Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

שיקולים מעשיים לתכנון, ביצוע ופרשנות של מחקרים הכוללים בדיקות כיפוף עצם שלמות של עצמות מכרסמים

Published: September 1, 2023 doi: 10.3791/65616
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Indiana University-Purdue University Indianapolis

Summary

בדיקה מכנית של עצמות מכרסמים היא שיטה חשובה לחילוץ מידע לגבי רגישות העצם לשברים. בהיעדר הבנה מעשית מתאימה, התוצאות עלולות להתפרש יתר על המידה או חסרות תוקף. פרוטוקול זה ישמש כמדריך כדי להבטיח בדיקות מכניות מבוצעות במדויק כדי לספק נתונים תקפים ופונקציונליים.

Abstract

שבריריות השלד המובילה לשבר היא משבר בריאות הציבור בארה"ב הגורם ל-1.5 מיליון שברים מדי שנה ולעלויות טיפול ישיר בסך 18 מיליארד דולר. היכולת להבין את המנגנונים העומדים בבסיס מחלת העצם ואת התגובה לטיפול היא לא רק רצויה, אלא קריטית. בדיקה מכנית של עצם משמשת כטכניקה רבת ערך להבנה וכימות של רגישות העצם לשבר. בעוד שיטה זו נראית פשוטה לביצוע, ניתן להגיע למסקנות לא הולמות ולא מדויקות אם המשתמש מתעלם מההנחות השולטות ומשלבי המפתח. זה נצפה על פני דיסציפלינות כמו מחקרים ממשיכים להתפרסם עם שימוש לרעה בשיטות ופרשנות שגויה של תוצאות. פרוטוקול זה ישמש כבסיס לעקרונות הקשורים לבדיקות מכניות יחד עם היישום של טכניקות אלה - החל משיקולים של גודל הדגימה, דרך קצירת רקמות ואחסונן, וכלה בניתוח נתונים ופרשנות. עם זה ביד, מידע רב ערך לגבי הרגישות של עצם לשבר ניתן להשיג, קידום הבנה הן עבור מחקר אקדמי ופתרונות קליניים.

Introduction

בדיקה מכנית של עצם היא השיטה העיקרית לחלץ מידע פונקציונלי הקשור לרגישות של עצם לשבר. במחקרים פרה-קליניים ניתן להשתמש במספר שיטות בדיקה, אך ללא ספק הנפוצה ביותר היא כיפוף עצמות ארוכות. בדיקות אלה קלות לביצוע וניתן להשתמש בהן על עצמות שגודלן נע בין אדם לעכבר. מכיוון שעכברים הם אחד מבעלי החיים הנחקרים ביותר במחקר פרה-קליני, פרוטוקול זה יתמקד בבדיקות כיפוף המבוצעות על עצם הירך והטיביה של עכברים.

לפני ביצוע בדיקות כיפוף, יש לקצור ולאחסן עצמות כראוי. שיטות האחסון הנפוצות ביותר היו באופן מסורתי הקפאת עצמות בגזה ספוגה במי מלח, הקפאה במי מלח בלבד, או התייבשות עצמות באתנול 1. עצמות המאוחסנות באתנול הוכחו כבעלות קשיחות מוגברת ומודולוס אלסטי וירידה בפרמטרים של עיוות לעומת אלה המאוחסנים קפואים1. אפילו החזרת לחות העצמות לפני הבדיקה אינה מחזירה תכונות אלה לרמות נורמליות 1. אחסון שקוע במי מלח עלול לגרום נזק לעצם מכיוון שהלחץ מופעל ככל שהמלח מתרחב. בנוסף, תידרש הפשרה מלאה של התמיסה כדי להסיר את העצמות לסריקת טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (μCT). כתוצאה מכך, הקפאת עצמות טריות שנקטפו בגזה ספוגה במי מלח הפכה לשיטת האחסון הסטנדרטית ומומלצת לאורך פרוטוקול זה.

מכיוון שגודלה וצורתה של עצם משפיעים על חוזקה בתפזורת ומודלים רבים של מחלות משנים באופן משמעותי את גודל העצם ואת המורפולוגיה, עקרונות הנדסיים משמשים לנרמל את השפעות הגודל כדי לייצר תכונות המעריכות את התנהגות הרקמה2. גישה זו דורשת גיאומטריית חתך של מיקום הכשל, אשר נרכשת בדרך כלל באמצעות μCT כדי ליצור סריקות של העצמות לפני הבדיקה. μCT נמצא בשימוש נרחב בשל זמינותו ורזולוציית התמונה הגבוהה. יתר על כן, תרומות של רקמות רכות אינן כלולות, וסריקה אינה דורשת קיבוע כימי או שינויים אחרים לעצם 3,4. בכל צורות ה- CT, מקור רנטגן מתמקד באובייקט בעוד גלאי בצד השני של האובייקט מודד את אנרגיית הרנטגן המתקבלת. פעולה זו מייצרת צל רנטגן של הדגימה שניתן להמיר לתמונה 3,5. האובייקט הנסרק מסובב (או שמקור קרני הרנטגן והגלאי מסובבים סביב הדגימה), ויוצרים תמונות שניתן לשחזר למערך נתונים תלת ממדי המייצג את האובייקט5.

רזולוציית הסריקה, או עד כמה שני אובייקטים יכולים להיות קרובים זה לזה ועדיין להיפתר בנפרד, נשלטת על ידי שינוי גודל הווקסל הנומינלי או גודל הפיקסל בתמונה המתקבלת. מקובל לחשוב שעצמים חייבים להיות לפחות פי שניים מגודלו של ווקסל בודד כדי להיות מזוהים3, אך יחס גבוה יותר יאפשר דיוק משופר. יתר על כן, ווקסלים גדולים נוטים יותר להשפעות נפח חלקיות: כאשר ווקסל יחיד מכיל רקמות בצפיפויות שונות, הוא מוקצה לממוצע של צפיפויות אלה, ולא לצפיפות הספציפית של רקמה בודדת, מה שעלול להוביל להערכת יתר או חסר של אזורי הרקמה וצפיפות המינרלים3. בעוד שניתן להקל על בעיות אלה על ידי בחירת גדלי ווקסל קטנים יותר, שימוש ברזולוציה גבוהה יותר אינו מבטיח ביטול אפקטים של נפח חלקי ועשוי לדרוש זמני סריקה ארוכים יותר3. בעת סריקת עצמות ex vivo, גודל ווקסל של 6-10 מיקרומטר מומלץ בדרך כלל כדי להעריך במדויק את הארכיטקטורה trabecular של עצמות עכבר. גודל ווקסל גדול יותר של 10-17 מיקרומטר יכול לשמש לעצם קליפת המוח, אם כי יש להשתמש בגודל הווקסל הסביר הקטן ביותר. פרוטוקול זה משתמש בגודל ווקסל של 10 מיקרומטר, שהוא קטן מספיק כדי להבדיל בין תכונות טרבקולריות מרכזיות ולמזער השפעות נפח חלקי ללא זמן סריקה נרחב.

יש לבחור בקפידה גם את הגדרות אנרגיית הרנטגן ומסנן האנרגיה, שכן צפיפות ועובי המינרלים הגבוהים של רקמת העצם מחלישים מאוד ומשנים את ספקטרום אנרגיית הרנטגן המועברת. ההנחה הרווחת היא שמכיוון שספקטרום קרני הרנטגן הנפלט שווה ערך לספקטרום היוצא מהאובייקט6, שימוש בקרני רנטגן באנרגיה נמוכה על עצמים צפופים כגון עצם יכול להוביל לחפץ המכונה התקשות קרן7. מתח גבוה יותר של 50-70 kVp מומלץ בעת סריקת דגימות עצם כדי להפחית את השכיחות של ממצאים אלה5. בנוסף, הכנסת מסנן אנרגיה מאלומיניום או נחושת יוצרת קרן אנרגיה מרוכזת יותר, מה שממזער עוד יותר את הממצאים 4,7. מסנן אלומיניום 0.5 מ"מ ישמש לאורך פרוטוקול זה.

לבסוף, שלב סיבוב הסריקה ואורך הסיבוב (לדוגמה, 180°-360°), שולטים יחד במספר התמונות שצולמו, מה שקובע את כמות הרעש בסריקההסופית 4. ממוצע מסגרות מרובות בכל שלב יכול להפחית את הרעש, אך עשוי להאריך את זמן הסריקה4. פרוטוקול זה משתמש בשלב סיבוב של 0.7 מעלות ומסגרת ממוצעת של 2.

הערה אחרונה לגבי הסריקה: יש לסרוק פאנטום כיול הידרוקסיאפטיט באמצעות אותן הגדרות סריקה כמו עצמות הניסוי כדי לאפשר המרה של מקדמי הנחתה לצפיפות מינרלים בגרם / ס"מ35. פרוטוקול זה משתמש בפנטום של 0.25 גרם/ס"מ 3 ו-0.75 גרם/ס"מ3 של הידרוקסיאפטיט, אם כי קיימים פאנטום שונים. שים לב שחלק ממערכות הסריקה משתמשות בפנטום פנימי כחלק מכיול המערכת היומי.

לאחר השלמת הסריקה, ההקרנות הזוויתיות משוחזרות לתמונות חתך רוחב של האובייקט, בדרך כלל באמצעות התוכנה הנלווית של היצרן. לא משנה באיזו מערכת משתמשים, חשוב לוודא כי העצם כולה נלכדת בשחזור וכי הסף מוגדר כראוי כדי לאפשר זיהוי של עצם לעומת לא עצם. לאחר השחזור, קריטי לסובב את כל הסריקות בתלת מימד, כך שהעצמות מכוונות באופן עקבי ומיושר כראוי עם הציר הרוחבי, שוב באמצעות תוכנת היצרן.

לאחר הסיבוב, ניתן לבחור אזורי עניין (ROI) לניתוח בהתבסס על האם תכונות קליפת המוח, תכונות טרבקולריות או גיאומטריית שבר לנורמליזציה מכנית רצויות. עבור האחרונים, יש לבחור ROI לאחר בדיקה על ידי מדידת המרחק מאתר השבר לקצה אחד של העצם ושימוש בגודל ווקסל כדי לקבוע את מיקום הפרוסה המתאים בקובץ הסריקה. האזור שנבחר צריך להיות לפחות 100 מיקרומטר אורך, עם נקודת השבר במרכז המשוער של החזר ההשקעה, כדי לספק הערכה נאותה4.

כאשר ROI נבחרים, נדרשות שתי תכונות לנורמליזציה מכנית (כדי לחשב מתח כיפוף ומתח): המרחק המרבי מציר הכיפוף הנייטרלי למשטח שבו מתחיל הכשל (ההנחה היא שהוא המשטח הטעון במתח, שנקבע על ידי מערך הבדיקה), ומומנט השטח של האינרציה סביב הציר הנייטרלי, (תלוי גם בהגדרת הבדיקה). פרוטוקול זה ממליץ על שימוש בקוד מותאם אישית כדי לקבוע ערכים אלה. לקבלת גישה לקוד, פנה ישירות למחבר המתאים או בקר באתר המעבדה בכתובת https://bbml.et.iupui.edu/ לקבלת מידע נוסף.

לאחר השלמת סריקת μCT, ניתן להתחיל בבדיקות מכניות. ניתן לבצע בדיקות כיפוף בתצורות של ארבע נקודות או שלוש נקודות. בדיקות כיפוף ארבע נקודות עדיפות מכיוון שהן מבטלות לחץ גזירה בעצם בין נקודות העמסה, ומאפשרות כיפוף טהור להתרחש באזור זה3. לאחר מכן העצם תישבר עקב מתח, מה שייצור כשל שמייצג יותר את תכונות הכיפוף האמיתיות של העצם3. עם זאת, יש להעמיס את העצם באופן כזה שיעביר את אותו עומס בשתי נקודות ההעמסה (ניתן להקל על כך עם ראש העמסה מסתובב). במבחני כיפוף תלת נקודתיים, יש שינוי גדול בלחץ הגזירה שבו נקודת העומס פוגשת את העצם, מה שגורם לעצם להישבר בנקודה זו עקב גזירה, ולא מתח3. תקני ASTM ממליצים שחומרים שעוברים כיפוף צריכים להיות בעלי יחס אורך-רוחב של 16:1, כלומר אורך טווח התמיכה צריך להיות גדול פי 16 מרוחב העצם כדי למזער את ההשפעות של גזירה 8,9. לעתים קרובות זה בלתי אפשרי להשיג בעת בדיקת עצמות מכרסמים קטנות, ולכן טווח ההעמסה פשוט נעשה גדול ככל האפשר אבל עם שינוי קטן ככל האפשר בצורת חתך רוחב. יתר על כן, בעת ביצוע כיפוף ארבע נקודות, היחס בין אורכי התוחלת התחתונה והעליונה צריך להיות ~ 3:18, אשר בדרך כלל ניתן להשיג בשוקה, אך קשה בעצם הירך הקצרה יותר. בנוסף, הדפנות הקורטיקליות הדקות יותר של עצם הירך הופכות אותן לרגישות לעיוות מסוג טבעת המשנה את צורת חתך העצם במהלך הבדיקה (ניתן להדגיש זאת בבדיקות של ארבע נקודות מכיוון שנדרש כוח גדול יותר כדי לגרום לאותו רגע כיפוף בהשוואה לכיפוף של שלוש נקודות). לכן, כיפוף תלת נקודתי ישמש עבור עצם הירך של העכבר ואילו כיפוף ארבע נקודות ישמש עבור tibiae לאורך פרוטוקול זה.

לבסוף, חשוב להפעיל כראוי את המחקר לניתוח סטטיסטי. המלצה כללית לבדיקות מכניות היא גודל מדגם של 10-12 עצמות לכל קבוצת ניסוי כדי להיות מסוגל לזהות הבדלים, שכן תכונות מכניות מסוימות, במיוחד פרמטרים לאחר התפוקה, יכולות להיות משתנות מאוד. במקרים מסוימים, משמעות הדבר עשויה להיות התחלה עם גודל דגימה גבוה יותר של בעלי חיים בהתחשב בשחיקה שעלולה להתרחש במהלך המחקר. יש להשלים ניתוח גודל מדגם באמצעות נתונים קיימים לפני ניסיון מחקר.

ישנן מגבלות והנחות רבות, אך מבחני כיפוף יכולים לספק תוצאות מדויקות למדי, במיוחד כאשר הבדלים יחסיים בין קבוצות מעניינים. מאפיינים אלה, יחד עם ניתוח של ארכיטקטורה טרבקולרית ומורפולוגיה קליפת המוח, יכולים לספק תובנה טובה יותר לגבי מצבי מחלה ומשטרי טיפול. אם נקפיד על אותם היבטים של הניסוי שנמצאים בשליטתנו (למשל, קציר, אחסון, סריקה ובדיקות), נוכל להיות בטוחים שהושגו תוצאות מדויקות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הנהלים המתוארים בפרוטוקול זה הכוללים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת בית הספר למדעים של אוניברסיטת אינדיאנה לבעלי חיים מוסדיים ושימוש (IACUC) לפני ההליך. בעלי חיים המתוארים בהליך הומתו באמצעות שאיפתCO2ואחריה נקע צוואר הרחם כאמצעי משני להמתת חסד.

1. קציר, אחסון והפשרת עצמות

  1. קציר ואחסון
    1. הניחו את צד הגחון של העכבר כלפי מעלה. השתמש באזמל (או סכין גילוח או מספריים) כדי לבצע חתך בצומת המשוער של עצם הירך והאגן בצד אחד.
    2. המשך את החתך הראשוני באופן דורסלי עד לאיתור מפרק הירך; חפשו את ראש עצם הירך שנראה ככדור לבן קטן המחובר לאגן.
    3. הפעילו לחץ עם קצה אזמל על הקצה הפרוקסימלי של ראש עצם הירך עד שראש עצם הירך יוצא מהשקע. הבלו רקמות נוספות כדי לשחרר את הגפה האחורית משארית הפגר.
    4. כאשר הגפה האחורית מבודדת, יש להפריד בין השוקה לעצם הירך על ידי גרימת כיפוף במפרק הברך. הזז את האזמל בכיוון המדיאלי-צדדי במשטח הקדמי של הברך כדי לחתוך דרך כל רקמה סמוכה, כולל הרצועות בין העצמות.
    5. אם זה לא מפריד בין העצמות, האריכו את מפרק הברך כדי לאפשר גישה למשטח האחורי. היזהרו מחיתוך העצם או גירוד הסחוס המפרקי.
    6. לאחר הפרדת עצם הירך והשוקה, יש להסיר את כף הרגל האחורית מהשוקה, על ידי כיפוף המפרק ובאמצעות תנועת ניסור מדיאלית-צידית על המשטח האחורי של המפרק. במידת הצורך, להרחיב את המפרק כדי לחשוף את המשטח הקדמי. היזהר להימנע חיתוך העצם.
    7. לאחר הבידוד, נקו את העצמות מכל הרקמה הרכה הדבקה. אם מבצעים בדיקות כיפוף של ארבע נקודות על השוקה, הסירו גם את הפיבולה. הפיבולה מחוברת על ידי רצועות בקצה הפרוקסימלי אך מאוחה לעצם השוקה בסמוך לקצה הדיסטלי של העצם. השתמש מספריים חדים ליד נקודת החיבור כדי להפריד את הפיבולה.
    8. עטפו את העצמות המבודדות והמנוקות בנפרד בגזה ספוגה במי מלח ואחסנו אותן בטמפרטורה של -20°C. עשו זאת מיד לאחר הקציר.
    9. חזור על שלבים 1.1.1 עד 1.1.8 עבור הצד השני של הפגר.
      הערה: אם יש התנגדות כאשר מנסים להפריד את העצמות בשלבים 1.1.4-1.1.6, עדיף לחזור על השלבים ולא לנסות להפריד את העצמות. תנועות כוחניות עלולות להוביל לנזק או לשבר בעצמות.
  2. הפשרה
    הערה: יש למזער את מספר מחזורי ההקפאה-הפשרה שהעצם עוברת, שכן מחזורי הקפאה-הפשרה מוגזמים עלולים להשפיע לרעה על התכונות המכניות של העצם. הפשרה חלקית לסריקת μCT יכולה להיות מושגת על ידי השארת העצם בטמפרטורת החדר למשך 5-10 דקות. רק להפשיר לחלוטין את העצם בעת ביצוע בדיקות כיפוף כמתואר להלן.
    1. הפשרת לילה מועדפת
      1. העבירו את העצמות מאחסון של -20°C ל-1-4°C בחדר קר או במקרר. ודא שהעצמות נשארות שם במשך 8-12 שעות כדי להפשיר לחלוטין לפני הבדיקה.
    2. הפשרה מהירה
      1. הגדר את טמפרטורת האמבטיה לכ 37 °C (77 °F). פעם אחת בטמפרטורה זו, להוסיף את העצמות לאמבטיה.
      2. השאירו את העצמות באמבטיה למשך כשעה.

2. סריקת μCT

  1. עטפו את העצמות בפרפילם לפני הסריקה כדי לשמור על הידרציה. שמור את כל העצמות האחרות על קרח בזמן ההמתנה לסריקה.
  2. לאחר העטיפה בפרפילם, הניחו את העצם במחזיק כדי להתממשק עם הסורק. ודא שכל העצמות הסרוקות מיושרות באותו כיוון כמו יישור עקבי יפשט את הסיבוב בהמשך הניתוח.
  3. התאם את הגדרות הסריקה בהתאם ליישום הסריקה. הגדרות הסריקה הכלליות הבאות מומלצות לעצמות עכבר: רזולוציה/גודל ווקסל: 10 מיקרומטר; גודל פיקסל: בינוני, 2000 x 1048; מסנן: אלומיניום 0.5 מ"מ; שלב סיבוב: 0.7; ממוצע פריימים: 2.
    הערה: הגדרות אלה עשויות להשתנות בהתאם למערכת המשמשת לסריקה, ויש לעיין במדריך למשתמש של היצרן ולמשתמש לפי הצורך.
  4. לאחר הפעלת מקור הרנטגן, בצע תיקון שדה שטוח כדי למזער את הממצאים. לשם כך, ראשית, ודא שהחדר ריק וכבה את השדה השטוח.
  5. מדדו את העוצמה הממוצעת של השדה וכווננו אותה ל-60%. ברגע שאתה מגיע ל- 60%, עדכן את השדה השטוח והפעל אותו שוב.
  6. ודא שהעוצמה הממוצעת היא כעת (86-88%).
    הערה: תהליך זה עשוי להשתנות בהתאם למערכת μCT שבה נעשה שימוש. עיין במדריך למשתמש לפני שתנסה לבצע את התהליך.
  7. לאחר ביצוע מוצלח של תיקון השדה השטוח, מקם את המחזיק בתא. ודא שהדגימות ממורכזות ומפולסות לפני הצבת הכן בתא.
  8. לאחר שהכן מאובטח, סגור את החדר, ודא שכל העצם תילכד בסריקה (ייתכן שיהיה צורך בתצוגת סקאוט), והתחל בסריקה.
  9. לאחר הסריקה, אחסנו מחדש את העצמות בגזה ספוגה במי מלח בטמפרטורה של -20°C.

3. שחזור μCT

  1. בחר ROI שיתפוס את כל העצם בשחזור. לשם כך, הצג את חתך העצם הגדול ביותר ואת גודל החזר ההשקעה בהתבסס על חתך זה.
  2. הגדר את סף התוכנה כדי לאפשר זיהוי נאות של עצם בהשוואה ללא עצם. לשם כך, השתמש בהיסטוגרמה שבה אילוץ תחתון מוגדר על 0 והאילוץ העליון מוגדר בסוף נתוני ההיסטוגרמה העיקריים.
  3. התאם הגדרות נוספות, כולל הפחתת טבעת והקשחת קרן ל- 5% ו- 20%, בהתאמה. בדוק כי פיצוי אי התאמה הוא בטווח של -7 עד 7. ערכים אלה עשויים להשתנות בהתאם לתוכנה. ודא שהם מאומתים באמצעות המדריך למשתמש והוראות מבוססות היצרן לפני תחילת השחזור.
    הערה: ניתן למזער ממצאים במהלך השחזור באמצעות תיקונים להקשחת קרן, ארטיפקטים טבעתיים ופיצוי על אי התאמה. פיצוי על אי התאמה עשוי לשמש אינדיקטור לאיכות הסריקה ואם מחוץ לטווח שצוין על-ידי היצרן, יש לחזור על הסריקה. עם זאת, הגדרות השחזור יהיו תלויות תוכנה, ויש להיוועץ במדריך למשתמש.

4. סיבוב μCT

הערה: לאחר השחזור, יש לסובב את הסריקות כדי לקבוע כיוון עקבי על פני כל העצמות, וכדי להבטיח שחלקים רוחביים של העצם המתקבלת נלקחים באופן נורמלי לציר האורך עם זווית היסט קטנה ככל האפשר. זה צריך להיעשות עם התוכנה של המשתמש לפי בחירתו.

  1. סיבוב עצם הירך
    1. סובב את עצם הירך כך שלכל העצמות תהיה אותה אוריינטציה אורכית. לדוגמה, לכוון את כל העצמות עם הקצה הפרוקסימלי של העצם בחלק העליון של הסריקה.
    2. סובב את העצם כך שכיוון החתך של כל העצמות יהיה זהה. לדוגמה, סובב את העצמות כך שהצד הקדמי יהיה תמיד בצד ימין של הסריקות.
    3. לאחר ביצוע התאמות אלה, יישרו את הסריקה כדי להבטיח שמירה על סימטריה סביב הציר המרכזי.
    4. שמור את ערכת הנתונים המסובבת.
  2. סיבוב טיביה
    1. חזור על שלבים 4.1.1-4.1.4 עבור השוקה.

5. הליך בדיקה מכנית

  1. הכנה
    1. לפני הבדיקה המכנית, יש לוודא שהתקבלה סריקת μCT ברזולוציה של 6-10 מיקרומטר ושוחזרה כדי לוודא שנרכשה סריקה איכותית עבור כל דגימה לחישוב גיאומטריית חתך באתר השבר (חתכים 2-3).
    2. עם סריקות שהושגו ואומתו, להפשיר את כל העצמות לפני הבדיקה (סעיף 1) . בדוק את כל העצמות מניסוי אחד באותו יום וסדר את סדר הבדיקות באופן אקראי כדי למזער את הטיית המשתמש ואת השתנות המערכת בין דגימות וקבוצות ניסוי. ודא כי העצמות להישאר hydrated לאורך כל תהליך הבדיקה.
  2. הגדרת מנגנון
    1. אתר תא עומס עם רגישות וקיבולת מתאימות לדגימה. שקול את טווח הכשל הצפוי עבור הדגימה ובחר תא עומס עם קיבולת גדולה יותר בכ-50% תוך מקסום הרגישות (לדוגמה, תא עומס של 10 ליברות עם קיבולת של 45 N עבור עצם עכבר בטווח הכשל של 0-25 N).
    2. אתר גופי העמסה ותמיכה בטווח.
    3. התקינו את תא העומס ואת גופי התאורה כפי שמוצג באיור 1, על-ידי הברגת תא העומס לתמיכה העליונה או התחתונה של הבודק, מתקן הטעינה העליון לתא העומס והמתקן התחתון לתמיכה התחתונה של הבודק. ודא התאמה מאובטחת.
      הערה: חיבור תא העומס למתקן העליון מומלץ בדרך כלל בעת ביצוע בדיקות כיפוף כדי למנוע מגע של נוזל עם תא העומס, אך ניתן להשתמש בחלק התחתון במידת הצורך.
    4. לאחר התקנת תא העומס וגופי התא, בחר אורך טווח תמיכה וודא שהוא נשאר קבוע עבור כל הדגימות הנבדקות. כדי לבחור מרחק טווח תמיכה, ראשית, אתר את העצם הקצרה ביותר בקבוצת הדגימה.
    5. לכוון את העצם בין גופי התאורה כפי שמוצג באיור 2.
    6. לכיפוף תלת-נקודתי של עצם הירך, עקבו אחר איור 2A. ודא שהמשטח הקדמי של העצם הוא כנגד טווח התמיכה ואזור התוחלת נמצא בתוך הדיאפיזה של הדגימה. הימנעו מלכלול את הטרוכנטר השלישי בקצה הפרוקסימלי ואת נקודת המעבר שבה העצם מתרחבת למטפיזה וקונדילים בקצה הדיסטלי.
    7. לכיפוף של ארבע נקודות, ודא שטווחי התמיכה וההעמסה מיושרים וממורכזים זה עם זה. עקבו אחר איור 2B כדי לטעון את העצם בגופי התאורה.
      1. הגדר את אורכי התמיכה והטעינה ליחס של 3:1 8 (לדוגמה, טווח תמיכה של 9 מ"מ וטווח טעינה של3 מ"מ).
      2. עבור שוקה, יש להעמיס את המשטח המדיאלי של העצם כנגד מוטת התמיכה בתמיכה אחת בצומת השוקה/פיבולה. התמיכה השנייה תמוקם ככל הנראה מיד לאחר הפסגה הטיביאלית. ודא שטווח ההעמסה, ממורכז בטווח התמיכה, ולאחר מכן מכיל אזור אחיד של העצם.
    8. מדוד את מרחק טווח התמיכה אם אתה מבצע כיפוף של שלוש נקודות ואת מרחקי טווח הטעינה והתמיכה אם אתה מבצע כיפוף של 4 נקודות והקלט מרחקים אלה. ודא שערך זה נרשם ממרכז נקודות הטעינה הן עבור מדידות טווח הטעינה והן עבור מדידות טווח התמיכה.
    9. מניחים את העצם בחזרה מלוחים או rehydrate עם בולוס של מלוחים.
      הערה: בעת בחירת נקודות לטווח העמסה, מומלץ להשתמש בנקודות מעגליות (רדיוס של 0.75 מ"מ מספיק מכיוון שהוא מפזר את העומס תוך מגע עם העצם במשיק של המעגל). בעוד התאוריה ממליצה על קצה סכין כדי לייצג עומס נקודתי, זה ירסק את העצם בנקודת הפעלת העומס, מה שיוביל להערכות יתר של מתח והערכת חסר של מודולוס.
    10. ודאו שכל חלקי גוף התאורה הדוקים וללא תזוזה.
  3. הגדרת תוכנה
    1. ודא שהבודק מחובר כראוי למחשב באמצעות תיבת המודול, טען ערוצים סלולריים וכל דרישה אחרת לפי מדריך המערכת.
    2. בתוכנה המשויכת לבודק המכאני, צור פרופיל בדיקת כיפוף עם רמפה בעלת קצב תזוזה איטי מספיק כדי לא לגרום להשפעות ויסקו-אלסטיות (0.025 מ"מ לשנייה משמש לעתים קרובות) כדי לטעון את העצם לכישלון.
    3. תדר דגימה מינימלי של 25 הרץ מומלץ גם בעת יצירת פרופיל בדיקה, אם כי עדיף קצב דגימה גבוה יותר.
    4. צור תיקיה אחת לכל קבוצת לימוד ושמור כל מבחן כקובץ נפרד בתוך תיקיה זו.
  4. טעינה ובדיקה של דוגמאות
    1. בחר עצם מופשרת כראוי (ראה שלב 1.2). מדוד ורשום את אורכו המלא באמצעות קליפרים.
    2. העמיסו את הדגימה על גופי התאורה כפי שמוצג באיור 2A אם בדקו עצם הירך בכיפוף תלת-נקודתי ובאיור 2B אם בדקו טיביה בכיפוף של ארבע נקודות.
    3. שנה את שם הקובץ כך שישקף את הדגימה הנבדקת.
    4. אפס את העומס (לא את התזוזה). הפעל את המניע של המערכת; ודא שהוא אינו נמצא בבקרת עומס או תזוזה.
    5. בזהירות, יש למרוח עומס מקדים מינימלי על העצם כדי להבטיח את מיקומה ולסייע במניעת גלגול העצם אך לוודא שהיא אינה פוגעת בדגימה. יש לכוון לטעינה מראש של כ- 0.25 N. ודא שכיוון העצם הרצוי נשמר לפני שתמשיך.
    6. לחות את הדגימה על ידי טבילה נדיבה עם מלוחים.
    7. התחל את בדיקת הכיפוף על-ידי בחירה באפשרות התחל או הפעל בתוכנה. קריטי: שימו לב היטב לדגימה במשך כל הבדיקה ושימו לב לבדיקות שבהן אירעו בעיות כלשהן (למשל, גלגול, החלקה).
      הערה: בעיות אלה עלולות לסכן נתונים והערות לגבי בדיקות אלה יעזרו להתייעץ במהלך הניתוח.
    8. שימו לב שהעצם מתחילה להישבר (בצד המתיחה). רוב הבדיקות ימשיכו עד שתתרחש כשל. בשלב זה, הבדיקה תסתיים באמצעות המגבלות המתוכנתות שלה. אם מתרחש כשל אך הבודק ממשיך לזוז, הפסק את הבדיקה באופן ידני כדי למנוע נזק לתא העומס.
    9. לאחר השלמת הבדיקה, מדדו את האורך מהקצה הדיסטלי ועד לנקודת השבירה באמצעות קליפרים ותיעדו אותו.
    10. חזור על שלבים 5.4.1 – 5.4.9 עבור כל דגימה.

Figure 1
איור 1: הגדרת בודק מכני. (א) מבחני כיפוף של שלוש נקודות ו-(ב) ארבע נקודות. תא הטעינה מוצג בצהוב, גופי הטעינה מוצגים בכחול וגופי התמיכה מוצגים בירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: כיוון העצמות בין גופי התאורה. (A) כיוון נכון של עצם הירך בגופי העמסה בעלי כיפוף תלת-נקודתי המציג (מלמעלה למטה) מבט מהצד המדיאלי, הקדמי והאחורי של עצם הירך כאשר הוא ממוקם נכון. גופי הטעינה מוצגים בכתום וגופי התמיכה מוצגים בכחול. יש לכוונן את התוחלת התחתונה כך שתכלול כמה שיותר מהחלק הישר ביותר של הדיאפיזה, והמתקן העליון צריך להיות ממורכז בין מרווחים אלה. (B) כיוון נכון של טיביה לכיפוף של ארבע נקודות המראה (מלמעלה למטה) מבט מהצד הקדמי, הלטרלי והמדיאלי של השוקה. יש להעמיס את העצם כך שהמשטח המדיאלי ייגע עם גוף התאורה התחתון, והמשטח הרוחבי יקשר עם המקבע העליון. יש למקם את צומת הטיביה-פיבולה ממש מחוץ לטווח ההעמסה. יש לכוונן את המרווחים כך שיעמדו בצורה הטובה ביותר ביחס טווח העמסה לתמיכה של 1:3. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

6. בחירת החזר השקעה

  1. כאשר אורכי ההפסקה מוקלטים, טען את התמונות המסובבות לתוכנה המועדפת על ידי המשתמש. לאחר טעינת התמונות המסובבות, אתר והקלט את הפרוסות העליונות והתחתונות של העצם.
  2. חישוב ההפרש בין הפרוסה העליונה לתחתונה. הכפל ערך זה בגודל הווקסל הסורק כדי לקבוע את האורך הכולל של העצם במיקרומטרים.
  3. כדי לאתר את מיקום השבר בסריקת CT, חלק את אורך השבר שנרשם (במיקרומטרים) בגודל ווקסל כדי לקבל את מספר פרוסות μCT מהקצה הדיסטלי של הסריקה לנקודת השבירה.
  4. בחר החזר השקעה, הממורכז במיקום זה. ראשית, הגדר את האורך הרצוי הכולל של החזר ההשקעה (לפחות 100 מיקרומטר). מצאו את מספר הפרוסות שאורך זה מייצג על ידי חלוקת האורך במיקרומטרים בגודל הווקסל כדי לקבוע את המספר הכולל של פרוסות בהחזר ההשקעה.
  5. כדי להשיג את הגבול התחתון של החזר ההשקעה, חלק את המספר הכולל של פרוסות החזר ההשקעה ב- 2 והפחת ערך זה ממיקום המעבר שחושב קודם לכן שנמצא בשלב 6.4.
  6. הוסף את האורך הכולל של החזר ההשקעה בפרוסות לערך שחושב קודם לכן כדי לקבל את הגבול העליון של החזר ההשקעה.
  7. בחר את החזר ההשקעה המתאים, בהתבסס על גבולות מחושבים, ושמור אותו.

7. נורמליזציה של כוח ונתוני עקירה

הערה: הבודק המכני יפיק רק נקודות עם קואורדינטות x ו- y (תזוזה, כוח). נקודות אלה ניתנות להמרה ללחץ ומתח באמצעות משוואות הכיפוף של אוילר-ברנולי למאמץ ומתח, אך אלה דורשות תכונות גיאומטריות המתקבלות מסריקות μCT. ניתן לכמת מאפיינים אלה באמצעות התוכנה המועדפת על המשתמש. אנו מעדיפים קוד מותאם אישית, המעניק שליטה מלאה על כל התשומות, החישובים והפלטים. כפי שהוזכר קודם לכן, לקבלת גישה לקוד, פנה ישירות למחבר המתאים או בקר באתר המעבדה בכתובת https://bbml.et.iupui.edu/ לקבלת מידע נוסף. משוואות המאמץ והמתח, כמו גם התכונות הגיאומטריות הדרושות שיש לקבל מסריקות μCT, כדי לחשב אותן נדונות להלן.

  1. משוואות נורמליזציה של כיפוף שלוש נקודות
    1. המשוואה המשמשת לחישוב מתח בכיפוף של שלוש נקודות מוצגת להלן במשוואה 1. במשוואה זו, "F" מייצג כוח ו- "L" מייצג את אורך טווח התמיכה. ערכי הכוח נרשמים על ידי הבודק המכני במהלך הבדיקה. ודא שאורך טווח התמיכה נרשם לפני הבדיקה. "c" ו- "I" הן תכונות גיאומטריות שיחושבו באמצעות סריקות μCT (סעיף 7.3).
      Equation 1(1)
    2. המשוואה לחישוב מאמץ מוצגת להלן במשוואה 2; "c" ו- "L" מייצגים את אותן תכונות הן עבור חישובי מתח והן עבור חישובי מתח. "d" מציין ערכי תזוזה שנרשמו על ידי הבודק המכני במהלך הבדיקות.
      Equation 2(2)
  2. משוואות נורמליזציה של כיפוף ארבע נקודות
    1. משוואת הלחץ בכיפוף של ארבע נקודות מוצגת להלן במשוואה 3. "F" ו- "I" נשארים אותם משתנים שנדונו בשלב 7.1.1. חשב "a" ממדידות טווח התמיכה והטעינה לפני הבדיקה. אם עוקבים אחר היחס המומלץ של 3:1 לתמיכה בטווח ההעמסה לכיפוף של ארבע נקודות, "a" יהיה שליש מאורך טווח התמיכה.
      Equation 3(3)
    2. משוואת המאמץ בכיפוף של ארבע נקודות מוצגת להלן במשוואה 4. "c" ו- "a" מסמנים את אותן תכונות הן עבור חישובי מתח והן עבור חישובי מתח. "d" מציין את ערכי התזוזה שנרשמו על ידי הבודק המכני במהלך הבדיקות.
      Equation 4(4)
  3. חישוב תכונות גיאומטריות מסריקות μCT
    1. המשתנה "c" מייצג את המרחק מהציר הנייטרלי לפני השטח של העצם שהייתה טעונה במתח. כתוצאה מכך, לקבוע את הצנטרואיד של כל חתך בסריקות μCT מאז הציר הנייטרלי עובר דרך הצנטרואיד.
      1. אם עוקבים אחר כיוון הבדיקה של עצם הירך בכיפוף תלת נקודתי המתואר בשלב 5.2.6, יש למדוד "c" ביחס למשטח הקדמי.
      2. אם בעקבות כיוון הבדיקה של עצם השוקה המתוארת בשלב 5.2.7, יש למדוד "c" ביחס למשטח המדיאלי של העצם.
    2. המשתנה "I" מייצג את מומנט האינרציה של האזור סביב ציר הכיפוף (הציר המדיאלי-לטרלי עבור עצם הירך; הציר הקדמי-אחורי עבור שוקה). חשב ערך זה באמצעות משוואה 5. במשוואה זו, "dA" הוא השטח של כל פיקסל שנלכד בסריקת μCT ואילו y הוא המרחק המחושב של כל פיקסל מהציר הנייטרלי.
      Equation 5(5)

8. תכונות בדיקה מכניות מעניינות

  1. לפני חישוב תכונות מכניות כלשהן, צור עקומת תזוזת כוח ועקומת מאמץ (עקומות אידיאליות המוצגות להלן באיור 3, יחד עם תכונות משמעותיות).
    הערה: בדיקה של דגימות ביולוגיות לא תמיד יוצרת עקומות שנראות כמו דוגמאות אידיאליות אלה, אך הן נשארות מדריך שימושי.
  2. בחן עקומות אלה לפני הניתוח כדי לזהות טעויות בבדיקה, כגון גלגול עצם או החלקה. שגיאות אלה גורמות בדרך כלל לבליטות או לאזורים שטוחים בחלק הליניארי הראשוני של העקומה. הסר נתונים עודפים, כולל נתונים שייתכן שנאספו לפני שהבודק יצר קשר עם העצם או נתונים בעקבות כשל, בשלב זה.
  3. לאחר שהובטח לך מבחן איכות על ידי העקומות המשורטטות, התחל ניתוח של תכונות משמעותיות.
    1. נוקשות ומודולוס אלסטי
      1. חשב קשיחות באמצעות האזור האלסטי בלבד של עקומת תזוזת הכוח. שיפוע העקומה באזור זה הוא נוקשות.
      2. חשב מודולוס אלסטי באמצעות שיפוע של החלק האלסטי בלבד של עקומת המתח.
    2. נקודת תשואה
      הערה: ישנן שתי נקודות תשואה, אחת על עקום תזוזת הכוח ואחת על עקום המאמץ. הערכים (x,y) עבור נקודה זו מעקומת תזוזת הכוח ידועים כעקירה כדי להניב ולהניב כוח, בעוד שהערכים מעקומת המתח-מאמץ ידועים כמאמץ להניב ולהניב מתח. נקודות אלה מייצגות את קצה האזור האלסטי של העקומה וניתן למצוא אותן בדרכים המפורטות להלן.
      1. שיטת עקומת מאמץ-מאמץ: חישוב היסט קו מ-(0,0) ב-0.2% מאמץ (2,000 מיקרו-מתח) אך עם שיפוע זהה למודולוס האלסטי. שרטט את הקו הזה על גרף המתח-מתח; המיקום שבו קו זה מיירט את עקום המתח-מאמץ מוגדר כנקודת התשואה. השתמש בקואורדינטת מתח ומתח זו כדי למצוא את ערכי הכוח והתזוזה המקבילים; ערכים אלה ייצגו כוח תשואה ותזוזה לערכי תשואה.
      2. שיטת Secant: חישוב הנוקשות מעקומת תזוזת הכוח והפחתת הנוקשות באחוז שנבחר (5-10%). התווה קו המתחיל ב- (0,0) עם השיפוע של קשיחות מופחתת זו ואפשר לו להצטלב עם עקומת תזוזת הכוח. לנקודת ההצטלבות יהיו הקואורדינטות (עקירה כדי להניב, כוח תשואה).
        הערה: ניתן להשתמש בשיטת secant כדי למצוא את נקודת התשואה ללא נתוני מאמץ מאמץ.
    3. הכוח האולטימטיבי והלחץ האולטימטיבי
      1. חשב את הכוח האולטימטיבי ואת הלחץ האולטימטיבי על ידי מציאת הערך המרבי בערכות הנתונים המתאימות.
    4. תכונות עקירה ומאמץ
      1. עקירה לתפוקה ומאמץ להניב ערכים המייצגים את התזוזה או המאמץ לנקודת התשואה. כדי למצוא אותם, אתר את התשואה כמתואר בשלב 8.3.2.
      2. ערכי התזוזה הכוללת וערכי המאמץ הכוללים מייצגים את סך התזוזה או המאמץ הכולל שהדגימה חוותה במהלך הבדיקה ומתאימים לנקודת הכשל.
      3. תזוזה לאחר תשואה ומתח לאחר תשואה: תזוזה לאחר תשואה מדווחת בדרך כלל וניתן לחשב אותה על ידי חיסור העקירה לתשואה מהעקירה הכוללת. חשב את הזן שלאחר התשואה על ידי הפחתת המאמץ לתפוקה מהמאמץ הכולל אך דווח על כך בזהירות, שכן הזן נגזר תחילה תחת ההנחה שהחומר אלסטי ליניארי (preyield). זה הופך מדד לאחר תשואה רגיש לאי-תקפות.
    5. תכונות אנרגיה
      1. חשב אנרגיה כשטח מתחת לעקירת הכוח או עקומת המתח.
      2. האזור שמתחת לעקומת תזוזת הכוח ידוע כעבודה. השטח המחושב תחת החלק שלפני התשואה של העקום, או האזור האלסטי, ידוע כעבודה אלסטית או אנרגיה. השטח המחושב מתחת לעקום מעבר לנקודת התשואה, או אזור הפלסטיק, ידוע כעבודה שלאחר תפוקה או פלסטיק, או אנרגיה אבודה.
      3. השטח הכולל המחושב מתחת לעקומת המאמץ-מאמץ ידוע בשם קשיחות או מודולוס של קשיחות בעוד השטח המחושב תחת עקומת מאמץ מאמץ עד לנקודת התשואה ידוע בשם עמידות. קשיחות לאחר תשואה, כמו מתח לאחר תשואה, לרוב אינה מדווחת בשל ההנחות של משוואות המאמץ שתכונה זו אינה נופלת תחתיה.

Figure 3
איור 3: עקומות תזוזת כוח ומאמץ. (A) עקומת תזוזת כוח אידיאלית; (B) עקומת מאמץ אידיאלית עם הקו הנגזר משיטת הקיזוז של 0.2% המשמשת לחישוב נקודת התשואה המוצגת באדום (שימו לב שלקו זה שיפוע זהה לזה של האזור האלסטי של העקום). תכונות מפתח שניתן לקבל מעקומת כוח עקירה כוללות כוח תשואה, כוח אולטימטיבי, עקירה למניבה, עקירה מוחלטת ועבודה. תכונות ברמת הרקמה שניתן לקבל מעקומת הסטרס-מתח כוללות לחץ תשואה, לחץ אולטימטיבי, מאמץ להניב, מאמץ כולל, עמידות וקשיחות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עם השלמת סריקת CT, רוב הסריקות הלא מספקות יכולות להיתפס בשחזור. לעתים קרובות, סריקות גרועות יגרמו לפיצוי גבוה על חוסר התאמה המהווה אינדיקטור ברור לשגיאה במהלך הסריקה. עם זאת, שגיאות עלולות להתרחש בשלבים אחרים ועלולות גם להוביל לנתונים לא מדויקים. לעתים קרובות ניתן לאתר טעויות אלה כאשר בוחנים את המאפיינים האדריכליים המחושבים הבודדים. אם ערכים חורגים מהטווח של ערכים אחרים בקבוצה, יש לבחון מחדש את הסריקה, החזר ההשקעה ושיטת חישוב המאפיינים.

לאחר השלמת בדיקות הכיפוף, יש לבחון את חלקות תזוזת הכוח מכל מבחן כדי לזהות בדיקות גרועות שייתכן שיהיה צורך להסיר ממערך הנתונים. דוגמה לבדיקה בעייתית מוצגת באיור 4. העלילה באיור 4A מציגה תוצאות של בדיקת כיפוף שבוצעה כהלכה. ישנו אזור ליניארי ברור ללא בוהן בשיפוע נמוך, נקודת תשואה, נקודה אולטימטיבית (כוח מקסימלי), ירידה בכוח כאשר התזוזה נמשכת מעבר לכוח המרבי, ונקודת כשל. העקומה חלקה ללא שינויים פתאומיים בטעינה עד לאחר ההגעה לנקודה הסופית. כתוצאה מכך, מאפיינים מבדיקה זו עשויים להיות מזוהים ואמינים בקלות. העלילה המוצגת באיור 4B מראה את התוצאה של מבחן כיפוף עם מאפיינים מדאיגים מרובים. השינויים הפתאומיים בטעינה והופעת פסגות מרובות בעלילה הם אינדיקטורים עיקריים לבעיות במבחן זה. בעוד פסגות מינוריות עשויות להתרחש במבחן מתאים ליד הכוח האולטימטיבי, גודל ומספר הפסגות בתרשים זה מצביעים על כך שהעצם אולי התגלגלה במהלך המבחן. בין אם נצפו ונצפו במהלך הבדיקה ובין אם נבחנו בעת בחינת הבדיקות לפני הניתוח, יש לחקור את נתוני הדגימה במהלך הניתוח שלאחר הבדיקה. אם הנתונים אכן פגומים או רחוקים מטווח הדגימות האחרות בקבוצה, יהיה זה אידיאלי לא לכלול בדיקה זו במערך הנתונים הסופי. זו אחת הסיבות להפעלה נכונה של הניסוי בחישובי עוצמה אפריוריים . ייתכן שניתן יהיה לדווח רק על מאפיינים מסוימים ממדגם (במקרה זה, מאפייני תשואה מוקדמת עשויים להיות מקובלים), אך זה אינו אידיאלי ויש להסביר זאת בבירור כאשר מדווחים.

Figure 4
איור 4: חלקות עקירה בכוח. (A) חלקת עקירה אידיאלית בכוח. (ב) חלקת עקירה בכוח הנובעת ממבחן כיפוף לקוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

כאשר כל חלקות העקירה בכוח נבחנות והערכים מנורמלים למתח מתח, ניתן לזהות ולהציג לראווה את תכונות העניין בדרכים רבות. באיור 5 מוצגות חלקות עקירה של כוח ומאמץ מאמץ עבור מחקר שלם. אלה הם ייצוגים סכמטיים לפיהם הכוח והתזוזה בנקודת ההתחלה (0,0), התשואה, הנקודה הסופית והכישלון עבור כל עצם נקבעים ולאחר מכן, הכוח/מתח והתזוזה/מאמץ ממוצעים כדי לספק תרשים ממוצע לכל קבוצה. החלקות אינן משמשות לניתוח סטטיסטי, אך ניתן להשתמש בהן כדי להראות כיצד ההתנהגות הכוללת משתנה עקב גורמים כגון טיפול או מצב מחלה. התרשימים שמוצגים באיור 5 לקוחים ממחקר שהשווה עכברי ביקורת לעכברי ביקורת עם מצב של סוכרת מסוג 2 ומחלת כליות כרונית (T2D-CKD). השוקה הימנית של בעלי חיים אלה נבדקה לכישלון באמצעות כיפוף ארבע נקודות ונותחה כדי להשיג את התכונות שנדונו בסעיף 8 לפרוטוקול. מאיור 5 ברור שלקבוצת T2D-CKD היו תכונות מכניות מופחתות, כולל חוזק ונוקשות, הן ברמת המבנה והן ברמת הרקמה. נראה כי לעכברים אלה יש גם תכונות מופחתות לאחר התשואה, אינדיקטור לשבירות. אין להשתמש בחלקות אלה כדי להסיק מסקנות חד-משמעיות ממחקר. במקום זאת, הם פועלים כייצוג חזותי ויש לאמת אותם על ידי ביצוע ניתוח סטטיסטי על כל המאפיינים המעניינים.

Figure 5
איור 5: חלקות עקירה בכוח ומתח עבור מחקר שלם. (A) חלקת עקירה בכוח עבור חיות ביקורת ובעלי חיים הנגרמים מסוכרת מסוג 2 ומחלות כליות כרוניות. תרשים זה נבע מממוצע של כוח היבול, העקירה למניבה, הכוח האולטימטיבי, העקירה הסופית, כוח הכשל והעקירה הכוללת של כל קבוצה והתוויית אמצעים אלה יחד עם סטיית תקן. (B) מתח עבור חיות ביקורת וחיות T2D-CKD. תרשים זה נבע מממוצע מתח התשואה, מאמץ לתשואה, מתח אולטימטיבי, מתח אולטימטיבי, מתח כישלון ומתח כולל והתוויית האמצעים המתקבלים יחד עם סטיית תקן. קיצור: T2D-CKD = סוכרת מסוג 2 ובעלי חיים הנגרמים ממחלת כליות כרונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הנתונים המכניים והתוצאות של מבחן t דו-זנבי מוצגים בטבלה I. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן. בחינה כללית מצביעה על נתונים בטווחים מתאימים ועם רמות שונות צפויות. שים לב שמאפיינים לאחר תשואה נוטים להיות בעלי השונות הגדולה ביותר ולכן לעתים קרובות דורשים את גדלי המדגם הגדולים ביותר כדי לזהות הבדלים משמעותיים. כפי שהציעו העקומות הסכמטיות באיור 5, יש ירידות משמעותיות כמעט בכל התכונות המכניות המבניות וברמת הרקמות. מנתונים אלה ניתן להסיק כי מצב המחלה המושרה הוביל לעצמות חלשות יותר, נוקשות פחות ורגישות יותר לשברים עקב אובדן עיוות וקשיחות מופחתת. מחקרים עם השוואות מורכבות יותר עשויים להיות לא פשוטים לפרשנות. דוגמה לכך עשויה להיות אם נצפים שיפורים משמעותיים בתכונות מכניות ברמת המבנים, אך לא בתכונות מכניות ברמת הרקמה. במקרה זה, ההשפעות שנצפו מונעות ככל הנראה על ידי שינויים בארכיטקטורה של העצם (למשל, שטח מוגבר, עובי קליפת המוח מוגברת) ולא שיפורים באיכות העצם ברמת הרקמה. לדוגמה, שטח העצם גדל עקב רווח של עצם ארוגה, אך איכות הרקמה ירדה מכיוון שעצם ארוגה לא מאורגנת נמצאת כעת במקום עצם למלרית מאורגנת. זה יכול להיות נתמך על ידי ניתוח μCT שבו ניתן לראות שיפורים מובהקים סטטיסטית בארכיטקטורה. לעומת זאת, ייתכנו שיפורים משמעותיים בתכונות מכניות ברמת הרקמה עם שיפורים מינימליים/ללא שיפורים בתכונות מכניות ברמה המבנית. איכות רקמה גבוהה זו יכולה להסוות את המלכודות של עצמות קטנות יותר. פרשנות הנתונים עשויה להיות מפותלת עוד יותר אם נצפים שינויים בנכסים לפני התשואה אך לא בנכסים שלאחר התשואה או להיפך. במקרה הראשון, שינוי ביכולתה של העצם להתנגד לעיוות עשוי להשתפר בעוד יכולתה לסבול נזק לא. בכל אחד מהמקרים הללו, היכולת להתייחס לתכונות אדריכליות מניתוח μCT מועילה מאוד ויש להשתמש בה (אם כי תיאור שיטה זו חורג מהיקף מאמר זה). בשל מורכבות הפרשנות של תכונות אלה, הצגת כל התכונות בצורת טבלה או איור (לא רק את התכונות שנוטות להיות הקלות ביותר לפירוש כגון הכוח האולטימטיבי, או המספרות את הסיפור שמחפשים לספר) מאפשרת ייצוג מלא יותר של ההשפעות המכניות.

לשלוט T2D-CKD ערך P
כוח תשואה (N) 19.7 ± 2.9 19.5 ± 2.6 0.0032**
הכוח האולטימטיבי (N) 36.7 ± 3 18.3 ± 3.4 0.0031**
עקירה לתשואה (מיקרומטר) 205 ± 17 190 ± 21 0.1039
עקירה לאחר תפוקה (מיקרומטר) 246 ± 235 60 ± 51 0.0435*
סה"כ Displacment (מיקרומטר) 451 ± 230 249 ± 53 0.0278*
נוקשות (N/mm) 110 ± 10 91 ± 13 0.0037**
עבודה לתפוקה (mJ) 2.16 ± 0.45 1.54 ± 0.36 0.0055**
עבודה לאחר תשואה (mJ) 4.24 ± 3.01 1.04 ± 0.9 0.0109*
סה"כ עבודה (mJ) 6.4 ± 2.88 2.58 ± 0.97 0.0025**
לחץ תשואה (MPa) 180 ± 20 157 ± 25 0.0504
מתח אולטימטיבי (MPa) 209 ± 26 181 ± 27 0.0434*
מאמץ לתנובה (mɛ) 19.9 ± 2 16.4 ± 1.5 0.5771
סה"כ מתח (mɛ) 58.9 ± 17.2 34.6 ± 4.3 0.0277*
מודולוס (GPa) 19.6 ± 1.1 17.6 ± 1.1 0.0171*
חוסן (MPa) 1.62 ± 0.33 1.38 ± 0.33 0.1377
קשיחות (MPa) 4.85 ± 2.29 2.26 ± 0.73 0.0076**

טבלה 1: תוצאות בדיקות מכניות וניתוח סטטיסטי. ערכים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן. ערכי P נובעים ממבחן t לא מזווג דו-זנבי. * P < 0.05 ו- ** P < 0.01. קיצור: T2D-CKD = סוכרת מסוג 2 ובעלי חיים הנגרמים ממחלת כליות כרונית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לאורך כל תהליך הסריקה והבדיקה, ישנם רגעים שבהם פתרון בעיות ואופטימיזציה מתאימים. הראשון שבהם מתרחש בעת סריקת עצמות באמצעות μCT. בעוד שמערכות רבות מגיעות עם מחזיק שבו ניתן להחזיק ולסרוק חפץ אחד, ניתן לייצר מחזיקים מותאמים אישית כדי לסרוק מספר עצמות בו זמנית. סריקת עצמות מרובות יכולה להיות נקודה מצוינת לאופטימיזציה, אך יש לנקוט משנה זהירות לאורך כל תהליך הסריקה והניתוח כדי להבטיח שהממצאים אינם נגרמים. כאשר קרני רנטגן עוברות (והן מוחלשות) על ידי כמויות משתנות של רקמת עצם בכל תוספת זוויתית, זה יכול להוביל לחוסר דיוק בנתונים המתקבלים.

נקודה שנייה לפתרון בעיות מתרחשת בשחזור של סריקות. בהתאם לתוכנית שבה נעשה שימוש, המשתמש עשוי להגדיר את חלון הצפיפות לשחזור, המחושב מערכי מקדם ההנחתה של הסריקה. זהו מקדם ליניארי המשמש לייצוג עד כמה קרן הרנטגן מוחלשת על ידי אובייקט5. תוכניות מסוימות מקבלות צפיפויות אלה וממירות אותן לערכי גווני אפור הנעים בין 0 ל- 255 בהיסטוגרמה. שני ערכים יוצגו בהיסטוגרמה וידועים כגבולות ניגודיות10, אשר חייבים להיות מוגדרים כראוי כדי לאפשר זיהוי של עצם לעומת ווקסלים שאינם עצם. הערך הנמוך יותר יוגדר בדרך כלל לערך בקנה מידה אפור של אפס ואילו את ערך הניגודיות הגבוה יותר מומלץ להגדיר ל- 10-20% מההנחתה המרבית של חומר העניין (עצם)10. שגיאות עלולות להתרחש בניתוח אם ערך זה אינו מוגדר כראוי מכיוון שניתן לחתוך חלקים מהנתונים. כתוצאה מכך, יש להתאים ערך זה בהתאם למדגם שנסרק. השיטה המומלצת היא להציג את ההיסטוגרמה בקנה מידה לוגריתמי ולבחור את הגבול העליון כמספר הגדול מעט מקצה הזנב הלוגריתמי כדי להבטיח שכל נתוני העצם כלולים10.

נקודות נוספות לפתרון בעיות מתרחשות במהלך בדיקה וניתוח מכניים. במהלך בדיקה וצפייה בעקומות תזוזת כוח לאחר הבדיקה, ניתן לאתר דגימות שהתגלגלו ויש להסיר אותן ממערך הנתונים כפי שנדון בתוצאות המייצגות. יתר על כן, יש לנקוט משנה זהירות לגבי כיוון העצם שכן ישנן הנחות המסדירות את צורת העצם הנבדקת. כאשר משתמשים במשוואות כיפוף אוילר-ברנולי לחישוב מתח ומתח, מניחים שלמדגם יש חתך אחיד לאורכו3. בהתחשב בכך שלרוב העצמות אין חתך רוחב אחיד, עדיף לבחור את האזור האחיד ביותר של העצם לבדיקה (לאורך כל טווח התמיכה לכיפוף של שלוש נקודות או בין נקודות ההעמסה לכיפוף של ארבע נקודות).

בירך עדיפה בדיקה בכיפוף תלת נקודתי בפיר האמצע. בגלל העקמומיות העדינה של העצם, יש לבדוק בכיוון העקמומיות כדי למנוע אבזם מקומי של פני השטח (כלומר, בדיקת עצם הירך עם המשטח הקדמי במתח). לטיביה יש צורת חתך משתנה יותר, כך שהאזור האידיאלי לבדיקה מתחיל רק פרוקסימלי לצומת השוקה והפיבולה. אם העצם ממוקמת עם המשטח המדיאלי במתח, אזור העצם הנבדק הוא שטוח ויש לו את השונות הקטנה ביותר ברדיוס וברגע האינרציה בכיוון הכיפוף. יש להיזהר גם בפרשנות תוצאות מבחני הכיפוף בשל ההנחה שהחומר איזוטרופי, הומוגני ואלסטי ליניארי – כל אחת מההנחות הללו מופרת במידה מסוימת כאשר בוחנים עצם3. חוסר היכולת של העצם להתאים להנחות אלה מוביל לתוצאות ממבחני כיפוף שיש לפרש בזהירות. התכונות שיש לפרש בזהירות הרבה ביותר הן אלה הנגזרות מעקום המתח-מאמץ מעבר לנקודת התשואה, שכן בהגדרה, תשואה חולפת מפרה את ההנחה האלסטית הליניארית. בעוד נורמליזציה לצורת העצם עשויה להיעשות, לא מומלץ לנסות לנרמל את משקל הגוף של בעלי חיים, אלא אם כן יש הבדלים גסים בין קבוצות. במקרה זה, ניתוח של שונות משותפת עשוי להתבצע כדי לפצות על הבדלים אלה, אך יש להימנע מנורמליזציה כללית למשקל הגוף ברוב המקרים.

למרות בעיות פתרון הבעיות שעלולות להתרחש במהלך תהליך זה, בדיקות כיפוף מניבות תכונות מכניות שיכולות לתאר את רגישות העצם לשבר. בדיקות אלה גם פשוטות יחסית ומהירות לביצוע. למרות שערכים מוחלטים מבדיקות אלה לא תמיד תקפים לחלוטין, היכולת לזהות הבדלים יחסיים בין קבוצות יכולה להיות מדויקת למדי עבור דגימות בגדלים וצורות שונות. התכונות המכניות המתקבלות מספקות רלוונטיות תפקודית במחקרים שבהם ניתן לצפות להבדלים בעצם. למרות שבדיקות כשל מונוטוני הן הבדיקה המכנית הנפוצה והנגישה ביותר, שיטות אחרות כולל חיי עייפות וקשיחות שבר עשויות לחשוף תכונות מכניות נוספות המעניינות וניתן לשקול אותן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgments

העבודה שנעשתה לפיתוח פרוטוקול זה נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות [AR072609].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CTAn Bruker NA CT Scan Analysis Software
DataViewer Bruker NA CT Scan Rotation Software
Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a MathWorks NA Coding platform used for data analysis
NRecon Bruker NA CT Scan Reconstruction software
SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software   Micro Photonics Inc SKY-016814 Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vesper, E. O., Hammond, M. A., Allen, M. R., Wallace, J. M. Even with rehydration, preservation in ethanol influences the mechanical properties of bone and how bone responds to experimental manipulation. Bone. 97, 49-53 (2017).
  2. Jepsen, K. J., Silva, M. J., Vashishth, D., Guo, X. E., van der Meulen, M. C. Establishing biomechanical mechanisms in mouse models: practical guidelines for systematically evaluating phenotypic changes in the diaphyses of long bones. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (6), 951-966 (2015).
  3. Basic and Applied Bone Biology. Eds Burr, D. B., Allen, M. R. , Elsevier/Academic Press, London. (2019).
  4. microCT SkyScan 1272 User Manual. , Konitch, Belgium. https://research.rutgers.edu/sites/default/files/2022-02/1272_UserManual_v1_2.pdf (2018).
  5. Kim, Y., Brodt, M. D., Tang, S. Y., Silva, M. J. MicroCT for scanning and analysis of mouse bones. Methods in Molecular Biology. 2230, 169-198 (2021).
  6. Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
  7. Micro-CT specimen scanner, Centre for high-throughput phenogenomics. , https://chtp.ubc.ca/equipment/x-ray-imaging/micro-ct-specimen-scanner (2023).
  8. ASTM International. Standard test method for flexural properties of unreinforced and reinforced plastics and electrical insulating materials by four-point bending. , https://www.astm.org/d6272-17e01.html (2020).
  9. ASTM International. Standard test methods for flexural properties of unreinforced and reinforced plastics and electrical insulating materials. , https://www.astm.org/d0790-17.html (2017).
  10. Bruker microCT NRecon: An overview. , Konitch, Belgium. https://www.yumpu.com/en/document/read/8764648/nrecon-user-manual-skyscan (2023).

Tags

שיקולים מעשיים תכנון ביצוע פרשנות מחקרים בדיקות כיפוף עצם שלמה עצמות מכרסמים שבריריות השלד שבר משבר בריאות הציבור האמריקאי מחלת עצם תגובה לטיפול בדיקות מכניות רגישות עצם לשבר הנחות שולטות שלבי מפתח שימוש לרעה בשיטות פרשנות שגויה של תוצאות פרוטוקול עקרונות גודל דגימה קצירת רקמות אחסון ניתוח נתונים מחקר אקדמי פתרונות קליניים
שיקולים מעשיים לתכנון, ביצוע ופרשנות של מחקרים הכוללים בדיקות כיפוף עצם שלמות של עצמות מכרסמים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Reul, O. N., Anneken, A. M., Kohler, … More

Reul, O. N., Anneken, A. M., Kohler, R. K., Segvich, D. M., Wallace, J. M. Practical Considerations for the Design, Execution, and Interpretation of Studies Involving Whole-Bone Bending Tests of Rodent Bones. J. Vis. Exp. (199), e65616, doi:10.3791/65616 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter