Summary
Mikroglia, morfolojik ve fonksiyonel adaptasyon yeteneğine sahip, vücuttaki en çok yönlü hücrelerden biri olarak kabul edilir. Heterojenlikleri ve çok işlevlilikleri, beyin homeostazının korunmasını sağlarken, aynı zamanda çeşitli nörolojik patolojilerle de bağlantılıdır. Burada, omurilik mikrogliasını saflaştırmak için bir teknik açıklanmaktadır.
Abstract
Vertebral kolon bir omurgalıyı tanımlar ve omuriliği çevreleyen ve koruyan bir boşluk olan omurilik kanalını şekillendirir. Memeli merkezi sinir sisteminin uygun gelişimi ve işlevi, önemli ölçüde mikroglia olarak bilinen yerleşik makrofajların aktivitesine dayanır. Mikroglia, omurilik ve beyinde farklı gen ekspresyonu ve davranışı sağlayan heterojenlik ve çok işlevlilik gösterir. Çok sayıda çalışma, saflaştırma yöntemlerini kapsamlı bir şekilde detaylandıran serebral mikroglia fonksiyonunu araştırmıştır. Bununla birlikte, farelerde mikroglia'nın omurilikten saflaştırılması kapsamlı bir açıklamadan yoksundur. Buna karşılık, rafine edilmemiş bir ekstraktın aksine, yüksek oranda saflaştırılmış bir kollajenazın kullanılması, merkezi sinir sistemi dokularında raporlamadan yoksundur. Bu çalışmada, 8-10 haftalık C57BL/6 farelerinden vertebral kolon ve omurilik eksize edildi. Sonraki sindirim, yüksek oranda saflaştırılmış bir kollajenaz kullandı ve mikroglia saflaştırması, bir yoğunluk gradyanı kullandı. Hücreler, CD11b ve CD45 boyama yoluyla canlılık ve saflığı değerlendiren akış sitometrisi için boyandı. Sonuçlar ortalama %80 canlılık ve ortalama %95 saflık verdi. Sonuç olarak, fare mikrogliasının manipülasyonu, yüksek oranda saflaştırılmış bir kollajenaz ve ardından bir yoğunluk gradyanı ile sindirimi içeriyordu. Bu yaklaşım, önemli miktarda omurilik mikroglia popülasyonunu etkili bir şekilde üretti.
Introduction
Omurgalıların tanımlayıcı özelliği, notokordun yerini, omurlar arası disklere bölünmüş, omur adı verilen bir dizi parçalı kemik ile değiştirdiği vertebral kolon veya omurgadır. Bu kemik materyalinin art arda gelmesi, omuriliği çevreleyen ve koruyan bir boşluk olan omurilikkanalını şekillendirir 1. Rodentia cinsinde, omurga genellikle yedi servikal omur, on üç torasik omur, altı lomber omur ve değişken sayıda kaudal vertebradanoluşur 2,3. Omuriliğin uzunluğu omurganınkine benzer ve terminal filum, omuriliği sakruma bağlayan sinirsel olmayan bir yapıdır. Ek olarak, sinir lifleri intervertebral foramen1'den çıkar.
Memelilerde merkezi sinir sisteminin gelişimi ve düzgün işlevi, kritik olarak sinir sisteminin mikroglia4 adı verilen yerleşik makrofajlarının aktivitesine bağlıdır. Mikroglia başlangıçta beyinde yerleşik fagositler olarak tanımlansa da, son araştırmalar bu hücrelere birçok dinamik fonksiyon atfetmiştir 5,6. Mikroglia'nın boyutu homeostazda 7 ila 10 μm arasında değişir; Vücuttaki en çok yönlü hücreler arasında kabul edilirler ve sürekli değişen çevrelerine morfolojik ve işlevsel olarak uyum sağlayabilirler7. Bu hücreler hem embriyonik hem de yetişkin aşamalarda yüksek heterojenlik sergilerler8,9, yetişkin aşamasında ise uzay-zamansal bağlamlarına göre karmaşık fonksiyonel heterojenlik sergilerler10. Mikroglia'nın heterojenliği ve çoklu işlevleri, omurilik ve beyinde diferansiyel gen ekspresyonu ve davranışına izin verir. Omurilikte CD11b, CD45, CD86 ve CCR9 ekspresyonunun beyne göre daha yüksek olduğu gösterilmiştir 8,9.
Serebral mikroglia izolasyonu için çoklu protokoller mevcuttur11,12; Bununla birlikte, omurilik mikroglia13,14 için sadece birkaçı mevcuttur. Mikroglia'yı omurilikten arındırmak için bir yöntemin optimize edilmesi, mikroglia fizyolojisini keşfetmeye odaklanan çok sayıda çalışmanın geliştirilmesini kolaylaştırır. Bu protokol, fare omuriliğinin basit ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir ekstraksiyonunu ve mikroglia'nın saflaştırılmasını tanımlamayı amaçlamaktadır (Şekil 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışma, resmi Meksika standardı NOM-062-ZOO-1999'a ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımına ilişkin kılavuza uygun olarak yürütülmüştür. Çalışma için onay, Meksika Çocuk Hastanesi Araştırma, Etik ve Biyogüvenlik Komitelerinden (HIM/2023/006) ve Meksika Eduardo Liceaga Genel Hastanesi Araştırma ve Biyoetik Komitesinden (DI/21/501/04/62) alınmıştır. Yaşları 6 ila 8 hafta arasında değişen üç C57BL/6 faresi, kurumsal hayvan bakımı ve kullanım yönergelerine uygun olarak havalandırmalı raflarda izole koşullar altında yetiştirildikleri Meksika Çocuk Hastanesi'nden elde edildi.
1. Malzemelerin ve reaktiflerin hazırlanması
- Ca 2+ ve Mg2+ içermeyen PBS'nin yanı sıra Hank'in dengeli tuz çözeltisini (HBSS) 37 °C'ye kadar önceden ısıtın.
- HBSS çözeltisini 100 μg / mL Liferaz ve 4 μg / mL DNaz (HBSS-LD) ile destekleyin. Çözeltinin fizyolojik pH'ını 7.4 olduğundan emin olun.
NOT: Omurilik başına 1 mL çalışma solüsyonu gerekli olacaktır. - Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme için izotonik %90'lık bir çözelti hazırlayın (ticari olarak temin edilebilir, Malzeme Tablosuna bakın) ve 37 °C'ye ısıtın.
- % 5 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumunu (FBS) PBS ile birleştirerek boyama tamponunu hazırlayın ve karışımı buz üzerinde saklayın.
- Dulbecco'nun Modifiye Eagle'ın Orta-yüksek glikozunu (1 g / L) (DMEM) 37 ° C'ye önceden ısıtın.
- DMEM-S'yi hazırlamak için DMEM ortamını %10 FBS, 2 mM L-glutamin, 200 U/mL penisilin, 200 μg/mL streptomisin ve 500 pg/mL amfoterisin B ile destekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
2. Omuriliğin diseksiyonu ve hazırlanması
- Fareyi 150 mg / kg'lık bir dozda intraperitoneal aşırı dozda pentobarbital ile ötenazi yapın. Farenin göğsünü ve sırtını %70 etanol kullanarak sterilize edin.
NOT: Fare diseksiyonuna devam etmeden önce ötenazinin başarılı olduğunu onaylayın. - Torakolomber bölgeyi tıraş edin ve ekstremiteleri yapışkan bant kullanarak diseksiyon tahtasına sabitleyin.
- Bir neşter kullanarak, oksipitalden sakral bölgeye dorsal orta hat boyunca dikkatli bir kesi yapın (Şekil 2).
- Stereoskopik cerrahi mikroskop yardımıyla, lomber omurgaya ulaşana ve son kostal kemeri belirleyene kadar katmanlar halinde inceleyin.
NOT: 13 kostal kemer torasik omurlarda eklemlidir; diseke edildiklerinde, L1 omuru2'den daha üstün görünür hale gelirler. - Son servikal vertebrayı ve sakrumu belirleyin, ardından omurgayı ayırmak için bir kesi yapın (Şekil 2).
- Diseksiyon forsepslerini kullanarak, omuriliği çıkarmak için omurların dorsal laminektomisini gerçekleştirin (Şekil 3A-D).
NOT: İlk iki servikal omur (atlas ve axis) hariç, tüm hareketli omurlar çeşitli bölgelerde (servikal, torasik veya lomber) ortak bir morfolojik tasarımı paylaşır. Her tipik hareketli omurun ön ucunda silindirik bir omur gövdesi bulunur. Vücudun arkasına tutturulmuş, vertebral ark (nöral ark) olarak bilinen, lamina ve dikenli süreçlerden oluşan kemikli bir kemerdir. Bu yapılar arasında vertebral foramenbulunur 15. - Periferik sinir sistemini oluşturan ve infiltre makrofajlar içerebilen foramina (dorsal ve ventral kökler) yoluyla çıkan sinirleri çıkarın (Şekil 3D).
NOT: Yoğunluk gradyan ortamı kirletici astrositleri etkili bir şekilde ortadan kaldırdığı için pia mater veya meninkslerin çıkarılması gereksizdir. Ek olarak, meninkslerin tutulması saflaştırma süresini azaltır ve canlılığı artırır.
3. Doku sindirimi ve mikroglia izolasyonu
- Omuriliği diseksiyon tahtasına yerleştirin ve Vannas makası kullanarak omuriliği 2 mm'lik parçalar halinde kesin ve ortalama 10 parça elde edin.
- Omuriliğin bölümlerini 2 mL düz tabanlı bir mikrotüpe aktarın (Şekil 3E, F).
- 1 mL HBSS-LD çalışma solüsyonu ekleyin (adım 1.2). 37 °C'de 25 dakika inkübe edin, her 5 dakikada bir kuvvetlice girdap yapın.
- Her sindirimin içeriğini 40 μm'lik bir süzgeçten geçirin ve ardından sindirimi nötralize etmek için% 2 FBS ile 7 mL HBSS ekleyin.
- Kalan dokuyu 1 mL'lik bir şırınga pistonu kullanarak ezin. Süspansiyonu 50 mL'lik konik bir tüpte 5 x g, 220 °C'de 4 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı 1 mL'lik bir mikropipet kullanarak atın ve peleti 15 mL'lik bir konik tüpte% 2 FBS ile 2 mL HBSS'de yeniden süspanse edin. 2 mL% 90 izotonik yoğunluk gradyan ortamı ile birleştirin. 160 x g, 18 °C'de 25 dakika santrifüjleyin.
NOT: Yavaş hızlanmayı kullanın ve freni kullanmaktan kaçının. - Arayüzü almak ve 15 mL'lik konik bir tüpe aktarmak için bir transfer pipeti kullanın. Hücreleri 10 mL PBS ile yıkayın ve 220 x g, 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
- DMEM-S'deki hücreleri yeniden süspanse edin (adım 1.6) ve buz üzerinde saklayın.
4. Saflığın/canlılığın belirlenmesi
- Bir hemositometre odası kullanarak canlı hücreleri ölçmek için,% 0.4 Tripan mavisi lekesi kullanın (bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Ortalama olarak, tek bir fare 4-6 milyon hücre sağlar. - Canlı hücreleri bir akış sitometresi aracılığıyla ölçmek için, ticari olarak temin edilebilen amin-reaktif floresan boya boyası kullanın (bkz.
- 1 milyon hücreyi 5 mL'lik polistiren yuvarlak tabanlı (FACS) bir tüpe aktarın. Floresan boyayı PBS ile 1:1000 oranında seyreltin (canlılık çalışma solüsyonunu oluşturur).
- Numuneleri canlılık çözeltisi ile karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin. Hücreleri buz gibi PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri 400 μL boyama tamponunda yeniden süspanse edin (adım 1.4).
- Hücreleri 2.4G2 anti-FcRIII/I ile bloke edin (Malzeme Tablosuna bakınız) buz gibi soğuk boyama tamponunda 4 ° C'de 15 dakika boyunca.
- Floresan etiketli monoklonal antikorlar CD45-PerCP ve CD11b-eFluor 450'yi boyama tamponuna (1:300 seyreltmede) ekleyerek antikor boyama kokteylini formüle edin (bkz.
NOT: Her iki teknik de mevcut olsa da, sonraki protokole en uygun olanı seçin. - Numuneleri antikor boyama kokteyli ile karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin. Hücreleri buz gibi soğuk boyama tamponu ile iki kez yıkayın. Hücreleri 400 μL boyama tamponunda yeniden süspanse edin.
- Adım 6'daki geçit stratejisinde belirtildiği gibi bir akış sitometresinde 250.000 olay elde edin (Şekil 4).
5. İmmünofloresan boyama
- Ön işlemden geçirilmiş bir lamel 6 oyuklu bir plakanın kuyusuna yerleştirin.
NOT: Lamelleri tedavi etmek için, bunları 500 μL L-polilisin (0.01 mg/mL, Malzeme Tablosuna bakınız) çözeltisi içeren bir Petri kabına koyun ve 1 saat inkübe edin. Daha sonra üç kez damıtılmış suyla yıkayın ve kurumasını bekleyin. - 500 μL DMEM-S çözeltisi kullanarak 200.000 hücreyi işlenmiş lamel üzerine tohumlayın. 24 saat inkübe edin.
- Lamelleri çıkarın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 3.7 paraformaldehit (PFA) kullanarak hücreleri sabitleyin. Lamelleri buz gibi PBS ile üç kez yıkayın.
- Hücreleri% 0.2 Triton X-100 ile PBS'de oda sıcaklığında 15 dakika geçirgenleştirin. Daha sonra, lamelleri soğuk PBS ile üç kez yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS'de% 0.2 BSA ile bloke edin.
- Floresan etiketli monoklonal antikorları (1:300 seyreltmede, Malzeme Tablosuna bakınız) bloke edici çözelti içinde seyreltin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Lamelleri buz gibi PBS ile üç kez yıkayın.
- Kızağa DAPI içeren montaj ortamı uygulayın ve ardından bir lamel ile kapatın.
NOT: Slaytlar bir floresan veya konfokal mikroskop kullanılarak hemen analiz edilebilir veya -20°C'de 3 aya kadar saklanabilir.
6. Omurilik mikrogliası için geçit stratejisi
- Bir nokta grafiği oluşturun ve canlılık boyamaya ve boş bir floresan kanalına dayalı olarak canlı hücreleri izole etmek için bir kapı oluşturun16. Canlı olmayan hücreleri hariç tutun.
- Enkazı ortadan kaldırmak için ileri ve yan saçılma parametrelerini kullanarak başka bir çizim oluşturun16.
- Ek bir nokta grafiği geliştirin ve mikroglia'yı ayırt etmek için CD11b ve CD45'in ekspresyonunu analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fare omurilik dokusu kullanılarak, kollajenaz ve termolizin ile yüksek oranda zenginleştirilmiş bir karışım kullanılarak enzimatik sindirim gerçekleştirildi. Elde edilen sindirilmiş doku, sindirilmemiş materyali ortadan kaldırmak için 40 μm'lik bir filtreden geçirildi. Toplanan hücreler, alt kısımda %90 ve üst kısımda %45 olmak üzere bir Percoll yoğunluk gradyanı ile zenginleştirildi. Arayüz içindeki mikroglia ile zenginleştirilmiş hücreler daha sonra CD45 ve CD11b antikorları ile boyandı ve akış sitometrik analizine tabi tutuldu (Şekil 1).
Oksipital bölgeden sakruma uzanan vertebral kolonun diseksiyonu, paravertebral kas sisteminin açığa çıkmasını ve diseksiyonunu içerir. Vertebral kolonu serbest bırakmak için kostal arklar açığa çıkarıldı ve ölçümleri T13'ten T1'e kadar yapıldı. Kafatası ve sakrum ile eklemlenen vertebral kolon görünür hale geldi ve onu tamamen serbest bırakmak için her iki tarafta bir kesik yapıldı (Şekil 2).
Omuriliğin çıkarılması, vertebral gövdelere lateral bir kesi ile sağlandı ve bir kanal oluşturuldu. Omuriliğin çıkarılması sırasında, periferik makrofajlardan kontaminasyonu önlemek için periferik sinirler kesildi. Daha sonra elde edilen omurilik diseksiyon masasına yayıldı ve 2 mm'lik parçalara bölünerek sindirim solüsyonuna ilave edildi (Şekil 3). Omurilik sindirimi için liferaz kullanımı ilk kez rapor edildi ve yetişkin fare başına 4 ila 6 milyon yüksek oranda canlı mikroglial hücre verdi. Bu işlemle elde edilen optimum canlılık %80 ile %99 arasında değişmektedir.
Saflaştırma işlemini doğrulamak için, CD45 ve CD11b antikorları kullanılarak mikroglianın FACS boyaması gerçekleştirildi. Saflaştırma işlemi, %99'a kadar mikroglial hücreler vererek verimlilik göstermiştir (Şekil 4). Ayrıca, aynı antikorlar kullanılarak elde edilen mikroglia üzerinde immünofloresan boyama yapıldı ve ortalama 10 μm büyüklüğünde çift pozitif hücreler gözlemlendi - bildirilen aktive edilmemiş mikroglia boyutuyla tutarlı. Bu, bu hücrelerin aktivasyon çalışmaları için uygun olduğunu göstermektedir (Şekil 4E). Enflamatuar süreçler sırasında diğer bağışıklık hücrelerinin mevcut olabileceği veya mikroglia'nın farklı uyaranlar altında morfolojik değişikliklere uğrayabileceği akla yatkındır. Bu gibi durumlarda, her hücre popülasyonunun tanımlanması için spesifik belirteçlerin dahil edilmesi önerilir.
Şekil 1: Omurilik mikroglia saflaştırma protokolüne şematik genel bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Omurilik diseksiyonu prosedürü. Ötenazinin ardından, farenin omurgası izole edildi ve diseke edildi. (A) Oksipitalden kaudal bölgelere uzanan ve para-vertebral kas sistemini ortaya çıkaran kademeli cilt diseksiyonu. (B) Paravertebral kasların katmanları boyunca sıralı diseksiyon. (C) Kaburga kesimini takiben omurganın çıkarılması. (D) Vertebral kanal içinde sağlam bir omuriliğin görselleştirilmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Omurilik ekstraksiyonu ve sindirim süreci . (A) Yaklaşık 2 mm'lik iki kesi içeren sıralı spinal laminektomi. (B) Açıkta kalan omurilik. (C) Omuriliğin çıkarılması. (D) Periferik sinir kesiti. (E) Omurilik 2 mm'lik bölümlere ayrıldı ve sindirim ortamına yerleştirildi. (F) Doku sindirimi için standart 37 °C inkübasyon. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Hücre saflığının ve canlılığının değerlendirilmesi. Mikrogliaya özgü belirteçler kullanılarak saflaştırılmış hücrelerin immün boyama. (A) Canlı hücrelerin tanımlanması (floresan boya negatif hücreler). (B) Hücre boyutuna dayalı seçim. (C) CD45low ve CD11b + hücreleri,% 99'u aşan saflık gösterir. (D) Ortalama canlılık (87.46 ± SD 1.468) ve ortalama saflık (88.51 ± SD 3.948; n = 5). (E) Saflaştırılmış hücrelerde CD45 + ve CD11b + boyamasını gösteren immünofloresan. Görüntüler, 60x büyütmede (ölçek çubuğu = 5 μm) beyaz ışık lazerli konfokal mikroskop kullanılarak yakalandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beyin homeostazındaki önemi nedeniyle mikroglia çalışması için çok sayıda protokol geliştirilmiştir. Bu yöntemlerde, mikroglia tipik olarak embriyonik veya yenidoğan sıçanların ve farelerin serebral hemisferlerindenkaynaklanır 17. Sınırlı sayıda çalışma, yetişkin farelerin omuriliklerinden mikroglia'nın saflaştırılmasını ele almıştır13,14. Bu teknikler, genellikle Percoll veya OptiPrep kullanılarak gradyan ayırma ile birleştirilen DNAse ile birlikte kollajenaz ve/veya papain kullanılarak enzimatik sindirimi içerir. Bununla birlikte, gradyan ayrımı olmadan papain bazlı omurilik sindiriminin kullanılması, pia materin çıkarılmasından sonra bile astrosit kontaminasyonuna yol açabilir14,17.
Bu çalışma, yetişkin fare omuriliğinden mikroglia'nın saflaştırılması için bir protokol sunmaktadır. Protokol, kontrollü bozunma18 ile çeşitli dokuları verimli bir şekilde sindirmek için bilinen bir kombinasyon olan termolizin ile birlikte kollajenaz I ve II'nin hassas bir karışımını kullanır, böylece düşük nötr proteaz içeriği nedeniyle apoptozu azaltır. Genellikle astrosit kontaminasyonu kaynakları olan meninksler veya pia mater, bu prosedürde bir Percoll gradyanı kullanılarak ortadan kaldırılabilir ve bu katmanların çıkarılması gerekliliğini ortadan kaldırır (Şekil 1).
Mikroglial heterojenlik, omurilik ve beyindeki farklı morfolojilerden kaynaklanır8. Bununla birlikte, bu protokol benzer sonuçlara sahip serebral hemisferlere de uygulandı (veriler sunulmadı), hem omurilik hem de serebral mikroglia'yı analiz etmek için sağlamlığını vurguladı.
Bu protokol ile yüksek saflık (%80 ila %99 arasında) ve canlılık (%85 ila %98) seviyeleri tutarlı bir şekilde elde edilebilir. Sinir sisteminden hücrelerin işlenmesi karmaşıktır, çünkü hücre canlılığı işlem süresinden önemli ölçüde etkilenir; 20 dakikayı aşan hipoksi öldürücü olabilir. Optimum canlılık için, omurilik ekstraksiyonundan sindirime kadar işlem süresinin 10 dakikadan fazla olmayacak şekilde sınırlandırılması önerilir. Bu tanım, 8 ila 10 haftalık sağlıklı fareler için uyarlanmıştır ve daha genç veya daha yaşlı fareler için daha fazla standardizasyon gerektirir. Optimal olmayan canlılık, tekrarı zorunlu kılan dokunun aşırı sindirimi anlamına gelir. Alternatif olarak, FACS sıralaması, aşırı sindirilmiş örneklerden hücreleri kurtarabilir.
Omurilik mikrogliasını sindirmek ve saflaştırmak için liferaz uygulaması yenidir. Sinir sistemi dokularında sınırlı kullanımı, tarihsel olarak canlılık zorluklarındankaynaklanmaktadır 18,19. Bununla birlikte, bu çalışma, titizlikle saflaştırılmış bu kollajenaz kullanıldığında artan canlılığı göstermektedir. Alternatif olarak, daha düşük potansiyele sahip diğer kollajenazlar keşfedilebilir.
Nöroinflamasyonun varlığı, kan-beyin bariyeri uzlaşması ve fare yaşı gibi birkaç önemli husus kabul edilmelidir. Bu faktörler hem mikroglial morfolojiyi hem de frekansı değiştirir. Nöroinflamasyon veya kan-beyin bariyeri bozulması durumlarında, CD45 ve CD11b'yi eksprese eden bağışıklık hücreleri sızarak mikroglial saflığı azaltabilir. Mikroglia, çeşitli nöroinflamatuar durumlarda kapsamlı bir şekilde araştırıldığından, bu protokol patolojik ve nörofizyolojik araştırmalar için potansiyele sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi (CONACYT) (702361) tarafından verilen bursla desteklenmiştir. Yazarlar Ph.D. Ulusal Politeknik Enstitüsü Ulusal Biyolojik Bilimler Okulu'nun Biyolojik Kimya Bilimleri programı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL collection tubes | Corning, USA | 430790 | |
| 2 mL microtubes | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
| 50 mL collection tubes | Corning, USA | 430829 | |
| 70% ethanol | |||
| Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) | Gibco, USA | 15240062 | |
| Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| Antibody CD45 PerCP anti-mouse | BioLegend, USA | 103130 | |
| Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Blue Cell Strainer 40 μm | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6-well Clear Not Treated | Corning, USA | CLS3736 | |
| Coverslips | |||
| Digital Heating Shaking Drybath | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| Dissecting forceps for microsurgery | FT by DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
| Electric shaver | |||
| FACS tube | Thermo, USA | 352058 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Flow cytometer Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| Hank’s balanced salt solution | Merck, USA | H2387 | |
| L-glutamine | Corning, USA | 15393631 | |
| Liberase TM | Roche, USA | 5401119001 | |
| Neubauer chamber Counting Chambers | China | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, USA | 17089101 | density gradient centrifugation |
| Poly-L-lysine solution | Merck, USA | P8920 | |
| Scalpel No. 25 | HERGOM, Mexico | H23 | |
| Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Stereoscopic microscope | Velab, Mexico | HG927831 | |
| Straight surgical scissors (10 cm) | HERGOM, Mexico | ||
| Straight Vannas scissors | HERGOM, Mexico | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | Merck, USA | 15250-061 | |
| Vortex mixer | DLAB, China | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, USA | 423102 | amine-reactive fluorescent dye staining |
References
- Schröder,, Moser,, Huggenberger, Neuroanatomy of the Mouse. , Springer, Switzerland. 59-78 (2020).
- Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
- Bab, I., et al. Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, First ed, Springer. 205 (2007).
- Nayak, D., et al.
- Martinez, F. O., et al.
- Masuda, T., et al.
- Prinz, M. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
- de Haas, A. H., et al. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
- Xuan, F. L., et al. Differences of microglia in the brain and the spinal cord. Front Cell Neurosci. 13, 504 (2019).
- Paolicelli, R. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
- Li, Q., et al. Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway. Glia. 67 (3), 438-451 (2019).
- Prinz, M., et al. Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation. Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).
- Yip, P. K., et al. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).
- Akhmetzyanova, E. R., et al. Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury. Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).
- Mahadevan, V.
- Krukowski, K., et al. Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits. Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).
- Cardona, A., et al. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Schmidt, V. M., et al. Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex. Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk. Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).
