5 עבור קורים בודדים.
      הערה: תמונות קונפוקליות Z-stack ברזולוציה גבוהה מספקות נתונים תלת-ממדיים ותצוגה טובה יותר של אינטראקציות בזמן אמת בין המארח לפתוגן.
    3. לכימות עוצמות פלואורסצנטיות המתאימות לחלבוני היתוך מופרשים, השתמשו בתוכנת ניתוח תמונה של יצרן הקונפוקל או בתוכנת עיבוד תמונה כגון ImageJ, אותה ניתן להוריד באופן חופשי באינטרנט. עיין במדריך לקבלת פרטים כיצד לכמת אותות פלואורסצנטיים בהתאם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הדוגמאות שלהלן מתארות תוצאות מייצגות בעקבות השימוש בשיטת החיסון נגד נדן עלי תירס. דוגמאות אלה מדגימות את הקלות, המהירות והדיוק שבהם ניתן לבצע תצפית והשוואה של אינטראקציות תירס-פטרייה בזמן אמת באמצעות בדיקה אופטימלית זו. הדמיה של תאים חיים מאפשרת גם חילוץ מידע כמותי, ומספקת כלי שימושי למחקרים מולקולריים, ציטולוגיים ופיזיולוגיים השוואתיים. פרטים נוספים ניתן למצוא בפרסומים המקוריים שצוטטו עבור כל בקשה מוצלחת.

נתונים לדוגמה 1: שימוש בכתמים ופלסמוליזה בנדן עלים מחוסנים להערכת מצב פטרייתי ואיתור תגובות צמחים לזיהום פטרייתי
נדן עלי תירס שימש כדי לדמיין ולהשוות את תהליכי הזיהום של Colletotrichum graminicola ו - Stenocarpella maydis בתאים מארחים חיים באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר, המאפשר תיאורים מפורטים של דפוסי התיישבות ומסלולי זמן (תוצאות שלא פורסמו; איור 6).

מחקרים אלה גילו כי S. maydis פולש במהירות לתאי האפידרמיס ישירות באמצעות נפיחות hyphal לא ממוין, בניגוד C. graminicola אשר מייצר appressoria מלניזציה. ברגע שהם נכנסים לתאי האפידרמיס, שני הפתוגנים מתקדמים מתא לתא על-ידי מעבר דרך דפנות תאים שלמות לכאורה (איור 6A,B).

ניתן לצבוע את הנדן בכחול טריפאן או DAPI כדי להעריך את האופי וההיקף של התיישבות קורים פטרייתיים ביתר קלות (איור 6). צביעה כחולה של טריפאן מגלה כי C. graminicola פולש בתחילה דרך קורים ראשוניים עבים הנעים בין התאים דרך קשרים צרים מאוד. מאוחר יותר, הפטרייה עוברת לשלב נקרוטרופי, ומייצרת קורים משניים דקים יותר במרכז המושבה (איור 6 C-E)12,14,16,17.

Figure 6
איור 6: נדן עלי תירס מחוסנים לא מוכתמים או מוכתמים שצולם באמצעות שדה בהיר או מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. (A) קורים תוך-תאיים 48 שעות לאחר החיסון (hpi ) עם Stenocarpella maydis. הזיהום מתרחש באמצעות קצוות hyphal נפוחים מעט (חץ). (B) קורים תוך-תאיים 48 hpi עם Colletotrichum graminicola. זיהום מתרחש באמצעות appressoria מלניזציה (חצים). (C) קורים של C. graminicola, מוכתמים בכחול טריפאן, מתקדמים מתא לתא בקצה המושבה המתקדמת באמצעות חיבורים צרים (חץ), 72 hpi. (D) מבט מקרוב על הייפ מוכתם בכחול טריפאן של C. graminicola ב-72 hpi, העובר דרך דופן תא התירס דרך חיבור צר (חץ). (E) קורים של C. graminicola, מוכתמים בכחול טריפאן, במרכז המושבה 72 hpi. ניתן לראות קורים משניים צרים יותר המגיחים מתוך הקורים הראשוניים העבים יותר (חיצים). (F) קורים של C. graminicola 72 hpi, בקצה המושבה המתקדמת על נדן עלה מוכתם ב-DAPI. גרעיני הפטרייה והצמחים המוכתמים פלואורסים תחת אור UV. פסי קנה מידה בכל חלונית שווים ל- 50 מיקרומטר. מיקרוגרפים המתקבלים באמצעות מצלמה דיגיטלית מונוכרומטית בשילוב עם מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

נדן יכול להיות מוכתם באדום נייטרלי ו/או להיות נתון לפלסמוליזה כדי לחקור את הציטולוגיה ההתפתחותית ואת הכדאיות של תאי תירס במהלך זיהום והתיישבות על-ידי פטריות פתוגניות (איור 7).

Colletotrichum graminicola היא פטרייה המיביוטרופית שפולשת לתאי תירס חיים עם קורים ראשוניים עבים שמופרדים מהציטופלסמה המארחת על-ידי קרום (איור 7A-C)12,14,16,17. Stenocarpella maydis, לעומת זאת, היא פטרייה נקרוטרופית שמייצרת פיטוקסין23 והורגת את תאי האפידרמיס (שהופכים מגורענים ולא מצליחים לבצע פלסמוליזה) לפני שהיא פולשת אליהם (איור 7D).

הגנת תירס מפני C. graminicola ופתוגנים עלוותיים אחרים כרוכה בהצטברות של מיני חמצן תגובתי (ROS), במיוחד מי חמצן (H 2 O2)12,15. כדי לחקור את הכימיה החמצונית של אינטראקציות צמחים-פתוגנים, 3,3′-diaminobenzidine (DAB) יכול לשמש לצביעת תאים24. DAB מחומצן על-ידי H2 O2, ומייצר משקע חום כהה שנראה בנדן עלי התירס (איור 7 E,F)12,24. ייצור הפיגמנט הוא אינדיקטור להתפרצות חמצונית הקשורה לתגובת התנגדות המאכסן.

Figure 7
איור 7: נדני עלי תירס מחוסנים מוכתמים ו/או פלסמוליזים שצולמו במיקרוסקופ שדה בהיר. (A) נדן עלה שחוסן ב-C. graminicola 24 hpi ועבר פלסמוליזה והכתמה באדום נייטרלי. תאי תירס חיים מתחת לפלסמוליזה של אפפרסוריה (חיצים) וכתמים, מה שמוכיח שהפתוגן אינו הורג את התאים לפני הפלישה. (B) נדן עלה 48 hpi עם C. graminicola, נתון פלסמוליזה ומכתים באדום ניטרלי. תאי תירס המאוכלסים על ידי קורים ראשוניים (חץ) עדיין חיים, מה שקובע כי C. graminicola פולש לתאים כביוטרופ. (C) נדן עלה 48 hpi עם C. graminicola, מראה hyphae נע מתא לתא בקצה המתקדם של המושבה. הנדן עבר פלסמוליזציה אך לא הוכתם. תאים לא מיושבים הסמוכים לקצה המושבה (חיצים) ממשיכים לבצע פלסמוליזה. (D) נדן עלה 24 hpi עם S. maydis, לפני החדירה. התאים שמתחת לנבג הנבוט (החץ) נראים מגורענים ואינם מצליחים לבצע פלסמוליזה, מה שמעיד על כך שה-S. maydis הורג אותם לפני החדירה ושהוא מתנהג כנקרוטרופ. (E) נדן עלים של תירס עמיד Mp305 24 hpi עם C. graminicola ומוכתם ב-DAB. צביעה כהה מצביעה על תגובת חמצון חזקה של התא הבודד במרכז התמונה, בעוד שניתן לראות הילות של פיגמנט חום סביב רוב הפרשיות הבודדות, וניתן לראות גרגירים בתאים שבראש התמונה. (F) מבט מקרוב על הילות הפיגמנט החום שהצטברו סביב האפרסוריה, ושקיעת פיגמנט בדפנות תאי התירס הסמוכות (חיצים). פסי קנה מידה בכל לוח שווים ל- 50 מיקרומטר, למעט (F) שהוא 20 מיקרומטר. מיקרוגרפים המתקבלים באמצעות מצלמה דיגיטלית מונוכרומטית בשילוב עם מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

נתונים לדוגמה 2: הדמיה של תאים חיים עם פטריות המבטאות חלבונים פלואורסצנטיים
ניתן לדמיין קורים פטרייתיים המבטאים חלבונים פלואורסצמיים ציטופלזמיים ברזולוציה גבוהה בתאי מעטפת חיים ללא צורך בכתמים כלשהם באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי או קונפוקלי (איור 8).

חלבונים פלואורסצנטיים יכולים להיות ממוקדים לאברונים פטרייתיים שונים, למשל במיטוכונדריה, בגרעינים או במערכת האנדוממברנה, כדי לעקוב אחר מיקומם ופעילותם בתאי הפטרייה החיים בפלנטה (איור 8C)25,26,27,28 (תוצאות שלא פורסמו). חלבונים פלואורסצנטיים יכולים גם להיות מונעים על-ידי מקדמי פטריות שונים כדי שישמשו ככתבים עבור פונקציות שונות: לדוגמה, RFP המונע על-ידי חלבון תגובת העקה של מלווה BiP (איור 8D)29 (תוצאות שלא פורסמו). השימוש בנדן עלים מאפשר הדמיה של חלבוני היתוך פלואורסצנטיים מתויגים בנפרד שמצטברים ומופרשים על-ידי קורים פטרייתיים בזמן שהם מאכלסים תאים מארחים 8,9 (איור 8E). קווי תירס טרנסגניים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים המכוונים למדורי תאים שונים, כגון גרעינים או קרום פלזמה, זמינים גם הם30,31, וניתן להשתמש בהם לחיסונים כדי להעריך את השפעות הזיהום על מבנים תאיים של תירס כגון גרעינים. השימוש בקווי תירס טרנסגניים אלה הראה כי גרעינים בתאי תירס שלא פלשו נודדים בדרך כלל לדופן התא הקרובה ביותר לתאים שכבר מאוכלסים על ידי C. graminicola (תוצאות שלא פורסמו; איור 8F).

Figure 8
איור 8: הדמיה אפיפלואורסצנטית (A, B) או קונפוקלית (C, D, E, F) של Colletotrichum graminicola המבטאת חלבונים פלואורסצנטיים. (A) נדן עלה פלסמולי לא מוכתם 48 hpi עם זן C. graminicola המבטא mRFP ציטופלזמי בשליטת מקדם ToxA34. אוטופלואורסצנטיות משמעותית מורגשת גם בנדן עלים אלה. (B) נדן עלים לא מוכתם 48 hpi עם זן C. graminicola המבטא ציטופלסמה SGFP תחת שליטת מקדם ToxA. (C)Colletotrichum graminicola המבטא SGFP המכוון למערכת האנדוממברנה עם עוגן HDEL35. (D) נדן עלים לא מוכתם 24 hpi עם C. graminicola שעבר טרנספורמציה עם mRFP בשליטת המקדם עבור ההומולוג C. graminicola של מלווה BiP. הפלואורסצנטיות האדומה בהייפ הראשוני היא אינדיקטור להפעלת BiP בתגובה ללחץ הפרשה. (E) הצטברות של arabinofuranosidase::mCherry fusion protein בהייפ הראשוני C. graminicola WT אשר חוצה את דופן תא נדן עלה התירס ב 44 hpi. (F) מעטפת עלה של קו תירס מהונדס המבטא YFP הממוקד לגרעיני הצמח30,31, 48 hpi עם זן של C. graminicola המבטא mRFP ציטופלזמי תחת שליטתו של מקדם ToxA. פסי קנה המידה בכל חלונית שווים ל- 20 מיקרומטר, פרט ללוח A שבו הוא שווה ל- 50 מיקרומטר. מיקרוגרפים התקבלו באמצעות מצלמה דיגיטלית מונוכרומטית בשילוב עם מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. התמונות ב-(C-F) צולמו במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

נתונים לדוגמה 3: שימוש בנדן עלי תירס לבחינת ציטולוגיה מפורטת של תגובות ואינטראקציות תואמות/לא תואמות בין זנים פטרייתיים
זן מוטנטי לא פתוגני של C. graminicola (cpr1 MT) הושווה לזן מסוג בר (WT) בנדן עלי תירס (איור 9A,B)12.

הדמיה חיה של הזנים המסומנים בחלבונים פלואורסצנטיים ציטופלזמיים הראתה כי המוטציה נפגעה באופן ספציפי בתנועה מתא לתא בתוך נדן עלי התירס. פרוטוקול הנדן איפשר כימות מדויק שגילה כי ה-CPR1 MT היה מוגבל לתא המיושב הראשון 95% מהזמן (איור 9C)12. זאת בניגוד בולט ל-WT, שבו פחות מ-5% מהזיהומים נשארו בתוך התא המיושב הראשון באותה מסגרת זמן12. באופן מעניין, ה-CPR1 MT היה מסוגל לגדול באופן ספרופיטי מעבר לתא הנגוע הראשון בתחילה בנדן מקומי שהומת בהקפאה, כמו זן WT (איור 9D). זה הצביע על כך שחוסר היכולת של ה- CPR1 MT להתיישב היה קשור באופן ספציפי לתגובה פעילה של תא התירס החי.

בדיקת החיסון נגד נדן העלים שימשה לבדיקת אינטראקציות בין זני ה-CPR1 MT המבטאים GFP וזני WT המבטאים RFP על ידי חיסונם המשותף על אותו נדן עלה12. כאשר הזנים חוסנו קרוב זה לזה (לא יותר מ-8 תאי תירס זה מזה), ה-CPR1 MT היה מסוגל לגדול באופן נורמלי כביוטרופ מתא לתא (איור 9E,F). בדיקות פלסמוליזה אישרו כי פטריית ה- CPR1 MT נכנסה לתאים חיים12. כל התצפיות המפורטות הללו התאפשרו על ידי בדיקות הנדן ורמזו על קיומו של גורם דיפוזי המשרה תאימות המיוצר על ידי זן WT של C. graminicola אך חסר ב- CPR1 MT12.

Figure 9
איור 9: אינטראקציות תואמות ולא תואמות המערבות זני WT ו-cpr1 MT של Colletotrichum graminicola. השימוש בחלבונים פלואורסצנטיים שונים איפשר להבחין בין שני הזנים כאשר חוסנו במשותף על נדן עלי תירס12. (A) זן WT C. graminicola המבטא mRFP ציטופלזמי בנדן עלי תירס ב-48 hpi. (B) זן C. graminicola cpr1 MT המבטא SGFP בנדן עלי תירס ב-72 hpi. החייאה MT רק לעתים רחוקות (<5% מהזמן) מתיישבת מעבר לתא הנגוע הראשון, אפילו עד 6 ימים לאחר החיסון. (C) מבט מקרוב על זן C. graminicola cpr1 MT המבטא SGFP ברזולוציה של 72 dpi. במקרה זה, הוא הצליח לחצות את דופן התא לתוך התא הבא, אבל אז הוא הפסיק להתפתח. (D) זן C. graminicola cpr1 MT המבטא SGFP, 48 hpi ברקמות מעטפת מומתות. זן cpr1 MT מאכלס תאי נדן תירס שאינם חיים במהירות, בדומה ל-WT. (E) כאשר הזנים WT-mRFP C. graminicola ו-CPR1 MT-GFP C. graminicola מחוסנים במשותף זה בזה על נדן עלי תירס (48 hpi), זן ה-CPR1 MT-GFP חוזר ליכולת להתקדם דרך תאי נדן תירס חיים באופן נורמלי, כביוטרופ. גידול ביוטרופי בתוך התאים החיים אושר על ידי בדיקות פלסמוליזה. (F) מבט מקרוב על זן C. graminicola cpr1 MT המבטא SGFP, הגדל מתא לתא כאשר הוא מחוסן בסמוך ל-WT (במרחק של לא יותר מ-8 תאי תירס זה מזה). פסי קנה מידה שווים ל- 50 מיקרומטר (A, B ו- E) או 20 מיקרומטר (C, D ו- F). מיקרוגרפים התקבלו באמצעות מצלמה דיגיטלית מונוכרומטית בשילוב עם מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

נדן מחוסן שימש גם לייצור רקמות למיצוי RNA לניתוח פעילות שעתוק32,33. הנדן היה אידיאלי למטרה זו מכיוון שניתן היה לבדוק אותם לפני החילוץ כדי לפקח על תהליך ההדבקה, ובכך להבטיח אחידות דגימה על פני שכפולים מרובים. מחקרים אלה אפשרו זיהוי גלים של גנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי בין שלבי המעבר של אורח החיים הקולטוטריכומי 32,33.

נתונים לדוגמה 4: תוצאות ניסויים תת-אופטימליים
הדמיה לא מספקת של תאים חיים עשויה להיות תוצאה של חיתוך לא מספיק של מעטה העלים, מה שמוביל לשכבות חופפות של תאי האפידרמיס ולדגימות אטומות אופטית (איור 10).

Figure 10
איור 10: תוצאות ניסוי תת-אופטימליות עקב חיתוך לא מספיק של נדן עלים.( A) דוגמה לשכבות מרובות של תאי אפידרמיס המפריעות לבדיקת התפתחות פטרייתית in vivo. (B) דוגמה לשכבות תאים חופפות המשפיעות על דימות תאים חיים. פסי קנה מידה שווים ל- 20 מיקרומטר. מיקרוגרפים התקבלו באמצעות מצלמה דיגיטלית מונוכרומטית בשילוב עם מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאת ניסוי תת-אופטימלית אפשרית נוספת היא ריכוז חיסונים לא מותאם שעלול לגרום למספר נמוך (איור 11A) או גבוה של נבגים: האחרון עשוי לגרום לנביטה מופחתת או לחדירה מדכאת (איור 11B). האחרון יכול גם לעכב את הכימות של תאי תירס מושבת בכל אתר חדירה פטרייתי.

Figure 11
איור 11: תוצאות ניסוי תת-אופטימליות כתוצאה מריכוז חיסונים שלא הותאם כראוי. A. ריכוז נמוך של תרחיף נבג C. graminicola מחוסן על נדן וכתוצאה מכך מספר נמוך של אתרי חדירה פטרייתיים. ב. ריכוז גבוה של C. graminicola inoculum על נדן העלים הגורם לאפפרסוריה מרובה בסמיכות, ומפחית את חדירת תאי המאכסן. פסי קנה מידה שווים ל- 20 מיקרומטר. מיקרוגרפים התקבלו באמצעות מצלמה דיגיטלית מונוכרומטית בשילוב עם מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

זמן תצפית מיקרוסקופית (hpi) שלב התפתחותי של C. graminicola מחוסן על נדן עלי תירס
12 אפרסוריה
24 קורים ראשוניים
36 קורים משניים
48 קורים משניים
60 אצ'וולי
72 אצ'וולי
108 אצ'וולי

טבלה 1: קורס זמן זיהום Colletotrichum graminicola: סיכום מהלך הזמן של נדני עלי תירס שחוסנו בזן C. graminicola M1.001 בהתבסס על אבני דרך בהתפתחות פטרייתית במהלך שינוי אורח החיים. תצפיות מיקרוסקופיות בוצעו כל 12 שעות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטת החיסון האופטימלית של נדן העלים המתוארת כאן שונה מפרוטוקול מקורי שפותח ויושם על נדן עלי אורז 6,8,36. הוא מאפשר תצפיות ישירות ומפורטות על גדילה והתפתחות פטרייתיות בתאי צמח חיים באמצעות מיקרוסקופ רחב או קונפוקלי. הפרוטוקול מתאים לאפיון, השוואה וכימות של מגוון תופעות מיקרוסקופיות במהלך התיישבות תירס, כולל התפתחות פטריות ותגובות פונדקאי במהלך אינטראקציות תואמות לעומת לא תואמות; ייצור והפרשת חלבונים פטרייתיים ספציפיים בצמח; וציטולוגיה וביוכימיה של גורמי פתוגניות נפוצים או חדשים המיוצרים במהלך אינטראקציה בין תירס לפטרייה. השתמשנו בשיטה זו עם פתוגנים המיביוטרופיים ונקרוטרופיים של תירס. לא ניסינו לחסן עם פתוגנים ביוטרופיים (למשל, פטריות חלודה), אבל הנדן, מכיוון שהם נשארים בחיים, יהיה שימושי גם ליישום זה. יישמנו שיטה זו גם על נדן דורה לצורך חקירות של הציטולוגיה של התנגדות ספציפית למארח ולזן 7,37. עבור נדן דורה, ההתאמה היחידה לפרוטוקול הייתה למלא את כל הנדן במתלה נבגים, במקום להחיל טיפה אחת במרכז. זה היה הכרחי בגלל הקוטר הקטן יותר של נדן הדורה.

השימוש במבחני מעטפת אלה קידם מאוד את המחקרים המפורטים שלנו על מנגנוני ההתיישבות של המאכסן ומולקולות פטרייתיות שהן קריטיות לפתוגנים. לדוגמה, יישום השיטה הדגים זיהוי לא מארח של C. sublineola על ידי תירס, ושל C. graminicola על ידי דורה, כולל תגובות התנגדות רגישות בשני המקרים7. נדן עלי תירס שימש גם לבדיקת אינטראקציות בין זנים פטרייתיים במרחק על אותו נדן. במקרה זה, חיסון משותף של זן WT פתוגני וזן CPR1 MT לא פתוגני יחד על נדן חי הדגים את השראת הרגישות של תאי תירס על ידי זן WT וסיפק ראיות לגורם דיפוזי המעורב בפתוגניות12. הנדן איפשר התמיינות בין שני הזנים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים שונים, וכימות והשוואות סטטיסטיות של תהליך הנשאות של הזנים שחוסנו לבדם או יחד.

לבדיקה זו של נדן עלי תירס יש מספר יתרונות על פני חיסונים צמחיים שלמים להדמיית תאים חיים. ראשית, הפרוטוקול מספק הדמיה מעולה, ללא צורך בניקוי או קיבוע, של פתוגנים המקיימים אינטראקציה עם תאים מארחים חיים בזמן אמת. לדוגמה, מחקרים שהשתמשו בנדן עלי תירס אפשרו זיהוי של מעבר ברור מביוטרופיה לנקרוטרופיה בהמיביוטרופי C. graminicola ואפשרו השוואות פונקציונליות למוטציה לא פתוגנית 7,12,16,17. למרות שנדן עלי אורז שנכרתו וחוסנו ב- M. oryzae יכולים להציג תסמינים שאינם תואמים את אלה שנצפו בצמחי אורז שלמים36, העיתוי והמראה של קולוניזציה, קריסת רקמות והתפתחות נגעים בנדן תירס דומה לזה שבעלים שלמים12,14. יתרון שני של בדיקת הנדן הוא שהיא מראה סינכרוניות רבה יותר בין שכפולים ויכולת שחזור ניסיונית של התיישבות פטרייתית12,18. בעוד שחיסון צמחים שלמים יכול לגרום לרמות לא סדירות של חדירה פטרייתית18, התנאים המבוקרים יותר של חיסוני הנדן מספקים יותר סינכרוניות ומאפשרים חקירה וכימות מדויקים יותר של אינטראקציות. סינכרוניות מוגברת זו הקלה על השימוש בנדן בניתוחי תמלול32,33. יתר על כן, פרוטוקול הנדן איפשר את המהירות הנדרשת של הכנת הדגימה לניתוח תמלול: חיתוך, שטיפה וסינון של כל נדן ארכו לא יותר מ-2 דקות לפני שהוקפאו במהירות הבזק לצורך מיצוי RNA32,33.

צעדים קריטיים להדמיה מוצלחת של תאים חיים של זיהום כוללים: 1) יש להשתמש בנדן מיד לאחר חיתוך לניסויים. אין לשמור נדן מחוסן שנכרת במשך יותר מ-6 ימים: אם ההתיישבות הפטרייתית כבדה, הם יתפרקו מהר יותר12; 2) היזהר לבחור נדנים שהם באותו גיל התפתחותי כדי להבטיח תוצאות ניתנות לשחזור יותר; 3) השתמש בתרחיף נבג טרי מתרביות שהשיגו נבג מקסימלי; 4) השתמש בסכיני גילוח חדים לחיתוך יעיל יותר כדי לייצר דגימות ברורות אופטית; 5) למזער מניפולציות מוגזמות ומיותרות של דגימות מכיוון שתהליך זה יכול להשפיע לרעה על מבנים חיים ואיכות התמונה; 6) בדוק תאי לחות מדי יום כדי לוודא שנייר הסינון לח מספיק; ו-7) בעת הדמיה של דגימות במיקרוסקופ קונפוקלי, יש לשמור על הגדרות רכישה קבועות במהלך הניסוי כדי להימנע מהכנסת שינויי עוצמה או הטיה בעת השוואת אותות פלואורסצנטיים בין דגימות. חלבונים פלואורסצנטיים עשויים לבצע פוטואקונומיקה אם עוצמת הלייזר ומשכו גבוהים מדי, והם עשויים לתת אותות חלשים יותר אם חלקי הרקמה נשמרים מתחת לכיסוי אטום במשך זמן רב. יש לבצע ניסויים מקדימים, כולל כל הבקרות המתאימות, כדי לתקנן ולמטב תנאים, חומרים וצירי זמן לקבלת התוצאות הניתנות ביותר לשחזור.

פתרון בעיות
חיתוך ידני אינו מספיק כדי לייצר נדן אופטי שקוף
ייתכן כי סכין הגילוח הפך משעמם. אם זה המקרה, להיפטר ממנו כראוי ולעבור לסכין גילוח חדש קצה אחד. השתמש בלחץ מתון ושמור על הלהב בזווית של 90° לנדן. יש לגרד את הדגימה בעדינות, אך בעקביות, עד לתצפית על חתך שטוח ושקוף. מומלץ לבדוק את הנדן תחת מיקרוסקופ מורכב לפני שממשיכים למיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.

נדן תירס מחוסן הוא שביר ביותר
זה קורה כאשר הפטרייה התיישבה ברוב רקמת הצמח. כתוצאה מכך, הרקמה מתפרקת ומתמוטטת. בעת הכנת דגימות שכבר נמצאות בשלב הנקרוטרופי, לחץ בעדינות על החלק כנגד שקופית מיקרוסקופ, מרח טיפת מים סטריליים DI וגרדו את הדגימה פעם או פעמיים עם כיסוי נקי.

נביטת נבגים נמוכה וחדירה in vivo
זה יכול להיות בגלל מספר גבוה של נבגים המעכבים נביטה או חדירה. ודא שריכוז החיסון מותאם ל 5 x 105 נבגים / מ"ל. אם הבעיה נמשכת, כוונן את הריכוז ל 5 x 104 נבגים/מ"ל. כבקרה לניסוי in vivo , הניחו 50 מיקרוליטר של אותו מתלה נבג על צלחת מחשב כף יד טרייה ופזרו אותה באופן שווה. בדוק את כדאיות הנבג ואת נביטה מדי יום.

שלבי התפתחות פטרייתיים אסינכרוניים על פני נדן
ודא שצמחי התירס נמצאים באותו שלב צמיחה וקטעי נדן התקבלו מאותו צומת. כמו כן, יש לוודא כי הנבגים הם בני קיימא וכי תרביות פטרייתיות נמצאות בשלב האופטימלי (למשל, לא יותר מאשר תרביות בנות שבועיים עבור C. graminicola) להכנת החיסון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים ואין להם מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים למשרד החקלאות האמריקאי על תמיכתם הכספית (מספרי המענקים 2018-67013-28489 ו-2020-70410-32901). כל הדעות, הממצאים, המסקנות או ההמלצות המובעות בכתב יד זה הן אך ורק של המחברים ואינן משקפות בהכרח את השקפותיו של משרד החקלאות האמריקאי. אנו מודים לסטודנטית מברזיל המבקרת ב"מדע ללא גבולות", מיארה דה סילבה, על התמונות שמופיעות באיור 6A ובאיור 7D. אנו מודים גם למחלקה לפתולוגיה של צמחים באוניברסיטת קנטקי על מתן גישה למיקרוסקופים קונפוקליים של אולימפוס.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axiocam monochrome microscope camera ZEISS 426560-9010-000 Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging
Axioplan 2 epifluorescence microscope ZEISS N/A Allows live viewing and image/video capture of biological samples 
Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL Thermo Fisher Scientific 75002431 Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g)
Falcon bacteriological Petri dish with lid Fisher Scientific 08-757-105 Polystyrene material; hydrophobic surface
Filter paper  Fisher Scientific 09-920-115 Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers
FV 3000 laser scanning confocal microscope Olympus N/A For visualization of fungal transformants' 
Germination paper Anchor Paper Co. SD7615L 76# heavy weight for plastic box moist chambers
Glass Petri dishes VWR International 75845-542 Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass;
complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers
Glass wool  Ohio Valley Specialty Chemical  3350 For glass-wool filter units
Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass VWR International 15170-172 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses
Microscope coverslips Fisher Scientific 12-553-457  Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width
Maize cultivar Golden Jubilee seeds West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada CN361 Matures in 95-105 days; seed type: F1
Microcentrifuge tubes  USA Scientific   1415-2500 1.5 mL capacity
Microscope slides  Fisher Scientific 12-550-123  Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width
Oatmeal Agar (OA) VWR International 255210 Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g
Nail polish Revlon 43671 Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear
Non-skirted 96-well PCR plate USA Sientific 1402-9500 100 uL plate volume
Pestle for microcentrifuge tubes USA Scientific  1415-5390 Conical tip; polypropylene material
PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective  Olympus 1-UB933 Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope
Potato Dextrose Agar (PDA) VWR International 90000-758 Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g
Pro-Mix BX Premium Horticulture Supply Co. N/A Premium general-purpose growing medium formulated to provide
a balance of water retention and proper drainage
SC10 cone-tainers  Greenhouse Megastore  CN-SS-SC-10B 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL
SC10 cone-tainers tray Greenhouse Megastore  CN-SS-SCTR98 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers
Single edge razor blade Thermo Fisher Scientific 17-989-145 AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade
Storage containers/boxes with latch closure Target 002-02-0405 Clear view storage boxes for rmoist chamber;
outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
  2. Hickey, E. L., Coffey, M. D. A fine-structural study of the pea downy mildew fungus Peronospora pisi in its host Pisum sativum. Canadian Journal of Botany. 55 (23), 2845-2858 (1977).
  3. Wharton, P. S., Julian, A. M., O'Connell, R. J. Ultrastructure of the infection of Sorghum bicolor by Colletotrichum sublineolum. Phytopathology. 91 (2), 149-158 (2001).
  4. Latunde-Dada, A. O., et al. Infection process and identity of the hemibiotrophic anthracnose fungus (Colletotrichum destructivum O'Gara) from cowpea (Vigna unguiculata (L) Walp.). Mycological Research. 100 (9), 1133-1141 (1996).
  5. Bourett, T. M., Howard, R. J. In vitro development of penetration structures in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Canadian Journal of Botany. 68 (2), 329-342 (1990).
  6. Sakamoto, M. On the new method of sheath inoculation of rice plants with blast fungus, Pyricularia oryzae Cav., for the studying of the disease-resistant nature of the plant. Bulletin of the Institute for Agricultural Research, Tōhoku University. 1 (3), 120-129 (1949).
  7. Buiate, E. A., et al. A comparative genomic analysis of putative pathogenicity genes in the host-specific sibling species Colletotrichum graminicola and Colletotrichum sublineola. BMC genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
  8. Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
  9. Khang, C. H., et al. Translocation of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
  10. Mosquera, G., Giraldo, M. C., Khang, C. H., Coughlan, S., Valent, B. Interaction transcriptome analysis identifies Magnaporthe oryzae BAS1-4 as biotrophy-associated secreted proteins in rice blast disease. The Plant Cell. 21 (4), 1273-1290 (2009).
  11. Sakulkoo, W., et al. A single fungal MAP kinase controls plant cell-to-cell invasion by the rice blast fungus. Science. 359 (6382), 1399-1403 (2018).
  12. Torres, M. F., Cuadros, D. F., Vaillancourt, L. J. Evidence for a diffusible factor that induces susceptibility in the Colletotrichum-maize disease interaction. Molecular Plant Pathology. 15 (1), 80-93 (2014).
  13. Valent, B., Khang, C. H. Recent advances in rice blast effector research. Current Opinion in Plant Biology. 13 (4), 434-441 (2010).
  14. Mims, C. W., Vaillancourt, L. J. Ultrastructural characterization of infection and colonization of maize leaves by Colletotrichum graminicola, and by a C. graminicola pathogenicity mutant. Phytopathology. 92 (7), 803-812 (2002).
  15. Vargas, W. A., et al. Plant defense mechanisms are activated during biotrophic and necrotrophic development of Colletotricum graminicola in maize. Plant Physiology. 158 (3), 1342-1358 (2012).
  16. Venard, C., Vaillancourt, L. Colonization of fiber cells by Colletotrichum graminicola in wounded maize stalks. Phytopathology. 97 (4), 438-447 (2007).
  17. Venard, C., Vaillancourt, L. Penetration and colonization of unwounded maize tissues by the maize anthracnose pathogen Colletotrichum graminicola and the related nonpathogen C. sublineolum. Mycologia. 99 (3), 368-377 (2007).
  18. Berruyer, R., Poussier, S., Kankanala, P., Mosquera, G., Valent, B. Quantitative and qualitative influence of inoculation methods on in planta growth of rice blast fungus. Phytopathology. 96 (4), 346-355 (2006).
  19. Belisário, R., Robertson, A. E., Vaillancourt, L. J. Maize anthracnose stalk rot in the genomic era. Plant Disease. 106 (9), 2281-2298 (2022).
  20. Warren, H. L., Nicholson, R. L., Ullstrup, A. J., Sharvelle, E. G. Observations of Colletotrichum graminicola on sweet corn in Indiana. Plant Disease Reporter. 57, 143-144 (1973).
  21. Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Special Report, Iowa State University. 48, (1986).
  22. Tuite, J. Plant pathological methods: fungi and bacteria. , Burgess Publishing Co. (1969).
  23. Wicklow, D. T., Rogers, K. D., Dowd, P. F., Gloer, J. B. Bioactive metabolites from Stenocarpella maydis, a stalk and ear rot pathogen of maize. Fungal Biology. 115 (2), 133-142 (2011).
  24. Daudi, A., O'Brien, J. A. Detection of hydrogen peroxide by DAB staining in Arabidopsis leaves. Bio-protocol. 2 (18), e263-e263 (2012).
  25. Benhamou, R. I., Jaber, Q. Z., Herzog, I. M., Roichman, Y., Fridman, M. Fluorescent tracking of the endoplasmic reticulum in live pathogenic fungal cells. ACS Chemical Biology. 13 (12), 3325-3332 (2018).
  26. Lorang, J. M., et al. fluorescent protein is lighting up fungal biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
  27. Liu, C. Y., Zhu, J., Xie, Z. Visualizing yeast organelles with fluorescent protein markers. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 182, e63846 (2022).
  28. Westermann, B., Neupert, W. Mitochondria-targeted green fluorescent proteins: convenient tools for the study of organelle biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 16 (15), 1421-1427 (2000).
  29. Lee, A. S. The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress. Methods. 35 (4), 373-381 (2005).
  30. Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), e12-e12 (2015).
  31. Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: generation and applications. International Journal of Developmental Biology. 57 (6-7-8), 535-543 (2013).
  32. O'Connell, R. J., et al. Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses. Nature Genetics. 44 (9), 1060-1065 (2012).
  33. Torres, M. F., et al. A Colletotrichum graminicola mutant deficient in the establishment of biotrophy reveals early transcriptional events in the maize anthracnose disease interaction. BMC Genomics. 17 (202), 1-24 (2016).
  34. Andrie, R. M., Martinez, J. P., Ciuffetti, L. M. Development of ToxA and ToxB promoter-driven fluorescent protein expression vectors for use in filamentous ascomycetes. Mycologia. 97 (5), 1152-1161 (2005).
  35. Gordon, C. L., et al. Glucoamylase:: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus niger. Microbiology. 146 (2), 415-426 (2000).
  36. Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
  37. Xavier, K. V., Pfeiffer, T., Parreira, D. F., Chopra, S., Vaillancourt, L. Aggressiveness of Colletotrichum sublineola strains from Sorghum bicolor and S. halepense to sweet sorghum variety Sugar Drip, and their impact on yield. Plant Disease. 101 (9), 1578-1587 (2017).

Tags

נדן תירס מנותק דימות תאים חיים פתוגנים של תירס פוליארי פטרייתי אופטימיזציה של פרוטוקולים פטריות המיביוטרופיות פטריות נקרוטרופיות תצפית מיקרוסקופית גדילה והתפתחות פטרייתיות תאי צמח חיים תרחיף נבגים תאי לחות אור פלואורסצנטי רציף תאי אפידרמיס בהירות אופטית ויזואליזציה בזמן אמת צביעה פלסמוליזה ציטולוגיה התפתחותית כדאיות תאי מארח ופתוגן חלבונים פלואורסצנטיים אינטראקציות תחרותיות אינטראקציות סינרגטיות חלבוני היתוך פלואורסצנטיים
נדן תירס מנותק להדמיית תאים חיים של זיהום על ידי פתוגנים פטרייתיים של תירס פוליארי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Belisário, R., Torres, M. F.,… More

Belisário, R., Torres, M. F., Buiate, E. A. S., Xavier, K. V., Nuckles, E. M., Vaillancourt, L. J. Detached Maize Sheaths for Live-Cell Imaging of Infection by Fungal Foliar Maize Pathogens. J. Vis. Exp. (199), e65755, doi:10.3791/65755 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter