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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

罕见原代细胞的靶向代谢组学

Published: February 23, 2024 doi: 10.3791/65690
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics
* These authors contributed equally

Summary

在这里，我们提出了一种准确可靠地测量稀有细胞类型中代谢物的方案。技术改进，包括用于细胞分选的改良鞘液和相关空白样品的生成，能够对代谢物进行全面定量，每个样品的起始量仅为 5000 个细胞。

Abstract

细胞功能主要取决于新陈代谢，可以通过测量小分子中间体来研究潜在代谢网络的功能。然而，获得准确可靠的细胞代谢测量，特别是在造血干细胞等稀有细胞类型中，传统上需要混合来自多种动物的细胞。现在，一种方案使研究人员能够使用每个样本仅使用一只小鼠来测量稀有细胞类型中的代谢物，同时为更丰富的细胞类型生成多个重复。这减少了给定项目所需的动物数量。这里介绍的方案与传统的代谢组学方案相比有几个关键的区别，例如使用5 g / L NaCl作为鞘液，直接分类到乙腈中，以及利用靶向定量和严格使用内标，允许更准确和全面地测量细胞代谢。尽管分离单细胞、荧光染色和分选需要时间，但该方案可以在很大程度上保留细胞类型和药物处理之间的差异。

Introduction

新陈代谢是发生在所有活细胞中的基本生物过程。代谢过程涉及一个庞大的生化反应网络，这些反应受到严格调节和相互连接，使细胞能够产生能量并合成必需的生物分子1。为了了解代谢网络的功能，研究人员测量了细胞内小分子中间体的水平。这些中间体是代谢活动的重要指标，可以揭示对细胞功能的关键见解。

质谱 （MS） 是特异性检测复杂样品中代谢物的最常用选择 1,2。核磁共振（NMR）在化合物的绝对定量和结构解析方面具有优势，但MS通常可以分离复杂混合物（如生物流体或细胞提取物）中的更多组分。通常情况下，MS与通过毛细管电泳（CE）、气相色谱（GC）或液相色谱（LC）3对化合物的先前分离相结合。分离平台的选择主要取决于目标代谢物的范围和样品类型，在实际环境中，还取决于机器和专业知识的可用性。这三种分离平台都具有广泛且重叠的合适代谢物范围，但局限性不同。简而言之，CE 只能分离带电分子，需要大量的专业知识才能对大量样品进行稳健分析4.GC 仅限于小且无极性的分子，足以在分解前蒸发3.考虑到所有市售的液相色谱柱，该技术可以分离任何两种代谢物5。然而，许多液相色谱方法的分辨能力低于类似长度的 CE 或 GC 方法。

代谢组学测量的典型起始材料量通常为每个样品 5 x 105 至 5 x 107 个细胞、5-50 mg 湿组织或 5-50 μL 体液6。然而，在处理稀有细胞类型的原代细胞（例如造血干细胞 （HSC） 或循环肿瘤细胞）时，获得如此数量的起始材料可能具有挑战性。这些细胞通常以非常低的数量存在，并且不能在不损害关键细胞特征的情况下进行培养。

造血干细胞和多能祖细胞 （MPP） 是造血系统中分化程度最低的细胞，在生物体的整个生命周期中不断产生新的血细胞。造血的调节在白血病和贫血等疾病中具有临床意义。尽管它们很重要，但 HSC 和 MPP 是造血系统中最稀有的细胞之一。通常，从单只小鼠中可以分离出大约 5000 个 HSC 7,8,9。由于传统的代谢组学方法需要更多的输入材料，因此通常需要混合来自多只小鼠的细胞来分析稀有细胞类型10,11。

在这里，我们旨在开发一种方案，能够测量每个样品中低至 5000 个细胞中的代谢物，以便能够从单只小鼠12 的 HSC 生成代谢组学数据。同时，这种方法允许从单个小鼠生成多个重复，以获得更丰富的细胞类型，如淋巴细胞。这种方法减少了给定项目所需的动物数量，从而有助于动物实验的“3R”（减少、替换、改进）。

细胞中的代谢物可以具有非常高的周转率，通常在秒级13.然而，制备用于荧光激活细胞分选 （FACS） 的样品可能需要数小时，而 FACS 分选本身可能需要几分钟到几小时，导致非生理条件导致代谢组的潜在改变。该方案中使用的一些试剂（如氯化铵钾[ACK]裂解缓冲液）可以具有类似的效果。这些条件会导致细胞应激并影响细胞内代谢物的水平和比率，导致细胞代谢测量不准确或有偏差 14,15,16。由于样品制备引起的代谢变化有时被称为分选伪影。从坚硬或坚韧的组织中生产单细胞悬浮液可能需要的长消化方案和刺激性试剂会加剧这个问题。可能发生的变化可能取决于细胞类型和处理条件。这些变化的确切性质仍然未知，因为无法测量活组织中未受干扰细胞的代谢状态。

与传统方法相比，这里介绍的方案涉及几个关键差异，即使用 5 g/L NaCl 作为鞘液，直接分选到提取缓冲液中，在亲水作用液相色谱-质谱 （HILIC-MS） 上进样大量样品，并利用靶向定量、严格使用内标和背景控制（图 1).该方案有可能在很大程度上保留细胞类型之间以及药物治疗和载体控制之间的差异12。即使对于培养的细胞，它也优于其他方法，例如更成熟的离心和手动去除上清液。但是，由于仍可能出现排序伪影，因此必须谨慎解释数据。尽管存在这种局限性，但该协议代表了代谢分析领域的重大改进，允许更准确和全面地测量稀有原代细胞的细胞代谢12。

在罕见的原代细胞中稳健地测量广泛代谢谱的能力为涉及这些细胞的生物医学研究的新实验打开了大门。例如，造血干细胞中代谢介导的调节已被证明会影响休眠自我更新能力，对贫血和白血病有影响11,17。在患者来源的循环肿瘤细胞中，肿瘤和邻近细胞之间代谢基因表达的差异已显示18,19。该协议现在允许研究人员在代谢水平上系统地研究这些差异，这通常被认为比基因表达更接近细胞表型。

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Protocol

根据地方当局（Regierungspräsidium Freiburg）的规定，用于该协议的所有小鼠的育种和饲养在马克斯·普朗克免疫生物学和表观遗传学研究所（MPI-IE）的常规动物设施中进行。FELASA B 训练有素的人员按照 MPI-IE 动物福利委员会和地方当局批准的指南和法规，用 CO2 和宫颈脱位对小鼠实施安乐死。没有进行动物实验，小鼠没有健康负担。

注：高灵敏度的分析方法，如本协议中使用的LC-MS方法，甚至有可能检测样品中非常轻微的污染。因此，尽量减少此类污染至关重要。最重要的措施是，每当接触与样品接触的任何东西时，都要戴上干净的手套。例如，这包括缓冲液和鞘液的制备、样品管的标记以及实验室设备的清洁。此外，应尽可能使用一次性实验室器皿。玻璃器皿在使用前应用LC-MS级溶剂冲洗。清洁的工作环境有助于减少污染。

1. 一般准备工作

  1. 制备内标储备液：在超纯水中制备 6 mg/mL 氯苯丙氨酸 （CLF） 和 6 mg/mL 氨基对苯二甲酸 （ATA） 的 30% v/v 2-丙醇溶液。
  2. 制备 FACS 重悬缓冲液：加入 0.9 g NaCl、99.5 mL 超纯水和 0.5 mL 内标储备溶液。预冷至4°C。
  3. 准备鞘液：在鞘液罐中，将 30 g NaCl 溶解在 6 L 去离子水中并连接到细胞分选仪。
    注意：鞘液中 NaCl 的浓度已经过优化，允许分选机中的液滴偏转，这与使用 PBS 作为鞘液时一样坚固，同时最大限度地减少对 LC-MS12 代谢物检测的负面影响。较低浓度的 NaCl 有利于代谢物检测，但会损害细胞的稳健分选。

2.从脾脏中分离B细胞和T细胞

  1. 将每只小鼠在冰箱或冰上预冷90 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）至4°C。 将离心机预冷至4°C。
  2. 脾脏隔离
    注：在细胞分离和以下染色步骤中，在冰上和冷（4°C）缓冲液中快速工作最为关键。否则，细胞的代谢特征可能会发生很大变化。
    1. 在冰上的 2 mL 反应管中制备 1.5 mL PBS。
    2. 根据地方当局批准的指南和方法对 C57BL6/J 小鼠实施安乐死。
    3. 用70%乙醇对毛皮进行消毒。
    4. 用剪刀打开腹部，用细镊子切除脾脏，不要破坏器官。立即将脾脏置于冷的PBS（4°C）中。
  3. 单细胞悬液的生成
    1. 将 70 μm 细胞过滤器放在 50 mL 离心管上并用 PBS 润湿。使用注射器柱塞的拇指托和30mL冷PBS（4°C）使脾脏通过网状物
    2. 以300× g 离心5分钟。除去上清液。
    3. 将沉淀重悬于1mLACK裂解缓冲液中，并在室温（RT;20°C）下孵育2分钟。
    4. 加入50mL冷PBS（4°C）。以300× g 离心5分钟，弃去上清液。
  4. 流式细胞仪染色
    1. 在每只小鼠500μL冷PBS（4°C）中制备抗体混合物：CD3-PE（1：200），B220-A647（1：200）。
    2. 将细胞沉淀重悬于抗体混合物中。转移到 5 mL FACS 管中。在4°C下在黑暗中孵育30分钟。
    3. 加入3mL冷PBS（4°C）。以300× g 离心5分钟，弃去上清液。
    4. 将细胞沉淀重悬于1mL冷FACS重悬缓冲液（4°C）中。通过过滤盖FACS管过滤细胞。细胞已准备好进行基于流式细胞术的分选。

3. 从骨髓中分离造血干细胞和MPP

  1. 解剖并分离骨髓。
    注意：在整个过程中，最重要的是快速工作并保持分离的骨骼和细胞低温（4°C），以获得准确的结果。此外，为了尽量减少背景信号，工作和使用洁净的空间和实验室设备。
    1. 根据地方当局批准的指南和方法对小鼠实施安乐死。
    2. 在小鼠的下部喷洒70%乙醇。
    3. 用剪刀解剖腿部和脊柱。在背部做一个切口，并将切口延伸到腹部。从后肢剥去皮肤。
    4. 撕掉或切断后肢，并确保腿部包含胫骨、股骨和髋关节。
    5. 拿起剪刀，将它们与脊柱一起剪紧，直到完全取下。
    6. 将腿和棘分布到含有冷PBS（4°C）的6孔板中，并将板保持在冰上。
    7. 使用手术刀和剪刀清洁股骨、胫骨、髋关节和软组织的椎骨。
    8. 用研钵压碎清洁的骨头，并在5mL冷PBS（4°C）中杵。
    9. 通过 40 μm 细胞过滤器将细胞悬液过滤到 50 mL 试管中。
    10. 重复步骤3.1.8-3.1.9，直到骨头完全变白。
  2. 红细胞裂解：
    1. 将收获的细胞悬浮液在4°C下以400× g 离心5分钟，弃去上清液。
    2. 将细胞沉淀重悬于1mL冷ACK缓冲液（4°C）中。在冰上孵育 5 分钟。
    3. 加入冷PBS（4°C）停止反应（可选）。
    4. 在4°C下以400× g 离心5分钟，弃去上清液。
  3. 谱系耗竭：
    注：为了富集谱系阴性 （Lin-） 细胞，使用了 CD4 细胞的阴性选择试剂盒。
    1. 准备磁珠：
      1. 将 500 μL 微珠加入 2 mL 微量离心管中。将试管放在磁铁上并丢弃上清液。
      2. 用1mL冷PBS（4°C）洗涤珠子并弃去上清液。
      3. 加入500μL冷PBS（4°C）并保持珠子低温（4°C）。
    2. 将细胞与500μL谱系混合物（试剂盒提供的50μL抗体+ 450μLPBS）在黑暗中孵育25分钟（振荡，4°C）。
    3. 用冷PBS（4°C）洗涤细胞。
    4. 将试管在4°C下以400× g 离心5分钟，弃去上清液。
    5. 将细胞重悬于1000μL冷PBS（4°C）中，并将细胞悬浮液转移到珠溶液中。
    6. 在4°C的旋转轮上孵育15分钟。
    7. 将试管放在磁铁上，等待溶液清除。将上清液转移到新鲜的FACS管中。
    8. 用 500 μL PBS 洗涤珠子。
    9. 将试管放在磁铁上，等待溶液清除。
    10. 将上清液转移到新鲜的FACS管中。
    11. 在4°C下以400× g 离心5分钟，弃去上清液。
  4. 流式细胞仪染色
    1. 在冷PBS（4°C）中制备每只小鼠300μL抗体混合物。
    2. 干细胞/祖细胞抗体混合物：HSC：CD4（1：1000）/ CD8a（1：1000）/ B220（1：1000）/ Ter119（1：500）/ Gr-1（1：1000）/ CD11b - PeCy7（1：1000）， c-Kit - PE（1：1000）， Sca1 - APC-Cy7（1：500）， CD48 - BV421（1：1000）， CD150 - BV605（1：300）
    3. 将细胞在4°C的黑暗中孵育40分钟。
    4. 用1mL冷PBS（4°C）洗涤。在4°C下以400× g 离心5分钟，弃去上清液。
    5. 将细胞沉淀重悬于 1 mL FACS 重悬缓冲液中，并通过过滤盖 FACS 管过滤细胞。

4. 流式细胞仪分类

  1. 设置细胞分选仪。
    1. 插入 70 μm 喷嘴尖端。激活 405 nm、488 nm、561 nm 和 633 nm 激光器。
    2. 将排序模式设置为 4 路纯度：产量掩码 0、纯度掩码 32、相位掩码 0
    3. 将下降频率设置为 90,400 Hz，并根据制造商的说明调整幅度和下降延迟。将板电压设置为 5000 V。
    4. 根据制造商的说明定义分拣门。
      1. 对于所有细胞类型，首先，根据前向散射和侧向散射信号选择单个细胞，然后根据细胞类型特异性染色进行选择。
      2. 对于 B 细胞，选择 AF647 阳性、PE 阴性细胞群。
      3. 对于 T 细胞，选择 PE 阳性、AF647 阴性细胞群。
      4. 对于 HSC，选择 PE-Cy7 低、PE 阳性、APC-Cy7 阳性、BV605 阳性、BV421 阴性群体。
      5. 对于 MPP，选择 PE-Cy7 低、PE 阳性、APC-Cy7 阳性、BV421 阳性、BV605 阴性群体。
      6. 对于碎片样本，根据前向散射和侧向散射信号选择太小而无法表示完整像元的事件。 图2 和 图3显示了这些门控策略的典型FACS图。
    5. 调整流速以获得小于 15,000 个事件/秒。
  2. 准备收集板
    1. 制备酵母提取物储备溶液：将 1 等分试样的 13C 酵母提取物重悬于 7.5 mL 超纯 H2O 和 2.5 mL 甲醇中。
    2. 制备提取缓冲液：将 10 μL 13C 酵母提取物储备溶液加入 10 mL 乙腈中并混合。
    3. 准备收集板：将 25 μL 提取缓冲液加入将用于收集样品的 96 孔 PCR 板的每个孔中。为了尽量减少蒸发，用PCR盖（切成单线的条纹）覆盖孔。
  3. 执行单元格排序。
    1. 根据需要打开收集孔以收集分选的细胞并尽快关闭它们以最大程度地减少蒸发。
  4. 如果样品不能立即测量，请将其储存在-80°C的密封容器中数天。解冻后，对样品进行超声处理5分钟，以确保代谢物完全重悬。

5. LC-QQQ-MS测量

  1. 制备液相色谱溶剂
    1. 制备甲膦酸储备溶液（100mM）：将17.6mg甲膦酸溶解在1mL超纯H2O中。
    2. 制备缓冲液 A：将 1.92 g 碳酸铵溶解在 1 L 超纯 H2O 中，并加入 50 μL 甲膦酸储备溶液。
    3. 制备缓冲液 B：将 50 mL 缓冲液与 450 mL 乙腈混合。
    4. 制备 LC 测试混合物：将亮氨酸、异亮氨酸、AMP、ADP 和 ATP 各 1 ppm 混合在 80：20 乙腈中：超纯 H2O。
      注意：甲膦酸原液可在-20°C下储存数月;其他缓冲液可在室温下保存 2 天。
  2. 程序 LC-QQQ-MS 方法
    1. 根据制造商的说明优化化合物特异性 MS 设置（例如，碰撞能量）。对于 Agilent 6495 系列仪器，请使用 补充表 1 中的设置。
    2. 根据制造商的说明优化特定于源的 MS 设置。对于带有 JetStream 加热 ESI 源的仪器，请使用以下参数：气体温度：240 °C，气体流量：15 L/min，雾化器：50 psi，护套气体温度：400 °C，护套气体流量：11 L/min，毛细管电压：2000 V，喷嘴电压：300 V。
    3. 根据制造商的说明优化离子转移光学器件的设置。对于配备 iFunnel 离子光学器件的安捷伦仪器，请使用以下参数：高压射频正极：110 V，高压射频负极：90 V，低压射频正极：80 V，低压射频负极：60 V。
    4. 对LC梯度进行编程：0 min，95% B，150 μL/min;18 min，55% B，150 μL/min;19 分钟，30% B，150 μL/min;21.5 min， 30% B， 150 μL/min;22 分钟，95% B，150 μL/min;22.7 分钟，95% B，200 μL/min，23.5 分钟，95% B，400 μL/min;停止时间 28 分钟柱温：35°C。
  3. 设置LC-MS仪器。
    1. 将色谱柱连接到温控柱室中。
    2. 连接缓冲区并清除所有线路。
    3. 运行至少 4 个空白样品或混合样品以平衡色谱柱。
  4. 运行LC测试混合物以检查色谱性能。确保满足以下条件。如果没有，请在运行样品之前清洁仪器或对仪器进行故障排除。
    1. 确认初始背压为 <150 bar，最大背压为 <400 bar。
    2. 确认保留时间在 ±1 分钟窗口内，如下所示：异亮氨酸 6.0 分钟、亮氨酸 6.4 分钟、AMP 9.5 分钟、ADP 11.2 分钟和 ATP 12.7 分钟。
    3. 确保 +132->86 过渡中亮氨酸和异亮氨酸之间的谷值<峰高的 20%。
    4. 确保 AMP 到 ADP 的保留时间差为 1.5 至 1.9 分钟，ADP 到 ATP 的保留时间差为 1.1 至 1.9 分钟。
  5. 设置工作清单
    1. 从空白样品开始，以尽量减少液相色谱测试混合物的残留。
    2. 以随机顺序运行样本。
    3. 以空白样品结束，以清洁色谱柱以备将来进行实验。

6. automRm 中的数据预处理

注意：以下步骤讨论了在 msconvert 中从 .d 到 .mzML 的转换、metabdb 的准备、数据和模型以及 metabdb 的加载，以及手动峰值审查的一般策略。

  1. 使用 ProteoWizard20 将原始数据从 .d 格式转换为 .mzML 格式，并设置如下：二进制编码精度：32 位，MS 级别 1-2，写入 索引 选择， 使用 zlib 压缩 选择。
  2. 启动 R。
  3. 根据软件包文档安装 automRm21 （首次使用前只需一次）。
  4. 在 R 中启动 automRm GUI：automRm：：automrm_gui（）
  5. 在“ 处理”>“处理批处理”选项卡中处理 .d 文件。
    1. 选择包含代谢物信息.xlsx文件。此文件必须与 LC-QQQ-MS 方法匹配。
    2. 选择。RData 文件保持峰值拾取 ML 模型。
    3. 选择。包含峰值报告 ML 模型的 RData 文件。
    4. 选择包含 .mzML 文件的项目文件夹。
    5. 通过单击 “处理批处理”开始数据预处理。
  6. 预处理完成后，打开peakoverview.pdf检查色谱峰的正确检测。或者，从 automRm GUI 的 Review 选项卡加载 automRmdata_Review.RData，以手动修改峰滤波和峰积分。
  7. 从项目文件夹中打开 peakinfo.xlsx 并检查数据。
    1. 检查标签13CArea中的13C内标信号：确保实验组之间以及细胞样品和碎片样品之间的强度值没有系统差异。如果存在此类差异，请仅使用 NormArea 或 NormHeight 选项卡中的数据进行后续分析;否则，请使用选项卡 RawArea 或 RawHeight 中的数据。
    2. 在 选项卡 RawArea 中检查内标 ATA 和 CLF 的信号强度。确保实验组之间任何一种化合物的强度都没有系统差异。
    3. 对于每种代谢物，将含有细胞的样品与来自同一细胞悬液的碎片样品的信号强度进行比较。使用适当的统计检验来识别含有细胞的样品比碎片样品具有更高强度的代谢物。在随后的数据分析中仅包括通过此测试的代谢物。

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Representative Results

FACS分选能够从同一细胞悬液中分离出不同细胞类型的干净细胞群（图2 和 图3）。该方法的特异性依赖于使用特定表面标记物（例如，来自脾脏的 B 细胞和 T 细胞）或表面标记物的特定组合（例如 HSC 和 MPP）对不同细胞类型进行染色。细胞内标志物的染色通常需要细胞膜的透化。这可能导致代谢物的泄漏，因此这种类型的染色不适合用于该方案。

LC可在MS检测之前分离代谢物（图4）。代谢物从HILIC柱中洗脱，大致按极性排序，早期洗脱的极性化合物较少，较晚洗脱的极性代谢物较晚。信号强度由样品中靶代谢物的量和代谢物特异性响应因子决定。因此，无法有意义地比较不同代谢物的信号强度，而只能比较样品中的一种代谢物。 图 4 中突出显示的 3 个峰代表 1：在碎片和细胞提取物中检测到烟酰胺，尽管水平不同，2：乙酰肉碱几乎只在细胞提取物中检测到，以及 3：在碎片样品和细胞提取物中检测到相同水平的内标氨基右苯甲酸。

使用组合的FACS-LC-MS方案保留来自同一组织的细胞类型之间的代谢差异（图5）。对于 HSC 和 MPP，需要来自 6 只小鼠的细胞产生 6 个样本，与从同一小鼠脾脏中分选的 B 细胞和 T 细胞相比，每组内的变异性更大。代表工艺空白对照样品的碎片样品与含有细胞提取物的样品明确分离。在碎片样本中，可以看到两个实验的清晰分离，突出了细胞在分类前所经历的代谢环境的差异。当在聚类热图中表示时（图6），其他信息变得可见，例如样品中代谢物的相对水平。

Figure 1
图 1：所提出协议的关键步骤概述。 此图经 Schoenberger 等人 12 许可转载。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图2：从脾脏中分离出纯B细胞和T细胞群。 根据前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）信号选择细胞和碎片事件。根据细胞类型特异性染色信号选择B细胞和T细胞。该图经 Schoenberger 等人许可改编12。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3：从骨髓中分离 HSC 和 MPP。 根据前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）信号选择细胞和碎片事件。根据细胞类型特异性染色信号的多个阶段选择 HSC 和 MPP 群体。该图经 Schoenberger 等人许可改编12。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图4：示例色谱图。 具有 （A） 5000 个 HSC 和 （B） 5000 个相同类别的碎片事件的样品。请注意，轴在两个面板中共享相同的刻度。突出的代谢物是 1：烟酰胺，2：乙酰肉碱，3：氨基对苯二甲酸 （ATA）。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5：来自相同实验的不同细胞类型和碎片背景样品的代谢谱的主成分分析 （PCA）。 观察到不同器官和来自任何器官的碎片背景样本之间存在重大分离。此外，细胞类型在每个器官的细胞内被明确区分。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6：表示在不同细胞类型和匹配背景对照样品（碎片）中测量的代谢物的热图。 缺失值用所有样品中相同代谢物的半最小值进行插补。为了绘图，每行中的数据分别归一化为最大值。 请点击这里查看此图的较大版本.

补充表1：该表列出了所选代谢物的化合物特异性设置，包括保留时间（RT）、极性（Pol）、母体m/z（Q1）、片段m/z（Q3）和碰撞能（CE）。请点击这里下载此文件。

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Discussion

使用该协议成功实施靶向代谢组学的最关键步骤是 1） 强大的染色和门控策略，将产生干净的细胞群 2） 精确处理液体体积，3） 所有实验步骤的可重复时间，特别是代谢物提取之前的所有步骤。理想情况下，属于一个实验的所有样品都应在一个批次中进行处理和测量，以尽量减少批次效应22。对于较大的实验，我们建议在-80°C下收集细胞提取物，然后在一个批次中测量所有提取物。

在处理低输入样品时，必须强调对实验过程中使用的所有材料进行清洁处理23.常见的污染物是残留缓冲液、洗涤剂和护肤品。尽量减少污染的最重要措施是在整个实验过程中使用合适的手套。

为了尽量减少由于细胞暴露于非生理条件而导致的代谢物组成的潜在改变，在冰上制备样品至关重要，并且使用冷试剂（4°C）至关重要。此外，在 FACS 步骤之前尽可能快地提高测量质量2.抗体染色的指示时间尽可能短，以获得良好的染色效率。在 FACS 染色程序24,25 之前，可以添加一个额外的步骤，以使用 Fc 阻断抗体阻断抗体与 Fc 受体的非特异性结合。这样可以防止靶细胞群受到污染，在处理包含许多 Fc 受体高细胞类型（如单核细胞或巨噬细胞）或无血清培养的细胞的细胞悬液时尤其可取。然而，它会使整体处理时间增加 10-15 分钟，因此可能会给结果增加额外的非生理变异性。

通过在现代质谱仪上使用动态MRM方法，只需一次进样即可记录化合物特异性设置中列出的所有代谢物。限制目标代谢物的数量允许在较旧的质谱仪上实施所述方案，并加速数据预处理和数据分析。

LC-MS数据中一定程度的背景信号是不可避免的。因此，必须非常小心地识别那些可以在背景上方检测到的代谢物。对太小而无法表示完整细胞（碎片）的分选事件会生成相关的过程空白样本，这些样品表示基质依赖性背景信号强度。此外，内部标准允许识别应从进一步数据分析中排除的问题样品26.如果有足够多的重复数据，这两种质量保证措施都效果最好。我们建议每组至少使用六个重复。

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Disclosures

作者声明没有利益冲突。

Acknowledgments

作者要感谢马克斯·普朗克免疫生物学和表观遗传学研究所的动物设施提供本研究中使用的动物。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
13C yeast extract Isotopic Solutions ISO-1
40 µm cell strainer Corning 352340
Acetonitrile, LC-MS grade VWR 83640.32
ACK lysis buffer Gibco 104921 Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E
Adenosine diphosphate (ADP) Sigma Aldrich A2754
Adenosine monophosphate (AMP) Sigma Aldrich A1752
Adenosine triphosphate (ATP) Sigma Aldrich A2383
Ammonium Carbonate, HPLC grade Fisher Scientific A/3686/50
Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) Waters 186009982
B220-A647 Invitrogen 103226
B220-PE/Cy7 BioLegend 103222 RRID:AB_313005
CD11b-PE/Cy7 BioLegend 101216 RRID:AB_312799
CD150-BV605 BioLegend 115927 RRID:AB_11204248
CD3-PE Invitrogen 12-0031-83
CD48-BV421 BioLegend 103428 RRID:AB_2650894
CD4-PE/Cy7 BioLegend 100422 RRID:AB_2660860
CD8a-PE/Cy7 BioLegend 100722 RRID:AB_312761
cKit-PE BioLegend 105808 RRID:AB_313217
Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit  Invitrogen 11415D
FACSAria III BD
Gr1-PE/Cy7 BioLegend 108416 RRID:AB_313381
Heat sealing foil Neolab Jul-18
Isoleucine Sigma Aldrich 58880
JetStream ESI Source Agilent G1958B
Leucine Sigma Aldrich L8000
Medronic acid Sigma Aldrich M9508-1G
Methanol, LC-MS grade Carl Roth HN41.2
NaCl Fluka 31434-1KG
PBS Sigma Aldrich D8537
Sca1-APC/Cy7 BioLegend 108126 RRID:AB_10645327
TER119-PE/Cy7 BioLegend 116221 RRID:AB_2137789
Triple Quadrupole Mass Spectrometer Agilent 6495B
Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted Eppendorf 30129512
UHPLC Autosampler Agilent G7157B
UHPLC Column Thermostat Agilent G7116B
UHPLC Pump Agilent G7120A
UHPLC Sample Thermostat Agilent G4761A

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References

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免疫学与感染，第204期，
罕见原代细胞的靶向代谢组学
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Glaser, K. M., Egg, M., Hobitz, S., Mitterer, M., Schain-Zota, D., Schönberger, K., Schuldes, K., Cabezas-Wallscheid, N., Lämmermann, T., Rambold, A., Buescher, J. M. Targeted Metabolomics on Rare Primary Cells. J. Vis. Exp. (204), e65690, doi:10.3791/65690 (2024).

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