Summary
この原稿では、トウモロコシと真菌植物病原体との相互作用の再現性のある細胞学的、生理学的、および分子学的研究のために、剥離したトウモロコシの葉鞘を使用する最適化された接種プロトコルについて詳しく説明します。葉鞘は、未固定組織における生きた植物と真菌の間の細胞相互作用のリアルタイム観察を容易にします。
Abstract
トウモロコシの葉鞘に半栄養性および壊死栄養性の葉面病原性真菌を接種するためのプロトコルを最適化しました。この方法は、もともとイネの葉鞘に適用されていた方法から変更され、生きた植物細胞の真菌の成長と発生を直接顕微鏡で観察することができます。トウモロコシの苗から採取した葉鞘に、2つの葉の襟が完全に出現し、20 μLの滴下(5 x 105 胞子/mLの真菌胞子懸濁液)を接種し、23°Cの湿度チャンバー内で連続蛍光灯下でインキュベートします。24〜72時間後、余分な組織をカミソリの刃で除去し、表皮細胞の単層、化学的固定や透明化を必要とせずに直接画像化できる光学的に透明なサンプルを残します。植物細胞と真菌細胞は実験期間中生き続け、相互作用をリアルタイムで視覚化できます。シースを染色または形質分解して、感染およびコロニー形成中の宿主細胞および病原体細胞の発生細胞診および生存率を研究することができます。蛍光タンパク質を発現するように形質転換された真菌株を鞘に接種または同時接種することで、分解能を高め、競合的または相乗的相互作用の評価を容易にすることができます。蛍光融合タンパク質を発現する真菌株を使用して、 プランタにおけるこれらの個々のタンパク質の産生および標的化を追跡および定量化することができます。接種した鞘組織を抽出して、核酸、タンパク質、または代謝物を特徴付けることができます。これらのシースアッセイの使用は、トウモロコシの真菌病原性のメカニズム、および病原性に寄与する真菌タンパク質エフェクターおよび二次代謝産物の詳細な研究を大幅に前進させました。
Introduction
細胞レベルでの空間的および時間的分析は、真菌と植物の相互作用の生理学と細胞学を理解するために重要です。過去には、化学的に固定された葉面組織1,2,3または透明化して染色した4、および人工膜5が、葉面病原体の発生と植物と真菌の相互作用の細胞診を調べるために使用されてきました。しかし、固定や透明化を行わずに、生きた宿主組織の感染事象をリアルタイムで調べることは、イメージング用の光学的に透明なサンプルの調製に関連する技術的な問題があるため、困難です。
1940年代後半に、イネいもち病菌Magnaporthe oryza6に対する生きたイネ表皮細胞の耐性を明視野顕微鏡で調べるために、分離葉鞘接種プロトコルが開発されました。最近では、ColletotrichumおよびMagnaporthe種による宿主コロニー形成の詳細な分子学的、生理学的、および細胞学的観察は、この葉鞘法の修正バージョンと、蛍光タンパク質を発現する真菌形質転換体、および落射蛍光および共焦点顕微鏡検査を含む高性能生細胞イメージングプロトコルを組み合わせることによって非常に容易になりました7,8,9,10、11、12、13。
この論文では、半栄養性および壊死栄養性の葉状真菌病原体による感染過程を観察するために、剥離したトウモロコシ葉鞘を使用した最適化された接種プロトコルについて詳しく説明します。具体的には、炭疽病の葉枯れ病や茎腐病の原因菌であるColletotrichum graminicola(C. graminicola)や、ディプロディアの葉枯れ病や茎腐病の原因となるStenocarpella maydisの研究に使用しています。ただし、この方法は、他の半栄養性および壊死栄養性の葉面真菌病原体にも適用できるはずです。これらの切除された葉鞘における感染およびコロニー形成イベント中の細胞学的および生理学的応答は、葉身全体の反応と同様である12,14,15。さらに、C. graminicolaによる鞘表皮細胞の半栄養性コロニー形成は、茎髄細胞のコロニー形成に類似している16,17。剥離した鞘は、葉身や茎の髄組織よりも、真菌の浸透とコロニー形成の同期性と実験的再現性が高いことを示しています14,16,17,18。ほとんどのトウモロコシ品種は、このプロトコルに使用できます。ただし、鞘に過剰な紫色の色素を持つ近交系またはハイブリッドは、色素がイメージングを妨げるため、あまり適していません。ゴールデンジュビリースイートコーンは、未処理の種子が市販されており、植物は多くの葉の病気に非常にかかりやすく、温室でよく育つため、私たちの研究に特に役立ちました。1970年代に米国で炭疽病の茎腐れ病が最初に流行した結果、インディアナ州ではスイートコーンの収穫が完全に失われました19,20。この葉鞘接種法は、生きた植物細胞と局所的に殺された植物細胞の真菌の成長と発生を直接観察および定量化し、真菌感染に対する適合/非互換応答における耐性反応を実証し、同じ鞘上の真菌株間の相互作用をリアルタイムでテストするために適用できます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注: このメソッドのワークフローを 図 1 に示します。
図1:剥離したトウモロコシの葉鞘を使用した最適化された接種プロトコルのステップ。 胞子懸濁液の調製、葉鞘の接種、生細胞顕微鏡用のサンプル調製は、それぞれ緑色(A)、紫色(B)、オレンジ色(C)のボックスで強調表示されています。BioRender.com で作成。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
1.植物および菌類材料
- 植物の成長
- 温室(14時間明るい/ 27°Cおよび10時間暗い/ 22°C)でSC10容器(材料表を参照)でトウモロコシの苗木(材料表を参照)を栽培します。市販の鉢植え用土3部(材料表を参照)と蒸気滅菌した表土2部からなる成長培地を使用します。
- 毎日1回、朝に頭上灌漑システムで2分間苗に水をやります。
- V2段階で苗木を土壌レベルで刈り取り、収穫します。V2成長段階は、苗木の高さが5〜10 cmで、2つの目に見える襟付きの葉があるときに到達します21。
- 湿らせたペーパータオルで植物を包み、ビニール袋に入れて実験室に運び、さらに処理します。
- 菌類培養
- 適切な寒天培地に約50粒の感染シリカを振りかけることにより、無菌条件下で保存された真菌シリカストック培養物を再活性化する22。形態学的変化および病原性の喪失を避けるために、継代培養は再活性化後に3倍以下に菌株を添加する。ジャガイモデキストロース寒天培地(PDA;材料 表参照)は C.グラミニコラ の培養に日常的に使用され、オートミール寒天培地(OA; 材料表参照)は S.maydisに使用されます。
- 真菌ストックを培養するためのPDAを調製するには、市販の脱水PDA19.5gを500mLの脱イオン(DI)水に懸濁します。OAを作るには、市販の脱水OA36gを脱イオン水で15〜30分間煮沸し、3層のチーズクロスでろ過し、脱イオン水で500mLの濾液にします。滅菌するオートクレーブ媒体。
- 形質転換株を扱う場合は、溶融して冷却した培地に適切な抗生物質(ハイグロマイシンB、遺伝剤など)を添加します。培地500 mL中のハイグロマイシンまたはゲネチシンの最終濃度は、それぞれ250 μg/mLおよび100 μg/mLです。
- 胞子状の菌糸体が発達するまで、最適な条件下で培養物をインキュベートします。 Colletotrichum graminicola と S. maydis は、蛍光灯と周囲湿度レベルが連続する 23 °C でよく育ちます。胞子形成は、 S. maydis では接種後 7 日(dai)、 C. graminicola では 14 dai までに発生します。
2.葉鞘接種
- グラスウールフィルターユニットアセンブリ
- 頑丈なハサミまたははさみを使用して、キャップと1.5 mL微量遠心チューブの円錐形の底から約0.5 mmを切り取ります( 材料表を参照)。
- グラスウール(約0.5 cm x 0.5 cm、 材料表を参照)をカットチューブの内側に置き、 図2に示すように中央の穴を覆います。
- ホウールガラスは刺激を引き起こす可能性があるため、グラスウールを切断するときは手袋を着用してください。
- リーフシースサポートラックの準備
- 図3Aに示すように、スカートのない96ウェルPCRプレート(材料表を参照)を6つの2列(8 x 2ウェル)サポートラックに切断します。
- ウェルの円錐形の底が上を向き、平らな上部が下を向くように、2列ラックを裏返します(図3B)。
- 湿らせた濾紙を入れたガラスペトリプレートに各支持体を置き、蓋で覆います( 材料表を参照)。このユニットは、シース用の小さな湿度チャンバーとして機能します。
- 接種剤の調製
- 各真菌株について、 図2に示すように、組み立てたグラスウールフィルターユニット1つを無傷の滅菌済み1.5 mL微量遠心チューブに入れます。後者は収集チューブとして機能します。
- チューブにラベルを付けます。
- 胞子培養物から分生子を採取するには、まず各プレートに3〜4 mLの滅菌脱イオン水を浸します。場合によっては、コロニー表面に液体の層を生成するために、より多くの水が必要になることがあります。このシステムでは湿潤剤は必要ありません。
- 滅菌された円錐形の先端の乳棒( 材料表を参照)を使用して寒天から胞子をほぐし、プレート全体を均等にこすります。
- 胞子懸濁液1mLをグラスウールフィルターユニットに無菌的に塗布し、胞子が重力によって収集チューブに流れるようにします。
- ろ過した胞子懸濁液を含むコレクションチューブを 3,500 x g で 5 分間遠心分離します。胞子は、微量遠心チューブの底にペレット化する必要があります。
注:ここで推奨されている速度よりも速い速度で C.graminicola 胞子を遠心分離すると、生存率が大幅に失われます。 - 液体をオートクレーブ可能な容器に注ぎ、1 mLの滅菌脱イオン水を加え、穏やかに攪拌してペレット状の胞子を再懸濁します。ステップ2.3.6のように遠心分離します。
- 胞子を3回洗浄して、発芽や浸透を低下させる可能性のある自己阻害剤を含む可能性のある分生子マトリックスを取り除きます。
- 3回目の洗浄後、300〜500μLの滅菌DI水を加えて、胞子を再懸濁して定量します。
- 100倍の倍率の複合顕微鏡下で血球計算盤を使用して、胞子濃度を決定します。カウントする前に胞子染色は必要ありません。
- 5 x 105 胞子/mL懸濁液を滅菌脱イオン水で調製します。
注: C.グラミニコラ 胞子懸濁液は、生存率が急速に失われる前に、室温で4時間以内に保つことができます。.分生子を冷蔵しても生存率は向上しません。
- シース接種
- 植物に真菌株を接種する前に、関連するバイオセーフティの慣行と手順を確認してください。
- 鞘の重なり合う縁に沿って親指の爪を走らせて、V2苗の最初の本葉から鞘を取り除き、シュートからそっと緩めます。シュートを取り外す前に、シュートの両側からシースを緩めます。
- 回収した葉鞘を3〜5cmのセグメントに切ります。接種前にシースの表面消毒を行う必要はありません。
- 各セグメントを非常にゆっくりと広げて、内側(同軸)表皮層を露出させます。
- 接種用のシースを準備している間、乾燥を防ぐために、残りの切除シースを湿らせたペーパータオルで包んでおいてください。
- 真菌胞子懸濁液20 μLを、 図4に示すように、シース片の中央、中肋骨の真上の内面に置きます。
- 図5に示すように、接種した葉鞘を水平に置き、中肋骨を下にして、湿らせた濾紙を含むガラスペトリプレート内の支持体に入れます。
- 各ラックには最大7つのシースを収納できます。サンプル調製またはインキュベーション中に発生する可能性のある反復の損失を補うために、株ごとに少なくとも5つのシースを接種します。
- 小さな湿度チャンバーを、湿らせた発芽紙で裏打ちされた透明な収納ボックスに入れます( 材料表を参照)。
- 箱を蓋で覆います。ボックスを23°Cでインキュベートし、意図した時間経過の間、観察される真菌の発生段階に応じて連続的に照射します。 C. graminicola を接種したトウモロコシ鞘の経時変化の概要を 表1に示す。
- 鞘に病気の兆候や症状がないか毎日チェックし、発芽とろ紙の両方を湿らせておきます。葉鞘は、接種がない場合に明らかな植物細胞の死滅や分解なしに、最大6日間保持することができます。
図2:グラスウールフィルターユニットの準備。(A) 0.5cm×0.5cmのグラスウールボールを、円錐形の底を取り除いた微量遠心チューブ1の内側に入れます。 (B-C) 次いで、濾過管を微量遠心管2に入れて、胞子懸濁液調製用の組み立て済みフィルターユニットを生成する。BioRender.com で作成。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:スカートなしの96ウェルPCRプレートの切断方法。(A) PCRプレートを6つのサポートラック、8 x 2ウェルにカット。単一のシース支持体の例を (B )に示します。葉鞘は支持体に水平に置かれます。BioRender.com で作成。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:鞘の接種方法。 シース部のアキシャル面に直接塗布された接種液のシングルドロップ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:シースインキュベーション法。 接種した葉鞘を、湿らせた濾紙が入ったガラスペトリプレート内の支持ラックに水平に置いた。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
3. 生細胞顕微鏡
- 顕微鏡用サンプル調製
- シース片を滅菌DI水でやさしくすすぎ、付着していない胞子や表面的な真菌の増殖を取り除きます。
- シースピースのアキシャル(内側)面を下向きにし、アキシャル(外側)面を一番上にして、シースを清潔なガラス顕微鏡スライド( 材料表を参照)に置きます。
- 新しい片刃のカミソリの刃( 材料表を参照)を使用して、シースの端を約1cm切り取り、中肋の両側の層組織のほとんどを取り除きます。
- かみそりの刃をシースに対して90°の角度で保持して、軸方向の中肋骨から組織を剃り、接種スポットの上の軸面に表皮層を露出させます。均一な厚さを維持するようにしてください。葉鞘を削った後は、サンプルを損傷する可能性があるため、それ以上のトリミングはお勧めしません。
- 剃った部分のサイズが1cm×1cm以下であることを確認してください。このプロセス中は、シースの中心を押さないでください。異なる胞子懸濁液を接種したシースを扱う場合は、手袋を消毒し、サンプル間でカミソリの刃を交換してください。
- 清潔なガラス顕微鏡スライドを用意しておいてください。シースセクションを片方の端から持ち上げ、慎重に新しいスライドに移します。シースの接種された(同軸)表面は、対物レンズに最も近い最上部にある必要があります。真菌構造への損傷を避けるために、セクションを静かに取り付けます。
- 切片に60 μLの滅菌脱イオン水を塗布し、24 mm x 60 mmのガラスカバーガラスを追加します( 材料表を参照)。気泡を避けるために、これをゆっくりと行ってください。
- 顕微鏡検査の準備ができたら、カバーガラスを透明なマニキュアで密封し( 材料表を参照)、各端に小さな滴を置き、滴をマニキュアブラシで接続してシームレスシールします。
注:このシースプロトコルは、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)、ニュートラルレッド、トリパンブルーなどの細胞学的染色剤、または植物細胞の生存率を評価するための細胞質分解の観察に使用できます。シース染色または細胞形質分解アッセイでは、カバーガラスを密封しないでください。 - プラズマ分解アッセイでは、高張溶液(0.75 Mスクロースまたは1 M塩化ナトリウム)をカバーガラスの一方の端に加え、折りたたんだ糸くずの出ないティッシュペーパーを使用して、サンプルを横切ってカバーガラスのもう一方の端まで溶液を引き寄せます。染色には、同様の方法で染色液を塗布します。
- 広視野顕微鏡
- 葉鞘を顕微鏡スライドに取り付けたら、400倍の倍率の広視野光学顕微鏡を使用して真菌のコロニー形成を検査します。
- 真菌の構造を詳細に観察するには、サンプルの画質を向上させるために、油ではなく水浸対物レンズを使用します。屈折率のミスマッチによる球面収差は、画像劣化の原因となります。水対物レンズは、広視野光学顕微鏡と共焦点顕微鏡に使用できます。
- シースあたりのコロニー形成の相対量を決定するには、100倍の倍率の広視野光学顕微鏡を使用して、各真菌浸透部位から侵入したトウモロコシ細胞の数をカウントします。この定量化は、菌株、治療法、および/または発生段階を比較する統計分析の前に適切なスクリーニングステップです。
- 共焦点レーザー走査型顕微鏡
- トランスジェニック真菌株の発生中にトウモロコシ組織中の蛍光タンパク質を観察するには、基本的な画像取得パラメーターを調整します。選択した蛍光マーカーに基づいて最適な励起/発光設定を特定します。
注:分泌タンパク質で構築された蛍光融合体を分析する場合は、60倍の水対物レンズが望ましいです。最新の共焦点顕微鏡は、アーチファクトや形状収差を避けるために、高度に補正された水浸対物レンズを備えています。 - 蛍光タンパク質の生細胞イメージングを意図する場合は、自家蛍光のコントロールとして形質転換されていない真菌株を使用します。以下の画像取得パラメータを使用して、倒立共焦点顕微鏡およびmCherry蛍光タンパク質で真菌-宿主のダイナミクスをキャプチャします。レーザー出力を最大5%、発現レベルに応じて450〜600の高電圧(HV)、1.375 Xゲイン、3%オフセット、セクションあたり最大5つのトウモロコシ細胞の分析用の光学ズームファクター1、個々の菌糸の光学ズームファクターを2〜5に設定します。
注:高解像度のZスタック共焦点画像は、3次元データを提供し、宿主と病原体の間のリアルタイムの相互作用をよりよく表示します。 - 分泌融合タンパク質に対応する蛍光強度の定量には、共焦点メーカーの画像解析ソフトウェアや、オンラインで無料でダウンロードできるImageJなどの画像処理プログラムを使用します。それに応じて蛍光シグナルを定量する方法の詳細については、マニュアルを参照してください。
- トランスジェニック真菌株の発生中にトウモロコシ組織中の蛍光タンパク質を観察するには、基本的な画像取得パラメーターを調整します。選択した蛍光マーカーに基づいて最適な励起/発光設定を特定します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
以下の例は、トウモロコシ葉鞘接種法を使用した後の代表的な結果を示しています。これらの例は、トウモロコシと真菌の相互作用の観察と比較を、この最適化されたアッセイでリアルタイムに行うことの容易さ、速度、精度を示しています。また、生細胞イメージングは定量的な情報の抽出を可能にし、分子学的、細胞学的、生理学的の比較研究に有用なツールを提供します。詳細については、成功した各アプリケーションについて引用されている元の出版物に記載されています。
データ例1:真菌の状態評価と真菌感染に対する植物の応答の検出のための接種された葉鞘の染色および形質分解の使用
トウモロコシの葉鞘は、明視野顕微鏡で生きた宿主細胞における Colletotrichum graminicola および Stenocarpella maydis の感染プロセスを視覚化および比較するために使用され、コロニー形成パターンと時間経過の詳細な説明を可能にしました(未発表の結果; 図6)。
これらの研究により、 S. maydis は、メラニン化したアプレッソリアを産生する C. graminicola とは異なり、未分化の菌糸腫脹を介して表皮細胞に直接侵入することが明らかになりました。表皮細胞内に入ると、両方の病原体は、一見無傷の細胞壁を通過して細胞から細胞へと進みます(図6A、B)。
シースをトリパンブルーまたはDAPIで染色することで、真菌菌のコロニー形成の性質と範囲をより簡単に評価できます(図6)。トリパンブルー染色により、C. graminicolaは当初、非常に狭い接続部を通って細胞間を移動する厚い一次菌糸を介して侵入することが明らかになりました。その後、真菌は壊死期に切り替わり、コロニーの中心に薄い二次菌糸を産生します(図6 C-E)12,14,16,17。
図6:明視野顕微鏡または落射蛍光顕微鏡で画像化した未染色または染色接種済みのトウモロコシ葉鞘。 (A)Stenocarpella maydisの接種後48時間(hpi)の細胞内菌糸。感染は、わずかに腫れた菌糸の先端(矢印)を介して発生します。(B)Colletotrichum graminicolaの細胞内菌糸48 hpi。感染はメラニン化したアプレッソリア(矢印)を介して発生します。(C)トリパンブルーで染色されたC.graminicolaの菌糸、狭い接続を介して前進するコロニー縁で細胞間進行(矢印)、72 hpi。(D)72 hpiのC. graminicolaのトリパンブルーに染色された菌糸の拡大図で、狭い接続部(矢印)を介してトウモロコシの細胞壁を通過します。(E)トリパンブルーで染色されたC.graminicolaの菌糸、コロニー中心72 hpi。太い一次菌糸(矢印)から、より狭い二次菌糸が出現しているのがわかります。(F) C. graminicola 72 hpiの菌糸、DAPIで染色された葉鞘の前進コロニー縁。染色された真菌および植物核は、UV光の下で蛍光を発します。各パネルのスケールバーは50 μmです。単色デジタルカメラと落射蛍光顕微鏡を組み合わせて得られた顕微鏡写真。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
シースを中性赤色で染色したり、形質分解を行ったりして、病原性真菌による感染およびコロニー形成中のトウモロコシ細胞の発生細胞診および生存率を研究することができます(図7)。
Colletotrichum graminicolaは、膜によって宿主細胞質から分離された厚い一次菌糸を持つ生きたトウモロコシ細胞に侵入する半栄養真菌です(図7A-C)12,14,16,17。一方、ステノカルペラ・メイディスは壊死性真菌であり、植物毒素23を産生し、表皮細胞(顆粒状になり、形質分解に失敗)を死滅させてから侵入する(図7D)。
C. graminicolaおよび他の葉面病原体に対するトウモロコシの防御には、活性酸素種(ROS)、特に過酸化水素(H 2 O2)の蓄積が含まれます12,15。植物と病原体との相互作用の酸化化学を調べるために、3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)を細胞染色に使用することができる24。DABはH2O2によって酸化され、トウモロコシの葉鞘に見られる暗褐色の沈殿物を生成する(図7 E、F)12,24。色素の生成は、宿主抵抗応答に関連する酸化バーストの指標です。
図7:明視野顕微鏡で画像化した染色および/または形質分解したトウモロコシの葉鞘。 (A)C. graminicola 24 hpiを接種し、形質分解を行い、中性赤色で染色した葉鞘。アプレッソリア(矢印)の下の生きたトウモロコシ細胞は形質分解して染色し、病原体が侵入前に細胞を殺さないことを示しています。(B)葉鞘48 hpiをC. graminicolaで、形質分解を行い、中性赤色で染色した。一次菌糸(矢印)でコロニーを形成したトウモロコシ細胞はまだ生きており、C. graminicolaが生物栄養生物として細胞に侵入することを立証しています。(C) C. graminicola の葉鞘 48 hpi は、コロニーの前進端で菌糸が細胞間を移動することを示しています。シースはプラズマ分解されていますが、染色されていません。コロニーエッジ(矢印)に隣接するコロニー化されていない細胞は、形質分解を続けます。(D)浸透前のS.maydisを含む葉鞘24hpi。発芽した胞子(矢印)の下の細胞は顆粒状に見え、形質分解に失敗しており、S. maydisが侵入前に細胞を殺し、壊死栄養生物として振る舞うことを示しています。(E)抵抗性トウモロコシ近交系Mp305 24 hpiの葉鞘にC. graminicolaを添加し、DABで染色した。暗色染色は、画像中央の単一細胞の強い酸化反応を示しており、個々のアプレッソリアの大部分を取り囲む褐色色素のハローが見られ、写真上部の細胞に肉芽化が見られます。(F)アプレッソリア周辺に堆積した褐色色素のハローと、その付近のトウモロコシ細胞壁における色素の沈着を拡大図(矢印)。各パネルのスケールバーは50μmですが、(F)は20μmです。単色デジタルカメラと落射蛍光顕微鏡を組み合わせて得られた顕微鏡写真。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
データ例2:蛍光タンパク質を発現する真菌による生細胞イメージング
細胞質蛍光タンパク質を発現する真菌菌糸は、落射蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、染色を必要とせずに生きた鞘細胞で高解像度で可視化できます(図8)。
蛍光タンパク質は、ミトコンドリア、核、内膜系などのさまざまな真菌細胞小器官を標的にして、足底の生きた真菌細胞におけるそれらの位置と活性を追跡することができます(図8C)25,26,27,28(未発表の結果)。蛍光タンパク質は、様々な機能のレポーターとして働くために、異なる真菌プロモーターによって駆動されることもできる:例えば、BiPシャペロン分泌ストレス応答タンパク質によって駆動されるRFPが示されている(図8D)29(未発表の結果)。葉鞘を用いることで、宿主細胞にコロニーを形成する真菌菌糸によって蓄積・分泌される、個別にタグ付けされた蛍光融合タンパク質を可視化することができます8,9(図8E)。核や原形質膜など、様々な細胞区画を標的とする蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックトウモロコシ株も利用可能であり30,31、トウモロコシの細胞構造、例えば核に対する感染の影響を評価するための接種に用いることができる。これらのトランスジェニックトウモロコシ系統の使用は、侵入されていないトウモロコシ細胞の核が、通常、C. graminicolaによってすでにコロニー形成されている細胞に最も近い細胞壁に移動することを実証しました(未発表の結果;図8F)。
図8:蛍光タンパク質を発現するColletotrichum graminicolaの落射蛍光(A、B)または共焦点(C、D、E、F)イメージング。(A)ToxAプロモーター34の制御下でmRFPを細胞質的に発現するC.グラミニコラ株を有する未染色、形質分解葉鞘48hpi。これらの葉鞘には、著しい自家蛍光も見られます。(B)ToxAプロモーターの制御下でSGFPを細胞質的に発現するC.グラミニコラ株を含む未染色の葉鞘48hpi。(C)HDELアンカー35を有する内膜系を標的とするSGFPを発現するColletotrichum graminicola。(D)BiPシャペロンのC.グラミニコラホモログのプロモーターの制御下でmRFPで形質転換したC.グラミニコラを含む未染色の葉鞘24hpi。一次菌糸の赤色蛍光は、分泌ストレスに応答したBiP活性化の指標です。(E)トウモロコシの葉鞘の細胞壁を44 hpiで交差させているC. graminicola WTの初代菌糸のarabinofuranosidase::mCherry融合蛋白質の蓄積。(F)ToxAプロモーターの制御下でmRFPを細胞質的に発現するC.グラミニコラ菌株を有する植物核30,31,48 hpiを標的とするYFPを発現するトランスジェニックトウモロコシ系統の葉鞘。各パネルのスケールバーは 20 μm ですが、パネル A は 50 μm です。顕微鏡写真は、単色デジタルカメラと落射蛍光顕微鏡を組み合わせて取得しました。(C-F)の画像はレーザー走査型共焦点顕微鏡で撮影した。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
データ例3:トウモロコシの葉鞘を用いて、真菌株間の適合/非適合応答および相互作用の詳細な細胞診を検討
トウモロコシの葉鞘において、非病原性 C.グラミニコラ 変異株(cpr1 MT)を野生型(WT)株と比較した(図9A、B)12。
細胞質蛍光タンパク質で標識した株の生細胞イメージングにより、この変異体はトウモロコシの葉鞘内の細胞から細胞への移動が特異的に損なわれていることが実証されました。シースプロトコルにより、正確な定量が可能になり、 cpr1 MTが95%の確率で最初のコロニー形成細胞に閉じ込められていることが明らかになりました(図9C)12。これは、同じ時間枠で感染の5%未満が最初のコロニー細胞内に留まっていたWTとは著しい対照をなしていた12。興味深いことに、 cpr1 MTは、WT株のような局所凍結死鞘で最初に感染した細胞を超えて腐生的に増殖することができました(図9D)。このことは、 cpr1 MTがコロニー形成できないことが、生きたトウモロコシ細胞の活発な応答に特異的に関連していることを示しました。
葉鞘接種アッセイは、GFP発現 cpr1 MT株とRFP発現WT株を同じ葉鞘に同時接種することにより、それらの株間の相互作用を試験するために使用された12。株を互いに近づけて接種した場合(トウモロコシ細胞が8個以内離れている場合)、 cpr1 MTは細胞から細胞へと生物栄養生物として正常に増殖することができました(図9E、F)。形質分解アッセイにより、 cpr1 MT真菌が生細胞に侵入したことが確認されました12。これらすべての詳細な観察は、シースアッセイによって可能になり、 C. graminicola のWT株によって産生される適合性を誘導するが、 cpr1 MT12には欠けている拡散性因子の存在を示唆した。
図9:Colletotrichum graminicolaのWT株とcpr1 MT株が関与する互換性のある相互作用と互換性のない相互作用。異なる蛍光タンパク質の使用により、トウモロコシの葉鞘に同時接種したときに2つの菌株を区別することができました12。(A)トウモロコシの葉鞘に48hpiで細胞質mRFPを発現するWT C. graminicola株。(B)トウモロコシの葉鞘にSGFPを発現するC. graminicola cpr1 MT株を72hpiで発現。cpr1 MTは、接種後6日以内であっても、最初の感染細胞を超えてコロニーを形成することはめったにありません(<5%)。(C)SGFPを72dpiで発現するC. graminicola cpr1 MT株の近景。この場合、それはなんとか細胞壁を横切って次の細胞に入ることができましたが、その後、発達を停止しました。(D)SGFP、48 hpiを死滅した鞘組織で発現するC. graminicola cpr1 MT株。cpr1 MT株は、WTと同様に、生きていないトウモロコシ鞘細胞に急速にコロニーを形成します。 (E)WT-mRFP C. graminicola株とcpr1 MT-GFP C. GRAMINICOLA 株をトウモロコシの葉鞘(48 hpi)に近接して共接種すると、cpr1 MT-GFP株は、生物栄養生物として、生きたトウモロコシ鞘細胞を正常に進行する能力を取り戻します。生細胞内の生物栄養増殖は、形質分解アッセイによって確認されました。(F)SGFPを発現するC. graminicola cpr1 MT株の近傍図で、WTに隣接して接種した場合(トウモロコシ細胞が8個以内離れている)に細胞間から細胞へと成長する。スケールバーは、50 μm(A、B、E)または20 μm(C、D、F)に相当します。顕微鏡写真は、単色デジタルカメラと落射蛍光顕微鏡を組み合わせて取得しました。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
接種された鞘は、転写活性分析のためのRNA抽出用の組織を作製するためにも使用されている32,33。シースは、抽出前に検査して感染プロセスをモニターできるため、複数の複製にわたってサンプルの均一性を確保できるため、この目的に理想的でした。これらの研究により、Colletotrichumのライフスタイル移行段階32,33の間で発現差のある遺伝子の波を特定することができました。
データ例4:次善実験の結果
生細胞イメージングが不十分なのは、葉鞘のトリミングが不十分で、表皮細胞層が重なり、サンプルが光学的に不透明になるためである可能性があります(図10)。
図10:葉鞘のトリミングが不十分なため、実験結果が最適ではない。A)複数の表皮細胞層が真菌の発生の検査を妨害する例。(B)生細胞イメージングに影響を与える細胞層の重なりの例。スケールバーは20 μmです。顕微鏡写真は、単色デジタルカメラと落射蛍光顕微鏡を組み合わせて取得しました。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
また、接種濃度が調整されていないと、胞子の数が少なくなる(図11A)か、または多くなる可能性があり、後者は発芽や浸透率の低下(図11B)につながる可能性があります。後者はまた、各真菌浸透部位にコロニーを形成したトウモロコシ細胞の定量化を妨げる可能性があります。
図11:接種物濃度の不適切な調整による最適でない実験結果。 A. はい。 シースに接種された C.グラミニコラ 胞子懸濁液濃度が低いため、真菌の浸透部位の数が少なくなります。 イ. 葉鞘にC . graminicola 接種物濃度が高いと、近接して複数のアプレッソリアが発生し、宿主細胞の浸透が低下します。スケールバーは20 μmです。顕微鏡写真は、単色デジタルカメラと落射蛍光顕微鏡を組み合わせて取得しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 顕微鏡観察時間(hpi) | トウモロコシ葉鞘に接種したC. graminicolaの発生段階 |
| 12 | アプレッソリア |
| 24 | 一次菌糸 |
| 36 | 二次菌糸 |
| 48 | 二次菌糸 |
| 60 | アセルヴリ |
| 72 | アセルヴリ |
| 108 | アセルヴリ |
表1:Colletotrichum graminicola感染の経過:C.graminicola株M1.001を接種したトウモロコシの葉鞘の経時変化の要約は、ライフスタイルの移行を通じて真菌の発生マイルストーンに基づいています。顕微鏡観察は12時間ごとに行った。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここで説明する最適化された葉鞘接種法は、イネの葉鞘のために開発され、適用されている元のプロトコルから変更されています6,8,36。これにより、広視野顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、生きた植物細胞における真菌の成長と発生を直接かつ詳細に観察することができます。プロトコルはトウモロコシのコロニー形成の間にいろいろな顕微鏡現象の性格描写、比較および定量化のために適している対互換性のない相互作用の間に菌類の開発そして宿主の応答を含んで;プランタにおける特定の真菌タンパク質の産生および分泌;トウモロコシと真菌の相互作用中に生成される一般的または新規の病原性因子の細胞診および生化学。この方法は、トウモロコシの半栄養病原体および壊死栄養病原体に使用しました。生物栄養病原体(さび菌など)の接種は試みていませんが、鞘は生きているので、その用途にも有用です。また、この方法をソルガム鞘に適用し、宿主および栽培品種特異的耐性の細胞診の調査も行っています7,37。ソルガムシースの場合、プロトコルへの唯一の調整は、中央に1滴を垂らすのではなく、シース全体を胞子懸濁液で満たすことでした。これは、ソルガムシースの直径が小さいために必要でした。
これらのシースアッセイの使用により、病原性に重要な宿主のコロニー形成と真菌分子のメカニズムに関する詳細な研究が大幅に進歩しました。例えば、この方法を適用したところ、トウモロコシによる C. sublineola とソルガムによる C. graminicola の非宿主認識が示され、どちらの場合も過敏な耐性応答が含まれていました7。トウモロコシの葉鞘は、同じ鞘上の離れた真菌株間の相互作用をテストするためにも使用されました。この症例では、病原性WT株と非病原性 cpr1 MT株を生きた鞘に同時接種したところ、WT株によるトウモロコシ細胞の感受性の誘導が示され、病原性に関与する拡散性因子の証拠が得られました12。鞘は、異なる蛍光タンパク質を発現する2つの菌株の分化、および単独または一緒に接種された菌株のコロニー形成プロセスの定量化および統計的比較を可能にした。
このトウモロコシ葉鞘アッセイは、生細胞イメージングにおいて全草接種に比べていくつかの利点があります。第一に、このプロトコルは、生きた宿主細胞とリアルタイムで相互作用する病原体の優れたイメージングを、除去や固定を必要とせずに提供します。例えば、トウモロコシの葉鞘を用いた研究では、半栄養性のC. graminicolaの生物栄養から壊死への明確な切り替えの検出が可能になり、非病原性変異体との機能比較が容易になりました7,12,16,17。M. oryzaeを接種したイネの葉鞘を切除すると、イネの葉鞘全体とは異なる症状が現れることがあると報告されているが36、トウモロコシの鞘におけるコロニー形成、組織崩壊、病変発生のタイミングと出現は、葉全体におけるものと類似している12,14。シースアッセイの2番目の利点は、複製間の同期性が高く、真菌のコロニー形成の実験的再現性を示すことです12,18。全草の接種は真菌の浸透のレベルを不規則にすることがあるが18、鞘接種のより高度に制御された条件は、より多くの同期性を提供し、相互作用のより正確な調査と定量化を可能にする。この同期性の向上により、トランスクリプトーム解析におけるシースの使用が容易になった32,33。さらに、シースプロトコルにより、トランスクリプトーム解析に必要なサンプル調製速度が可能になり、各シースのトリミング、リンス、スクリーニングは、RNA抽出のために瞬間凍結されるまでに2分もかかりませんでした32,33。
感染の生細胞イメージングを成功させるための重要なステップには、次のものがあります: 1)シースは、切断後すぐに実験に使用する必要があります。切除された接種された鞘は6日以上保持されるべきではありません:真菌のコロニー形成が重い場合、それらはより速く分解します12;2)より再現性の高い結果を確保するために、同じ発達年齢のシースを選択するように注意してください。3)最大の胞子形成を達成した培養物からの新鮮な胞子懸濁液を使用します。4)鋭利なカミソリの刃を使用して、より効率的なトリミングを行い、光学的に透明なサンプルを生成します。5)このプロセスはライブ構造と画質に悪影響を与える可能性があるため、サンプルの過度で不必要な操作を最小限に抑えます。6)湿度室を毎日チェックして、ろ紙が十分に湿っていることを確認します。7)共焦点顕微鏡でサンプルをイメージングする場合は、サンプル間の蛍光シグナルを比較する際に強度の変化やバイアスが発生しないように、実験中に取得設定を固定してください。蛍光タンパク質は、レーザーの強度と持続時間が高すぎると光退色する可能性があり、組織切片が密封されたカバーガラスの下に長期間保管されると、弱いシグナルを発することがあります。最も再現性の高い結果を得るには、条件、材料、およびタイムラインを標準化および最適化するために、すべての適切なコントロールを含む予備実験を実施する必要があります。
トラブルシューティング
手作業によるトリミングでは、光学的に透明なシースを製造するには不十分です
カミソリの刃が鈍くなっている可能性があります。その場合は、適切に廃棄し、新しい片刃のカミソリ刃に切り替えてください。適度な圧力を使用し、ブレードをシースに対して90°の角度に保ちます。サンプルを穏やかに、しかし一貫して、平らで半透明の部分が観察されるまでこすります。共焦点レーザー走査型顕微鏡に進む前に、複合顕微鏡でシースを確認することをお勧めします。
接種されたトウモロコシ鞘は非常に壊れやすいです
これは、真菌が植物組織のほとんどにコロニーを形成したときに発生します。その結果、組織は劣化し、崩壊します。すでに壊死栄養段階にあるサンプルを調製する場合は、切片を顕微鏡スライドにそっと押し付け、滅菌DI水を一滴塗布し、清潔なカバーガラスでサンプルを1〜2回こすります。
in vivoでの胞子の発芽と浸透が少ない
これは、発芽または浸透を阻害する胞子の数が多いことが原因である可能性があります。接種物濃度が5 x 105 胞子/mLに調整されていることを確認してください。問題が解決しない場合は、濃度を5 x 104 胞子/mLに調整してください。 in vivo 実験のコントロールとして、同じ胞子懸濁液50 μLを新しいPDAプレートに置き、均等に広げます。胞子の生存率と発芽を毎日チェックしてください。
鞘をまたいだ非同期真菌発生段階
トウモロコシの植物が同じ成長段階にあり、鞘のセクションが同じノードから得られたことを確認してください。また、胞子が生存可能であり、真菌培養が接種調製に最適な段階(例えば、 C. graminicolaの培養生後2週間以内)にあることを確認してください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、競合する金銭的利害関係はなく、開示するものも何もないと宣言しています。
Acknowledgments
著者らは、USDA-NIFAの財政支援に感謝する(助成金番号2018-67013-28489および2020-70410-32901)。この原稿で表明された意見、調査結果、結論、または推奨事項は、著者のものであり、必ずしも米国農務省の見解を反映しているわけではありません。ブラジルからの「国境なき科学」の客員学生であるMayara de Silva氏には、図 6A と 図7Dの画像を提供していただいたことに感謝します。また、ケンタッキー大学の植物病理学部がオリンパスの共焦点顕微鏡へのアクセスを提供してくれたことにも感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
References
- Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
- Hickey, E. L., Coffey, M. D. A fine-structural study of the pea downy mildew fungus Peronospora pisi in its host Pisum sativum. Canadian Journal of Botany. 55 (23), 2845-2858 (1977).
- Wharton, P. S., Julian, A. M., O'Connell, R. J. Ultrastructure of the infection of Sorghum bicolor by Colletotrichum sublineolum. Phytopathology. 91 (2), 149-158 (2001).
- Latunde-Dada, A. O., et al. Infection process and identity of the hemibiotrophic anthracnose fungus (Colletotrichum destructivum O'Gara) from cowpea (Vigna unguiculata (L) Walp.). Mycological Research. 100 (9), 1133-1141 (1996).
- Bourett, T. M., Howard, R. J. In vitro development of penetration structures in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Canadian Journal of Botany. 68 (2), 329-342 (1990).
- Sakamoto, M. On the new method of sheath inoculation of rice plants with blast fungus, Pyricularia oryzae Cav., for the studying of the disease-resistant nature of the plant. Bulletin of the Institute for Agricultural Research, Tōhoku University. 1 (3), 120-129 (1949).
- Buiate, E. A., et al. A comparative genomic analysis of putative pathogenicity genes in the host-specific sibling species Colletotrichum graminicola and Colletotrichum sublineola. BMC genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
- Khang, C. H., et al. Translocation of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
- Mosquera, G., Giraldo, M. C., Khang, C. H., Coughlan, S., Valent, B. Interaction transcriptome analysis identifies Magnaporthe oryzae BAS1-4 as biotrophy-associated secreted proteins in rice blast disease. The Plant Cell. 21 (4), 1273-1290 (2009).
- Sakulkoo, W., et al. A single fungal MAP kinase controls plant cell-to-cell invasion by the rice blast fungus. Science. 359 (6382), 1399-1403 (2018).
- Torres, M. F., Cuadros, D. F., Vaillancourt, L. J. Evidence for a diffusible factor that induces susceptibility in the Colletotrichum-maize disease interaction. Molecular Plant Pathology. 15 (1), 80-93 (2014).
- Valent, B., Khang, C. H. Recent advances in rice blast effector research. Current Opinion in Plant Biology. 13 (4), 434-441 (2010).
- Mims, C. W., Vaillancourt, L. J. Ultrastructural characterization of infection and colonization of maize leaves by Colletotrichum graminicola, and by a C. graminicola pathogenicity mutant. Phytopathology. 92 (7), 803-812 (2002).
- Vargas, W. A., et al. Plant defense mechanisms are activated during biotrophic and necrotrophic development of Colletotricum graminicola in maize. Plant Physiology. 158 (3), 1342-1358 (2012).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Colonization of fiber cells by Colletotrichum graminicola in wounded maize stalks. Phytopathology. 97 (4), 438-447 (2007).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Penetration and colonization of unwounded maize tissues by the maize anthracnose pathogen Colletotrichum graminicola and the related nonpathogen C. sublineolum. Mycologia. 99 (3), 368-377 (2007).
- Berruyer, R., Poussier, S., Kankanala, P., Mosquera, G., Valent, B. Quantitative and qualitative influence of inoculation methods on in planta growth of rice blast fungus. Phytopathology. 96 (4), 346-355 (2006).
- Belisário, R., Robertson, A. E., Vaillancourt, L. J. Maize anthracnose stalk rot in the genomic era. Plant Disease. 106 (9), 2281-2298 (2022).
- Warren, H. L., Nicholson, R. L., Ullstrup, A. J., Sharvelle, E. G. Observations of Colletotrichum graminicola on sweet corn in Indiana. Plant Disease Reporter. 57, 143-144 (1973).
- Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Special Report, Iowa State University. 48, (1986).
- Tuite, J. Plant pathological methods: fungi and bacteria. , Burgess Publishing Co. (1969).
- Wicklow, D. T., Rogers, K. D., Dowd, P. F., Gloer, J. B. Bioactive metabolites from Stenocarpella maydis, a stalk and ear rot pathogen of maize. Fungal Biology. 115 (2), 133-142 (2011).
- Daudi, A., O'Brien, J. A. Detection of hydrogen peroxide by DAB staining in Arabidopsis leaves. Bio-protocol. 2 (18), e263-e263 (2012).
- Benhamou, R. I., Jaber, Q. Z., Herzog, I. M., Roichman, Y., Fridman, M. Fluorescent tracking of the endoplasmic reticulum in live pathogenic fungal cells. ACS Chemical Biology. 13 (12), 3325-3332 (2018).
- Lorang, J. M., et al. fluorescent protein is lighting up fungal biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
- Liu, C. Y., Zhu, J., Xie, Z. Visualizing yeast organelles with fluorescent protein markers. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 182, e63846 (2022).
- Westermann, B., Neupert, W. Mitochondria-targeted green fluorescent proteins: convenient tools for the study of organelle biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 16 (15), 1421-1427 (2000).
- Lee, A. S. The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress. Methods. 35 (4), 373-381 (2005).
- Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), e12-e12 (2015).
- Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: generation and applications. International Journal of Developmental Biology. 57 (6-7-8), 535-543 (2013).
- O'Connell, R. J., et al. Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses. Nature Genetics. 44 (9), 1060-1065 (2012).
- Torres, M. F., et al. A Colletotrichum graminicola mutant deficient in the establishment of biotrophy reveals early transcriptional events in the maize anthracnose disease interaction. BMC Genomics. 17 (202), 1-24 (2016).
- Andrie, R. M., Martinez, J. P., Ciuffetti, L. M. Development of ToxA and ToxB promoter-driven fluorescent protein expression vectors for use in filamentous ascomycetes. Mycologia. 97 (5), 1152-1161 (2005).
- Gordon, C. L., et al. Glucoamylase:: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus niger. Microbiology. 146 (2), 415-426 (2000).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Xavier, K. V., Pfeiffer, T., Parreira, D. F., Chopra, S., Vaillancourt, L. Aggressiveness of Colletotrichum sublineola strains from Sorghum bicolor and S. halepense to sweet sorghum variety Sugar Drip, and their impact on yield. Plant Disease. 101 (9), 1578-1587 (2017).
