Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Samtidig påvisning av forskjellige antistoffklasser i en multiplekset serologisk test

Published: July 14, 2023 doi: 10.3791/65323
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 2, 3,4, 3,4, 3,4, 3, 1, 1
1NMI Natural and Medical Sciences Institute at the University of Tübingen, 2Department of Neurology, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch, 3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research, 4German Centre for Infection Research (DZIF)
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Et trekanals dual-reporter fluorescensstrømningsanalysesystem ble brukt til å utvikle en perlebasert multipleximmunoassay som samtidig evaluerer serumprøver for IgG og IgM fremkalt mot flere antigener av forskjellige Borrelia-arter som forårsaker Lyme borreliose i Europa og Nord-Amerika.

Abstract

For å overvåke utviklingen av smittsomme sykdommer er det nyttig å vurdere immunoreaktivitet mot ulike antigene determinanter, og måle forskjellige antistoffisotyper fordi de vises på forskjellige stadier av vertsimmunresponsen. Med Lyme borreliose kan det patogene middelet være et av flere medlemmer av Borrelia-arten . Korrekt prøveklassifisering krever derfor evaluering av immunreaktiviteten mot ulike antigener av ulike borreliaarter . I tillegg kan antipatogen IgG- og IgM-responser ha forskjellige fremkallingstidsforløp under sykdomsprogresjon. Her demonstrerer vi utviklingen av en to-reporter multiplex immunoassay som har nytte i å identifisere Borrelia-spesifikk immunrespons i humane serumprøver ved samtidig å evaluere både IgG og IgM immunoreaktivitet mot forskjellige bakterielle antigener i samme reaksjonsbrønn. Denne dual-reporter-tilnærmingen beholder den analytiske ytelsen til enkeltreportermetoder, samtidig som du sparer tid og ressurser og reduserer kravene til utvalgsstørrelse. Denne analysen tillater i hovedsak å doble den serologiske informasjonen som skal genereres fra en blodprøve på halvparten av tiden.

Introduction

Lyme borreliose er den vanligste flåttbårne infeksjonssykdommen i moderat klima på den nordlige halvkule1. Det er forårsaket av spirochete bakterier av slekten Borrelia, med fem kjente humane patogener som varierer i geografisk fordeling2. De viktigste patogene borreliaartene i Europa er B. afzelii og B. garinii, med B. burgdorferi s.s., B. spielmanii og B. bavariensis mindre hyppig involvert. I Nord-Amerika er B. burgdorferi s.s. det eneste forårsakende middelet til Lyme borreliosis 2,3. Borreliapatogener overføres av medlemmer av flåttslekten Ixodes, med overføring som kan skje innen 24 timer etter flåttbitt4.

Lyme borreliose diagnose er vanligvis laget av kliniske symptomer og deretter bekreftet av serologi. I både Europa og Nord-Amerika anbefaler diagnostiske retningslinjer en to-trinns testserie bestående av en enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) med refleksimmunblot for å evaluere antistoffrespons mot borreliaspesifikke antigener 1,5,6,7,8,9 . Denne tilnærmingen mangler imidlertid sensitivitet og er suboptimal, spesielt i tidlig fase av infeksjonen når serokonversjon kan være ufullstendig og anti-Borrelia IgG og IgM-titere er for lave6.

Multiplex immunoassays forbedrer tradisjonelle immunoassays som måler bare ett mål om gangen, og kan samtidig evaluere flere antistoffisotyperesponser mot ett eller flere antigener 10,11,12. Analyser som ELISA er begrenset til å identifisere og kvantifisere en enkelt analytt per reaksjon, i dette tilfellet enten sirkulerende IgG eller IgM indusert mot et enkelt bakterielt antigen etter infeksjon med Borrelia. Denne rapporten illustrerer bruk av perlebasert analyttprofileringsteknologi for utvikling av en multiplex immunoassay som samtidig påviser både IgG- og IgM-antistoffer mot noen av de her valgte Borrelia-antigenene i humane serumprøver. Vi valgte ut fire antigener som til sammen dekker de vanligste sykdomsfremkallende borreliaartene som hører hjemme i Europa (B. garinii, B. afzelii, B. burgdorferi s.s.) og Nord-Amerika (B. burgdorferi s.s.) (Tabell 1) 2,3. Dette tillater avgjørende patogenidentifikasjon og evnen til å skille tidlig IgM og senere, mer holdbar, IgG-immunoreaktivitet i pasientprøver.

Mål isotype Reporter Channel Antigen Borrelia arter Belastning Konsentrasjon av antigenkobling
Igm PE OspC B. Garinii 20047 5,0 μg/106 perler
IgG BV421 VlsE B. burgdorferi s.s B31 1,25 μg/106 perler
IgG BV421 DbpA B. burgdorferi s.s. ZS7 10,0 μg/106 perler
IgG BV421 DbpA B. afzelii PKo 5,0 μg/106 perler

Tabell 1: Representative borreliaantigener brukt til utvikling av multipleksanalyser.

Vi utviklet opprinnelig en single-reporter immunoassay som oppdaget enten anti-Borrelia antigen IgG eller IgM-antistoffer i to separate reaksjoner og deretter fusjonerte disse analysene til en dual-reporter multiplex-analyse som måler begge antistoffisotyper i samme reaksjonsblanding. Magnetiske perler kobles til et patogenmålantigen av interesse, og inkuberes deretter med pasientens serumprøver. Det perlekoblede antigenet blir gjenkjent av, og fanger, både sirkulerende IgG og IgM i serum som genereres i en immunrespons mot det patogenantigenet. Analyse IgG versus IgM-spesifisitet bestemmes ved valg av et sekundært antistoff som binder seg til enten IgG eller IgM, hver med et distinkt fluoroforsignal assosiert med de to sekundære antistoffene. Hvert fluorescerende signal detekteres i en av instrumentets to Reporter-kanaler (dvs. dual-reporter) som har en annen eksitasjonslaser og utslippsfangst spesifikk for enkeltfluoroforen som brukes til å oppdage enten IgG eller IgM (her henholdsvis Brilliant Violet 421 eller phycoerythrin). Instrumentet Classification Channel identifiserer det fargekodede fargestoffet som er iboende i forskjellige perlesett. Dermed kan flere målantigener kobles til forskjellige fargede perler, og perlesettene blandes sammen og brukes til å vurdere omfattende mangfoldig antipatogen immunoreaktivitet i serumprøver. Klassifiseringskanalen identifiserer hvert enkelt perlesett (dvs. spesifikt antigen) og måler fluorescensen assosiert med IgG eller IgM mot det antigenet. Den resulterende multipleksanalysen sparer tid og ressurser sammenlignet med mindre omfattende klassisk testing og katalogiserer nøyaktig Lyme-immunoreaktivitet i begrensede prøvevolumer. Mens en lignende dual-reporter-tilnærming tidligere har blitt brukt til å kategorisere immunresponser i andre patologier som SARS-CoV-2-infeksjon13, beskriver denne rapporten anvendelsen av multiplex fluorescerende analyseteknologi for å karakterisere immunoreaktivitet i Lyme borreliose.

Protocol

Passende godkjenning fra Institutional Review Board/Ethics Committee ble mottatt for bruk av humane serumprøver i denne eksperimentelle serien. Prøvene var anonymisert restmateriale fra en tysk nasjonal studie av sars-CoV-2 seroprevalens14. Godkjenning for bruk av humane prøver ble gitt av etikkomiteen ved Hannover Medical School, Tyskland (9086_BO_S_2020). Totalt 21 humane serumprøver ble brukt i den nåværende studien.

1. Etisk godkjenning for bruk av humane prøver

  1. Få passende etiske godkjenninger for bruk av humane prøver.

2. Reagenser og utstyr

  1. Humane serumprøver: Utføre teknisk analysevalidering og kvalitetskontroll ved hjelp av serumprøver fra personer tidligere diagnostisert med Lyme borreliose eller fra påvist borrelia-negativ immunstatus12,14.
  2. Instrumentering med én reporter. Bruk et tokanals enkeltrapporteringsinstrument (materialfortegnelse) for den innledende analyseutviklingen og den tekniske valideringen.
    MERK: Single-reporter-systemet har to lasere: 1) identifiserer og kvantifiserer dråpesettspesifikk fluorescens for å diskriminere forskjellige dråpesett, hvis de brukes (klassifiseringskanal), og 2) oppdager og kvantifiserer perlebundet målspesifikk phycoerythrin (PE) fluorescens (Reporter Channel; 532 nm eksitasjon, "oransje" 565-585 nm utslipp). Dermed kan bare en enkelt antistoff isotype klasse (f.eks enten IgG eller IgM) analyseres på en gang ved hjelp av enkelt Reporter Channel.
    1. Utfør innledende valideringsstudier for å vurdere anti-Borrelia IgG og IgM separat, i et single-reporter 96-brønnformat som bruker PE-merkede deteksjonsreagenser for begge antistoffklasser.
      MERK: Den nåværende analysen evaluerer sirkulerende IgG spesifikk for Borrelia antigen VlsE og to varianter av DbpA, og sirkulerende IgM spesifikk for antigen OspC, som representative eksempler. Analysen kan utvides til å evaluere immunreaktivitet i serum mot andre antiborreliaantigener , etter ønske12.
  3. Instrumentering med dobbel reporter. Bruk et trekanals dual-reporter-instrument (Table of Materials) som tillater samtidig IgG / IgM-analyse i samme reaksjon, for utvikling og teknisk validering av den doble IgM / IgG-analysen (detaljert nedenfor). Dette instrumentet har totalt 3 fluorescensdetekterende kanaler, hvorav 2 er reporterkanaler som evaluerer målrettede Ig-assosierte signaler.
    MERK: Dual-reporter-systemet har tre lasere: 1) identifiserer og kvantifiserer dråpesettspesifikk fluorescens (klassifiseringskanal); 2) oppdager og kvantifiserer målspesifikk phycoerythrin (PE) fluorescens (Reporter Channel 1; 532 nm eksitasjon, "oransje" 565-585 nm utslipp), og 3) evaluerer målspesifikk Brilliant Violet 421 (BV421) fluorescens av en andre målanalytt (Reporter Channel 2; 405 nm eksitasjon, "blå" 421-441 nm utslipp). Dual-reporter-systemet er kompatibelt med både 96-brønns og 384-brønns mikrotiterplate (semi-automatisert håndtering) analyseformater. Det generelle analyseskjemaet er vist i figur 1. Protokolltrinnene er beskrevet nedenfor.

3. Antigen-kobling

  1. Koble Borrelia-antigenene til magnetiske, karboksylerte og fluorescerende fargekodede 6,5μm mikrosfærer (perler; Tabell over materialer) ved bruk av 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDC)/sulfo-N-hydroksysuccinimid (sNHS) kjemi.
    MERK: En detaljert beskrivelse finnes i referanse11og referanse12. Finn koblingskonsentrasjonen for hvert antigen i tabell 1. Koblede perler bør oppbevares i mørket ved 4 °C inntil bruk. Alle buffere som brukes i koblings- og deteksjonsreaksjoner er beskrevet i tilleggsmaterialene.

4. Analyseprosedyre: Single-reporter IgG eller IgM serologisk analyse: 96-brønnformat

  1. Fortynn prøven i 2 trinn (2 trinn, begge i 96-brønnsplater, 200 ganger serumprøvefortynning i analysebuffer).
    MERK: Analysebuffersammensetningen er en 1:4-blanding av lav kryssbuffer: PBS inneholdende 1 % (w/v) bovint serumalbumin. Tween-20 tilsettes blandingen til en endelig konsentrasjon på 0,05 % (v/v).
    1. Prøvefortynningstrinn 1: Bland 5 μL av serumprøven med 120 μL av analysebufferen (25 ganger fortynning).
    2. Fortynning av prøven trinn 2: Fortynn den 25 ganger store fortynningen av prøven i tillegg 8 ganger ved å blande 10 μl av fortynningen med 70 μL av analysebufferen for å gjøre den endelige prøvefortynningen 200 ganger.
  2. Fortynning av magnetisk dråpeblanding
    1. Forbered en dråpeblanding som inneholder 1,0 × 106 perler / ml per perlepopulasjon (dvs. per unikt målantigen).
    2. Fortynn den tilberedte dråpeblandingen 25 ganger i analysebufferen for å gjøre den endelige dråpekonsentrasjonen i denne fortynnede suspensjonen nå 4 × 104 perler / ml per perlepopulasjon (dvs. per unikt målantigen).
  3. Serumprøveinkubasjon med perler
    1. Pipette 25 μL fortynnet multipleksperlesuspensjon (inneholdende 4,0 × 104 perler/sett/ml) i tildelte brønner på en 96-brønns mikrotiterplate med halvt område (materialfortegnelse).
    2. Tilsett 25 mikrol 200 ganger fortynnet serumprøve (fra trinn 4.1 ovenfor) i egnede brønner som inneholder 25 mikroliter koblet dråpesuspensjon.
      MERK: Dette gir en ytterligere 2 ganger fortynning, slik at den endelige serumprøvefortynningen i brønnen er 400 ganger og det endelige dråpetallet er 1000 perler / perlesett / 50-μL reaksjon.
    3. Dekk reaksjonsplaten med 96 brønner med en mikroplateforsegling (selvklebende folie eller plastplatedeksler).
    4. Inkuber platen i 2 timer ved 20 °C, ved 750 o / min på en platerister.
  4. Perlevask
    1. Fjern reaksjonsplaten med 96 brønner fra plateristeren og fjern forsiktig den selvklebende plateforseglingen.
    2. Sett reaksjonsplaten med 96 brønner i en tallerkenvasker.
    3. Vask perlene tre ganger med 100 μL vaskebuffer (1× PBS + 0,05% v/v Tween 20) ved hjelp av den automatiserte magnetplatevaskeren.
  5. Heng opp vasket perler i 100 μL vaskebuffer, dekk platen med selvklebende folie eller plastplatedeksel, og rist platen på en tallerkenrister i 1 min ved 20 °C ved 1000 o / min.
  6. Del de vasket perlene
    1. Fjern reaksjonsplaten med 96 brønner fra plateristeren og fjern forsiktig den selvklebende plateforseglingen.
    2. Bland reaksjoner ved å pipetere opp og ned fem ganger og overføre 50 μL av hvert 100-μL reaksjonsvolum til hver av to nye 96-brønns reaksjonsplater, en plate for IgG-deteksjon og en for IgM-deteksjon.
  7. Deteksjon antistoff / reagens inkubasjon
    MERK: På dette tidspunktet har målantigenkoblede perler blitt inkubert med serumprøver for å trekke ut sirkulerende antistoffer i serum (hvis tilstede) som reagerer med antigenet (e). Reagerte perler med bundet immunglobulin har blitt delt inn i to plater, og IgG og IgM er nå detektert og kvantifisert i sine separate plater ved hjelp av isotypespesifikke sekundære antistoffer med en PE-etikett. Forskjøv platehåndtering med 20 min.
    1. Aspirer supernatanten fra brønnene som inneholder magnetiske perler ved hjelp av magnetplateskiven.
    2. For hver plate må du lage riktig Ig-deteksjonsreagensblanding (enten anti-IgG eller anti-IgM), som inneholder PE-konjugert geitanti-human IgG (3 μg / ml) eller PE-konjugert esel anti-human IgM (5 μg / ml) i analysebufferen. For hver perleholdig brønn brukes 30 μL deteksjonsreagens. Klargjør tilstrekkelige IgG- og IgM-deteksjonsreagensvolumer for reaksjonsbrønner, med tilstrekkelig ekstra til å imøtekomme pipetteringstap.
    3. Pipette 30 μL IgG-deteksjonsreagens i hver brønn som inneholder reagerte perler på IgG-platen og dekker 96-brønns reaksjonsplaten med en mikroplateforsegling.
    4. Pipette 30 μL IgM-deteksjonsreagens i hver brønn som inneholder reagerte perler på IgM-platen og dekker 96-brønnreaksjonsplaten med en mikroplateforsegling.
    5. Inkuber i 45 minutter ved 20 °C mens du rister ved 750 o / min på en platerister.
  8. Perlevask
    1. Fjern reaksjonsplaten med 96 brønner fra plateristeren og fjern forsiktig den selvklebende plateforseglingen.
    2. Sett reaksjonsplaten med 96 brønner i en magnetplatevasker.
    3. Vask perlene tre ganger med 100 μL vaskebuffer ved hjelp av magnetplateskiven.
  9. Resuspender perler i 100 μL vaskebuffer.
  10. Analyser resultatene på det enkelte reporterinstrumentet.
    1. Dekk reaksjonsplaten med 96 brønner med en mikroplateforsegling.
    2. Rist reaksjonsplaten ved 96 brønner i 3 minutter ved 20 °C, ved 1000 o / min på en platerister.
    3. Overfør 96-brønns reaksjonsplaten fra plateristeren og sett inn et enkeltreporter-strømningsanalysatorinstrument (materialfortegnelse).
    4. For hver prøve, analyser median fluorescerende intensitet (MFI) ved hjelp av følgende instrumentinnstillinger: Opptaksvolum = 80 μL, Antall = 50 / perlepopulasjon, Timeout = 60s, Gating = 7,500-15,000)12,13.

5. Analyseprosedyre: Dual-reporter IgG og IgM serologisk analyse: 96-brønnformat

  1. Prøvefortynning (2 trinn, begge i 96-brønnsplater; 200 ganger serumprøvefortynning i analysebuffer)
    1. Fortynningstrinn 1: Bland 5 μL serumprøve med 120 μL analysebuffer (25 ganger fortynning).
    2. Fortynning av prøven trinn 2: Fortynn de 25 ganger prøvefortynningene ytterligere 8 ganger ved å blande 10 mikrol av den første fortynningen (25 ganger fortynnet prøve fra pkt. 5.1.1) med 70 μl analysebuffer (8 ganger fortynning), for å oppnå endelig prøvefortynning til 200 ganger.
  2. Fortynning av magnetisk dråpeblanding
    1. Forbered en dråpeblanding som inneholder 1,0 × 106 målantigenkoblede perler / ml per perlepopulasjon (dvs. per unikt målantigen).
      MERK: I denne eksperimentelle serien evaluerte vi både IgG og IgM immunoreaktivitet mot fire unike Borrelia antigener i hver reaksjon.
    2. Fortynn den tilberedte perleblandingen 50 ganger i analysebuffer. Perlekonsentrasjonen i denne fortynnede suspensjonen er nå 2,0 × 104 perler/ml per perlepopulasjon.
      MERK: Antall perler i dupleksanalysereaksjonen er halvert fra det som brukes i single-reporter-reaksjonen for å muliggjøre direkte sammenlignbarhet mellom de to analysene og for å spare ressurser, etter at foreløpige studier bekreftet at fluorescenssignalet ble opprettholdt innenfor det lineære kvantifiseringsområdet ved bruk av halvparten av antall perler.
  3. Serumprøveinkubasjon med perler
    1. Pipette 25 μL fortynnet målantigenkoblet perlesuspensjon (inneholdende 2,0 × 104 perler/sett/ml) i forhåndstildelte brønner på en 96-brønns mikrotiterplate med halvt område. Det nøyaktige antallet reaksjonsbrønner og deres plassering på platen avhenger av det operatørbestemte totale antallet prøver som testes, og om det vil bli kjørt enkelt- eller replikasjonsbrønner per prøve.
      MERK: Målantigenkoblede magnetiske perler vil bli reagert med humane serumprøver. Både anti-borrelia antigen immunoreaktivt IgG og IgM, hvis tilstede i prøver, vil binde seg til og bli immobilisert på de samme antigenkoblede perlene. Sekundær antistoffkvantifisering av bundet IgG og IgM vil da bli utført på de samme perlene i de samme reaksjonene, ved bruk av forskjellige fluoroforer for IgG- og IgM-identifikasjon som tillater deres differensiering.
    2. Tilsett 25 μL 200 ganger fortynnet serum (fra trinn 5.1 ovenfor) i hver brønn som inneholder 25 μL blandet målantigenkoblet dråpesuspensjon (trinn 5.2).
      MERK: Dette gir en ytterligere 2 ganger fortynning, slik at den endelige serumprøvefortynningen i brønnen er 400 ganger, og det endelige dråpetallet er 500 perler / perlesett / 50-μL reaksjon.
    3. Dekk reaksjonsplaten med 96 brønner med en mikroplatetetning (klebende folie eller plastplatedeksel).
    4. Inkuber tallerkenen med perler i 2 timer ved 20 °C, ved 750 o / min på en platerister.
  4. Perlevask (for å fjerne overflødig serumprøve)
    1. Fjern reaksjonsplaten på 96 brønner fra plateristeren og fjern den selvklebende plateforseglingen.
    2. Sett reaksjonsplaten med 96 brønner i en magnetplatevasker.
    3. Vask perlene tre ganger med 100 μL vaskebuffer ved hjelp av magnetplateskiven.
  5. Aspirer endelig vaskevolum fra perler etter siste vasketrinn.
  6. Deteksjonsantistoff (Inkubasjon - Del I)
    1. Lag fersk IgG og IgM Dual Detection Reagent som inneholder biotinylert geit anti-human IgG (1 μg / ml) sammen med PE-konjugert esel anti-human IgM (5 μg / ml) i analysebuffer. For hver perleholdig brønn brukes 30 μL dobbeltdeteksjonsreagens. Klargjør tilstrekkelig IgG og IgM reagensvolum med dobbel deteksjon for reaksjonsbrønner, med tilstrekkelig ekstra til å imøtekomme pipetteringstap.
    2. Pipette 30 μL IgG og IgM Dual Detection Reagent i hver tildelt brønn og dekker 96-brønns reaksjonsplaten med en mikroplateforsegling.
    3. Inkuber platen i 45 minutter ved 20 °C mens du rister ved 750 o / min på en platerister.
  7. Perlevask (for å fjerne overflødige deteksjonsantistoffer)
    1. Fjern reaksjonsplaten med 96 brønner fra plateristeren og fjern forsiktig den selvklebende plateforseglingen.
    2. Sett reaksjonsplaten med 96 brønner i en automatisert magnetplatevasker.
    3. Vask perlene tre ganger med 100 μL vaskebuffer ved hjelp av den automatiserte magnetiske plateskiven.
  8. Aspirer endelig vaskevolum fra perler etter siste vasketrinn.
  9. Streptavidin-konjugert reporter (Inkubasjon - Del II)
    1. Fortynn fersk BV421-merket Streptavidin i analysebuffer til en konsentrasjon på 0,2 μg / ml. For hver perleholdig brønn brukes 30 μL BV421-merket Streptavidin. Klargjør tilstrekkelig BV421-merket Streptavidin-volum for reaksjonsbrønner, med tilstrekkelig ekstra til å imøtekomme pipetteringstap.
    2. Pipett 30 μL fortynnet BV421-Streptavidin i hver reaksjonsbrønn og dekk 96brønns reaksjonsplaten med mikroplateforseglingen.
    3. Inkuber platen i 30 minutter ved 20 °C mens du rister ved 750 o / min på en platerister.
  10. Vask perler (for å fjerne overflødig BV421-Streptavidin)
    1. Fjern reaksjonsplaten med 96 brønner fra plateristeren og fjern forsiktig den selvklebende plateforseglingen.
    2. Sett reaksjonsplaten med 96 brønner i magnetplateskiven.
    3. Vask perlene tre ganger med 100 μL vaskebuffer ved hjelp av den automatiserte magnetiske plateskiven.
  11. Resuspender perler i brønner til et endelig volum på 100 μL i vaskebuffer.
  12. Analysere resultater på instrumentet dual-reporter
    1. Dekk reaksjonsplaten med 96 brønner med en mikroplateforsegling.
    2. Inkuber reaksjonsplaten med 96 brønner i 3 minutter ved 20 °C, ved 1000 o / min på en platerister.
    3. Overfør reaksjonsplaten med 96 brønner fra plateristeren til strømningsanalysatorinstrumentet med dobbel reporter (materialfortegnelse).
    4. Evaluer prøvemedian fluorescerende intensitet (MFI) i henhold til produsentens instruksjoner (Instrumentinnstillinger: Dual-Reporter Mode, Uptake volume = 80 μL, Count = 50/perle populasjon, Timeout = 60s, Gating = 7,500-15,000).

6. Dual reporter IgG og IgM serologisk analyse: 384-brønn semi-automatisert format

  1. Utfør dual-reporter-analysen i 384-brønns plateformat ved hjelp av analysetrinnene beskrevet i avsnitt 5, men prosessprøver ved hjelp av en pipetteringsrobot og automatisert magnetisk platevasker (materialfortegnelse). I 384-brønnformat, rist plater under inkubasjoner og vask ved 1450 o / min, og før du måler fluorescens, rist platen i 5 minutter ved 21 ° C og 1800 o / min.

Representative Results

Eksperimentell oversikt
De generelle skjemaene for perlebaserte borreliaanalyser med én reporter og dobbel reporter er vist i figur 1. For enkeltantistoffmål (dvs. IgG eller IgM) generert mot et gitt borreliaantigen , ble begge antistoffklassene evaluert uavhengig i humane serumprøver ved bruk av et PE-konjugert anti-isotype antistoff for rapportering. For dual-reporter-analysen med samtidig analyse av både IgG- og IgM-immunoreaktivitet brukte Borrelia-antigenspesifikk IgG-deteksjon et biotinylert anti-humant IgG + BV421-merket Streptavidin (blå fluorescens) reportersystem, mens PE-konjugert reporter (oransje fluorescens) beholdt for IgM-deteksjon. Arbeidsflyten til dual-reporter-analysen ligner single-reporter-analysen, med unntak av en ekstra 30-minutters deteksjonssysteminkubasjon med andrekanals fluorescensdeteksjonsreagens BV421-Streptavidin.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av perlebaserte borreliaanalyser med én reporter og dobbel reporter. (A) Single-reporter-instrumentet ble brukt til å utvikle og først validere den perlebaserte analysen som karakteriserte enten anti-Borrelia IgG eller IgM individuelt, begge ved hjelp av en phycoerythritin (PE) fluorescerende reporteretikett som avgir signal i de "oransje" spektrene. Ethvert ønsket Borrelia-antigen kan kobles til kulene og brukes til å fange og kvantifisere enten IgG eller IgM som er tilstede i serumprøver. To separate immunoassays er nødvendig for å evaluere både IgG og IgM reaktivitet mot et gitt antigen. (B) Dual-reporter-systemet tillot samtidig analyse av serumprøver for både IgG- og IgM-antistoffer mot ethvert individuelt Borrelia-antigen i samme brønn. Denne tilnærmingen bruker det samme PE-konjugerte deteksjonsantistoffet for å målrette anti-Borrelia IgM, men erstatter IgG-deteksjonen fra et PE-basert system til å bruke et biotinylert primært deteksjonsantistoff og BV421-merket Streptavidin (en "blå" emitter) som trenger et ekstra deteksjonssysteminkubasjonstrinn på 30 minutter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Presisjon intern analyse
Spearman-korrelasjonsanalyse for tre representative borreliaantigener (figur 2) viste ensartet reproduserbarhet av MFI-verdier ved påvisning av antiborreliaantistoffer i humane sera.

Figure 2
Figur 2: Intra-assay Precision av dual-reporter perlebasert Borrelia assay. Spearmans korrelasjonsanalyse viste en høy intra-analysepresisjon av dual-reporter-analysen når et PE-deteksjonssystem ble brukt til å oppdage Borrelia-spesifikke IgM-antistoffer (A) og et BV421-deteksjonssystem ble brukt til å påvise borreliaspesifikke IgG-antistoffer (B, C). Totalt 21 serumprøver ble analysert i duplikater ved hjelp av en halvautomatisert prosedyre. I hver graf ble MFI-signaler plottet mot hverandre og analysert ved lineær regresjon. En lineær kurve (x = y) vist som en rød stiplet linje indikerer identiske MFI-signaler for deteksjonssystemer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Presisjon mellom analyser
God reproduserbarhet av analyse-til-analyse ble observert med dual-reporter-analysen. Levey-Jennings-diagrammer (figur 3) med MFI-verdier av en kvalitetskontrollprøve målt over syv uavhengige kjøringer viste den høye inter-analysepresisjonen for alle representative antigener. Gjennomsnittlig prosent variasjonskoeffisient (CV% = standardavvik/gjennomsnitt × 100) av de fire representative borreliaantigenene var 5,3 %.

Fortynningslinearitet
Fordi den opprinnelige single-reporter-analysen og den nye dual-reporter-analysen benytter forskjellige flowcytometriske plattformer, sammenlignet vi median fluorescensutgang av samme antigenimmunoassay mellom de to flowcytometriinstrumentene (figur 4). Prøvefortynningsserier ga lineære fortynningskurver for både IgM- og IgG-evaluering, med god parallellitet av dose-respons mellom instrumenter gjennom hele fortynningsområdet evaluert (1:100-1:12,800).

Figure 3
Figur 3: Interanalysepresisjon av dual-reporter perlebasert Borrelia-analyse . For evaluering av interanalysepresisjonen ble Borrelia-spesifikk IgM (A) og IgG (B-D) antistoffrespons av en kvalitetskontrollprøve analysert over syv uavhengige kjøringer, i dupliserte brønner hver gang. Analyser ble utført manuelt. MFI-verdier ble plottet inn i et Levey-Jennings-diagram. En grønn linje gir gjennomsnittet av alle verdier. To rødstiplede linjer indikerer toleranseområdet for presisjonen mellom analysene. Dette ble beregnet ut fra middelverdien ± 2,5 ganger standardavviket (2,5 S.D.). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Fortynningslinearitet av den dobbeltreporterperlebaserte Borrelia-analysen . Ved prøvefortynninger på 100 ganger til 12 800 ganger var fortynningskurvene for både IgM-deteksjon (A) og IgG-deteksjon (B) like når de ble utført manuelt med single-reporter-instrumentet og dual-reporter-instrumentet. Ved alle testede fortynninger var MFI-verdiene litt høyere ved bruk av single-reporter-instrumentet (røde symboler) enn dual-reporter-instrumentet (blå symboler). Vist er fortynningskurver for 2 representative antigener, der hvert fortynningspunkt representerer gjennomsnittlig måling av triplikate brønner med standardavvik (SD *) angitt med feilfelt. Merk: Små SD-er er ikke synlige i denne skalaen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende materialer. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Denne rapporten belyser utviklingen av et perlebasert Borrelia-immunoassay med to reportere som reproduserbart og sensitivt påviser anti-Borrelia immunoreaktivitet i serumprøver12. De ulike sykdomsfremkallende borreliaartene som forårsaker borreliose kan differensieres ved variantspesifikk antigenheterogenitet 6,7,8,9. Den multipleksede analysen evaluerer samtidig IgG- og IgM-mediert anti-borrelia immunoreaktivitet innenfor samme reaksjonsbrønn, og sparer dermed reagenser, arbeidskraft og prøvemateriale som ellers trengs for å utføre to singleplex-analyser separat. Sammenligning av IgM- og IgG-responser over tid kan muliggjøre bedre sporing av sykdomsprogresjon ettersom IgM-til-IgG-serokonversjon oppstår etter infeksjon6.

Dual-reporter-systemet bruker to forskjellige deteksjonsantistoffsystemer 13,15. Relaterte eksperimenter viste ingen signifikant påviselig kryssreaktivitet mellom Borrelia anti-IgM og anti-IgG deteksjonssystemer når begge antistoffklassene ble analysert sammen i samme reaksjonsbrønn12. Med tanke på den lavere bindingsaffiniteten til IgM versus IgG-antistoffer16,17, valgte vi et PE-konjugert deteksjonsantistoff for IgM-deteksjon (den første reporterkanalen til dual-reporter-instrumentet) fordi PE er en av de sterkeste emitterende fluoroforene som rutinemessig brukes i immunoassays18. For IgG-evaluering brukte vi et biotinylert deteksjonsantistoff som deretter ble belyst med BV421-konjugert streptapavidin (instrumentets andre reporterkanal)19. Til tross for det ekstra inkubasjonstrinnet på 30 minutter sammenlignet med single-reporter-systemet, gir dual-reporter-systemet dobbelt så mye informasjon per reaksjon. Samlet sett krever multiplekset analyse med dobbel reporter mindre kumulativ tid og materialinndata enn å kjøre to enkeltreporteranalyser.

Sterk ytelse og stabilitet av den multipleksede Borrelia-analysen ble eksemplifisert ved høy reproduserbarhet i presisjonsstudier innen intra- og interanalyse, og ved demonstrasjon av fortynningslinearitet og fortynningsparallellitet over et bredt spekter av prøvekonsentrasjoner for både IgG- og IgM-vurdering. Vi observerte høyere absolutte fluorescensutslippsnivåer for de samme fluoroforene ved bruk av enkeltkanalsinstrumentet versus tokanalssystemet (≈1,7× høyere med PE), noe som kan tilskrives forskjeller i optikk og kalibreringsinnstillinger mellom de to instrumentene (figur 4). Likevel holdt fluorescensutslippskurver med begge fluoroforer seg innenfor det lineære området for begge instrumentene ved ekstreme høy- og lavprøvefortynninger, og eventuelle avvik i absolutt fluorescens som ble målt, påvirket ikke klassifiseringen av Borrelia-eksponeringsstatus . 12

En stor fordel med denne perlebaserte Borrelia multiplex-analysen er hvor enkelt analysen kan modifiseres eller utvides for å evaluere forskjellige eller ytterligere analytter, for eksempel for å oppdage antistoffer mot antigener av ytterligere Borrelia-arter . xMAP magnetiske dråpesett inneholder forskjellige fargestoffkombinasjoner som kan skilles i instrumentets klassifiseringskanal og kan teoretisk implementeres i multipleksanalyser som samtidig kan evaluere opptil 500 unike analytter i samme prøve. Mens den nåværende studien fremhever fire representative Borrelia-antigener for å demonstrere analysefunksjonalitet og stabilitet og for å sammenligne single- og dual-reporter-systemet, undersøker den endelige analysen åtte antigener som sammen kan identifisere alle fem klinisk relevante Borrelia-patogener som sirkulerer i hele Europa og Nord-Amerika12.

Høy gjennomstrømningsytelse er mulig ved bruk av standard 384-brønns mikrotiterplater i et halvautomatisk analyseformat. Analyse og instrumentkompatibilitet med både 96- og 384-brønnsplater gjør at Borrelia multiplex-analysen kan brukes som et effektivt screeningverktøy for rask analyse av store prøvesett, for eksempel nasjonale studier20. Manuell ytelse av analysen er fortsatt mulig for mindre prøvesett som bruker mindre 96-brønnsplater.

Studiebegrensninger inkluderer komparativ evaluering av bare noen få Borrelia immunoreaktivitetsmål i et lite antall humane serumprøver. Den opprinnelige studien bekreftet imidlertid at analyseytelsen for både IgG og IgM ble opprettholdt ved analyse av åtte antigener fra alle fem kjente Borrelia-arter i et større prøvesett12. Dual-reporter-instrumentet kan også bare vurdere to antistoffisotyper samtidig innenfor hver reaksjon, så fullstendig isotypeprofilering vil nødvendiggjøre å utføre ytterligere analysereaksjoner13.

Avslutningsvis beskriver denne rapporten den vellykkede sammenslåingen og konverteringen av perlebaserte enkeltreporterimmunoassays til dual-reporter-analyser som samtidig kan evaluere patogene Borrelia-spesifikke IgG- og IgM-antistoffer i humane serumprøver. Denne kombinerte tilnærmingen sparer total tid, materiale og arbeidsinndata for å generere samme datavolum som to uavhengige enkeltreporteranalyser. Multipleksanalysen kan skaleres fra 96-brønn til 384-brønns mikrotiterplateformat og kan halvautomatiseres ved bruk av robotplate- og væskehåndteringsinstrumentering, noe som gjør den egnet for applikasjoner med høy gjennomstrømning som store befolkningsundersøkelser. Perlebaserte dual-reporter-analysesystemer har tidligere vist nytte i å evaluere for eksempel immunresponser mot andre virale og bakterielle patogener13,21, vurdere allogene antistoffresponser mot HLA-epitoper i organtransplantasjon22 og utforske mekanismer for autoimmun sykdom23. Den nåværende rapporten detaljerte bruken av multiplex-teknologi for å identifisere eksponering for Borrelia-patogener som forårsaker Lyme-sykdommen, som et eksempel på hvordan laboratorier kan tilpasse denne tilnærmingen for å utforske komplekse immunmekanismer i ulike patologier.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne rapporten ble finansiert av Luminex (Austin, TX). Forfatterne takker Matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Panama City, FL; mattsilver@yahoo.com) for analytisk og vitenskapelig redigeringshjelp. Forfatterne takker også Harald Klein og Christoph von Eichel-Streiber fra tgcBIOMICS GmbH (Bingen, Tyskland) for å gi Borrelia-antigenene som ble brukt i studien. Humane serumprøver for teknisk analysevalidering og kvalitetskontroll ble hentet fra: 1) Multilocal and Serial Prevalence Study on Antibodies against SARS-CoV-2 i Tyskland via Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research, Braunschweig, Tyskland; og 2)Nevrologisk institutt, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch (Rodewisch, Tyskland). Godkjenning for bruk av humane prøver ble gitt av den etiske komiteen ved Hannover Medical School, Tyskland (9086_BO_S_2020).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies and Detection Reagents Source Catalog Number
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Jackson ImmunoResearch (Dianova) 109-066-098 
Brilliant Violet 421-Streptavidin BD Biosciences 563259
Donkey Anti-Human IgM  Jackson ImmunoResearch (Dianova) 709-116-073
Borrelia Antigens tgcBIOMICS (Bingen, Germany)
Coupling Reagents
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) Thermo Scientific Pierce 77149 ProteoChem (100 mg)
10x PBS Fisher Scientific BP399-4
BSA Carl Roth T844.3
MES (2-ethanesulfonic acid; zwitterionic buffer) Carl Roth 4256.2
Na2HPO4 Carl Roth 4984.1
ProClin300 Sigma 48914-U
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) Thermo Scientific Pierce 24510 (500 mg)
Triton X-100 Thermo Scientific 85111
Instrumentation and Ancillary Lab Supplies Source
384-well plate Corning, Cat# 3570
96-well deep-well plates ThermoFisher Scientific, Cat# 95040450
96-well half-area plates  Corning, Cat# 3690
BioTek 405 TS Plate Washer BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA 
BioTek MultiFlo FX Plate Washer BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA 
DynaMag Spin Magnet (for isolating beads in microcentrifuge tubes) ThermoFisher, Cat# 12320D
Flexmap 3D (two-channel, single-reporter instrument) Luminex Corp., Austin, TX
KingFisher Magnetic Particle Processor (for isolating beads in 96-well plates)  ThermoFisher, Cat# A31508
MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-µm-diameter beads) Luminex Corp., Austin, TX
SmartBlock Plates Eppendorf, Cat# 5363000039
ThermoMixer C Eppendorf, Cat# 5382000015
ThermoTop Eppendorf, Cat# 5308000003
xMAP Intelliflex (three-channel, dual-reporter instrument) Luminex Corp., Austin, TX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stanek, G., Strle, F. Lyme borreliosis-from tick bite to diagnosis and treatment. FEMS Microbiology Reviews. 42 (3), 233-258 (2018).
  2. Stanek, G., Wormser, G. P., Gray, J., Strle, F. Lyme borreliosis. The Lancet. 379 (9814), 461-473 (2012).
  3. Rizzoli, A., et al. Lyme borreliosis in Europe. Eurosurveillance. 16 (27), 19906 (2011).
  4. Cook, M. J. Lyme borreliosis: a review of data on transmission time after tick attachment. International Journal of General Medicine. 8, 1-8 (2015).
  5. Strle, F., Stanek, G. Clinical Manifestations and Diagnosis of Lyme Borreliosis. Lyme Borreliosis: Biological and Clinical Aspects. Lipsker, D., Jaulhac, B. , Karger. 51-110 (2009).
  6. Wilske, B., Fingerle, V., Schulte-Spechtel, U. Microbiological and serological diagnosis of Lyme borreliosis. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 49 (1), 13-21 (2007).
  7. Dessau, R. B., et al. To test or not to test? Laboratory support for the diagnosis of Lyme borreliosis: a position paper of ESGBOR, the ESCMID study group for Lyme borreliosis. Clinical Microbiology and Infection. 24 (2), 118-124 (2018).
  8. Eldin, C., et al. Review of European and American guidelines for the diagnosis of Lyme borreliosis. Médecine et Maladies Infectieuses. 49 (2), 121-132 (2019).
  9. Lantos, P. M., et al. Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America (IDSA), American Academy of Neurology (AAN), and American College of Rheumatology (ACR): 2020 Guidelines for the Prevention, Diagnosis and Treatment of Lyme Disease. Clinical Infectious Diseases. 72 (1), e1-e48 (2021).
  10. Gerritzen, A., Brandt, S. Serodiagnosis of Lyme borreliosis with bead based immunoassays using multiplex technology. Methods. 56 (4), 477-483 (2012).
  11. Embers, M. E., et al. Five-antigen fluorescent bead-based assay for diagnosis of Lyme disease. Clinical Vaccine Immunology. 23 (4), 294-303 (2016).
  12. Häring, J., et al. Borrelia multiplex: a bead-based multiplex assay for the simultaneous detection of Borrelia specific IgG/IgM class antibodies. BMC Infectious Diseases. 22 (1), 859 (2022).
  13. Angeloni, S., Cameron, A., Pecora, N. D., Dunbar, S. A rapid, multiplex dual reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system. Journal of Visualized Experiments. 170, (2021).
  14. Gornyk, D., et al. SARS-CoV-2 Seroprevalence in Germany. Deutsches Ärzteblatt International. 118 (48), 824-831 (2021).
  15. Luminex Corporation. xMAP Cookbook. Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. , 5th ed, https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrer=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F (2022).
  16. Racine, R., Winslow, G. M. IgM in microbial infections: Taken for granted. Immunology Letters. 125 (2), 79-85 (2009).
  17. Ehrenstein, M. R., Notley, C. A. The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator. Nature Reviews Immunology. 10 (11), 778-786 (2010).
  18. Kovaleski, G., et al. Extraction and purification of phycobiliproteins from algae and their applications. Frontiers in Chemistry. 10, 1065355 (2022).
  19. Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: A new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry Part A. 81 (6), 456-466 (2012).
  20. Coors, A., et al. Regional seropositivity for Borrelia burgdorferi and associated risk factors: findings from the Rhineland Study, Germany. Parasites & Vectors. 15 (1), 241 (2022).
  21. Gürsoy, M., et al. Salivary IgA and IgG antibody responses against periodontitis-associated bacteria in Crohn's Disease. International Journal of Molecular Science. 24 (3), 2385 (2023).
  22. Argani, H. Anti-HLA Antibody: The role of epitopes in organ transplantation. Experimental and Clinical Transplantation. 17 (Suppl 1), 38-42 (2019).
  23. Laman, J. D., Huizinga, R., Boons, G. J., Jacobs, B. C. Guillain-Barré syndrome: expanding the concept of molecular mimicry. Trends in Immunology. 43 (4), 296-308 (2022).

Tags

Samtidig deteksjon antistoffklasser multiplekset serologisk test immunoreaktivitet antigene determinanter antistoffisotyper Lyme borreliose borreliaarter prøveklassifisering immunreaktivitet mot forskjellige antigener antipatogen IgG IgM-responser sykdomsprogresjon to-reporter multiplex immunoassay borrelia-spesifikk immunrespons humane serumprøver bakterielle antigener dual-reporter-tilnærming analytisk ytelse bevaring av tid og ressurser prøvestørrelse Krav

Erratum

Formal Correction: Erratum: Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test
Posted by JoVE Editors on 08/16/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test. The Authors section was updated to correct an Affiliation. It was updated from:

Julia Häring1
Tanja Michel1
Matthias Becker1
Daniel Junker1
Tatia Tchitchagua2
Olaf Leschnik2
Berit Lange3,4
Stefanie Castell3,4
Gérard Krause3,4
Monika Strengert3
Alex Dulovic1
Nicole Schneiderhan-Marra1
1NMI Natural and Medical Sciences Institute, University of Tübingen
2Department of Neurology, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch
3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research
4German Centre for Infection Research (DZIF)

to:

Julia Häring1
Tanja Michel1
Matthias Becker1
Daniel Junker1
Tatia Tchitchagua2
Olaf Leschnik2
Berit Lange3,4
Stefanie Castell3,4
Gérard Krause3,4
Monika Strengert3
Alex Dulovic1
Nicole Schneiderhan-Marra1
1NMI Natural and Medical Sciences Institute at the University of Tübingen
2Department of Neurology, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch
3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research
4German Centre for Infection Research (DZIF)

Samtidig påvisning av forskjellige antistoffklasser i en multiplekset serologisk test
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Häring, J., Michel, T., Becker, … More

Häring, J., Michel, T., Becker, M., Junker, D., Tchitchagua, T., Leschnik, O., Lange, B., Castell, S., Krause, G., Strengert, M., Dulovic, A., Schneiderhan-Marra, N. Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test. J. Vis. Exp. (197), e65323, doi:10.3791/65323 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter