Summary
여기에서는 희귀 세포 유형의 대사 산물을 정확하고 안정적으로 측정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 세포 분류를 위한 변형된 sheath 유체 및 관련 blank 샘플 생성을 포함한 기술 개선을 통해 샘플당 5000개의 세포만 입력하여 대사 산물을 포괄적으로 정량화할 수 있습니다.
Abstract
세포 기능은 신진대사에 결정적으로 의존하며, 저분자 중간체를 측정하여 기본 대사 네트워크의 기능을 연구할 수 있습니다. 그러나 특히 조혈모세포와 같은 희귀 세포 유형에서 세포 대사를 정확하고 신뢰할 수 있는 측정값으로 얻으려면 전통적으로 여러 동물의 세포를 통합해야 했습니다. 이제 프로토콜에 따라 연구자들은 샘플당 하나의 마우스만 사용하여 희귀 세포 유형의 대사 산물을 측정하는 동시에 더 풍부한 세포 유형에 대한 여러 복제를 생성할 수 있습니다. 이렇게 하면 지정된 프로젝트에 필요한 동물의 수가 줄어듭니다. 여기에 제시된 프로토콜은 5g/L NaCl을 외피 유체로 사용하고, 아세토니트릴로 직접 분류하고, 내부 표준물질을 엄격하게 사용하여 표적 정량을 활용하는 등 기존 대사체학 프로토콜에 비해 몇 가지 주요 차이점을 포함하고 있어 세포 대사를 보다 정확하고 포괄적으로 측정할 수 있습니다. 단일 세포의 분리, 형광 염색 및 분류에 필요한 시간에도 불구하고 프로토콜은 세포 유형 및 약물 처리 간의 차이를 상당 부분 보존할 수 있습니다.
Introduction
신진대사는 모든 살아있는 세포에서 발생하는 필수적인 생물학적 과정입니다. 대사 과정에는 밀접하게 조절되고 상호 연결된 방대한 생화학 반응 네트워크가 포함되며, 이를 통해 세포는 에너지를 생산하고 필수 생체 분자를 합성할 수 있습니다1. 대사 네트워크의 기능을 이해하기 위해 연구자들은 세포 내 저분자 중간체의 수준을 측정합니다. 이러한 중간체는 대사 활동의 중요한 지표 역할을 하며 세포 기능에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
질량분석법(MS)은 복잡한 시료 1,2에서 대사 산물의 특이적 검출을 위해 가장 널리 사용되는 선택입니다. 핵 자기 공명(NMR)은 화합물의 절대 정량화 및 구조 규명에 장점이 있지만, MS는 종종 생체 유체 또는 세포 추출물과 같은 복잡한 혼합물에서 더 많은 성분을 분해할 수 있습니다. MS는 모세관 전기영동(CE), 가스 크로마토그래피(GC) 또는 액체 크로마토그래피(LC)에 의한 화합물의 사전 분리와 결합되는 경우가 많습니다3. 분리 플랫폼의 선택은 대부분 표적 대사 산물의 범위와 시료 유형에 따라 결정되며, 실제 환경에서는 기계 및 전문 지식의 가용성에 따라 결정됩니다. 세 가지 분리 플랫폼 모두 광범위하고 겹치는 범위의 적합한 대사 산물을 가지고 있지만 한계는 다릅니다. 간단히 말해서, CE는 하전 분자만 분리할 수 있으며 많은 수의 샘플에 대한 강력한 분석을 구현하려면 많은 전문 지식이 필요합니다4. GC는 분해되기 전에 증발할 수 있을 만큼 작고 무극성인 분자로 제한됩니다3. 상업적으로 이용 가능한 모든 LC 컬럼을 고려할 때, 임의의 두 대사 산물은 이 기술로 분리될 수 있다5. 그러나 많은 LC 분석법은 길이가 비슷한 CE 또는 GC 분석법보다 분해능이 떨어집니다.
대사체학 측정을 위한 출발 물질의 일반적인 양은 일반적으로 샘플당 5 x 105 내지 5 x 107 세포, 5-50 mg의 습윤 조직 또는 5-50 μL의 체액6 범위이다. 그러나 조혈모세포(HSC) 또는 순환 종양 세포와 같은 희귀 세포 유형의 일차 세포를 다룰 때 이러한 양의 시작 물질을 얻는 것은 어려울 수 있습니다. 이러한 세포는 종종 매우 적은 수로 존재하며 중요한 세포 기능을 손상시키지 않고는 배양할 수 없습니다.
HSC와 다분화능 전구세포(MPP)는 조혈계에서 가장 분화가 적은 세포이며 유기체의 일생 동안 지속적으로 새로운 혈액 세포를 생성합니다. 조혈의 조절은 백혈병 및 빈혈과 같은 상태에서 임상적으로 관련이 있습니다. 그 중요성에도 불구하고 HSC와 MPP는 조혈계 내에서 가장 희귀한 세포 중 하나입니다. 단일 마우스에서 일반적으로 약 5000개의 HSC를 분리할 수 있습니다 7,8,9. 전통적인 대사체학 방법은 더 많은 투입 물질을 필요로 하기 때문에 희귀 세포 유형을 분석하기 위해 여러 마우스의 세포를 풀링하는 것이 종종 필요했습니다10,11.
여기에서, 우리는 단일 마우스(12)의 HSC로부터 대사체학 데이터를 생성할 수 있도록 샘플당 5000개 세포만큼 작은 세포에서 대사체의 측정을 가능하게 하는 프로토콜을 개발하는 것을 목표로 하였다. 동시에 이 방법을 사용하면 림프구와 같은 더 풍부한 세포 유형에 대해 단일 마우스에서 여러 복제를 생성할 수 있습니다. 이 접근 방식은 주어진 프로젝트에 필요한 동물의 수를 줄여 동물 실험의 "3R"(축소, 대체, 개선)에 기여합니다.
세포의 대사 산물은 종종 초13 정도로 매우 높은 회전율을 가질 수 있습니다. 그러나 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 위한 시료 준비는 몇 시간이 걸릴 수 있으며, FACS 분류 자체는 몇 분에서 몇 시간이 걸릴 수 있으므로 비생리학적 조건으로 인해 대사체에 잠재적인 변화가 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 일부 시약(예: 암모늄-클로라이드-칼륨[ACK] 용해 완충액)은 유사한 효과를 가질 수 있습니다. 이러한 조건은 세포 스트레스를 유발하고 세포 내 대사 산물의 수준과 비율에 영향을 미쳐 세포 대사의 부정확하거나 편향된 측정으로 이어질 수 있습니다 14,15,16. 시료 전처리로 인한 대사 변화는 때때로 분류 아티팩트(sorting artifact)라고 합니다. 단단하거나 질긴 조직에서 단세포 현탁액을 생성하는 데 필요할 수 있는 긴 분해 프로토콜과 가혹한 시약은 이 문제를 악화시킬 수 있습니다. 발생할 수 있는 변화는 셀 유형 및 처리 조건에 따라 달라질 수 있습니다. 변화의 정확한 성질은 살아있는 조직에서 방해받지 않은 세포의 대사 상태를 측정할 수 없기 때문에 알려지지 않았습니다.
여기에 제시된 프로토콜은 기존 방법과 비교하여 몇 가지 주요 차이점, 즉 5g/L NaCl을 피복 유체로 사용, 추출 완충액으로 직접 분류, 친수성 상호 작용 액체 크로마토그래피-질량분석법(HILIC-MS)에 대량의 시료 주입, 표적 정량 활용, 내부 표준물질 및 백그라운드 제어의 엄격한 사용(그림 1)). 이 프로토콜은 세포 유형 간, 그리고 약물 처리와 차량 제어 사이의 차이를 상당 부분 보존할 수 있는 잠재력을 가지고 있다12. 배양된 세포의 경우에도 보다 확립된 원심분리 및 상층액의 수동 제거와 같은 대체 접근 방식과 유리하게 비교됩니다. 그러나 정렬 아티팩트가 계속 발생할 수 있으므로 데이터를 주의해서 해석해야 합니다. 이러한 한계에도 불구하고, 이 프로토콜은 대사 프로파일링 분야에서 상당한 개선을 나타내며, 희귀 일차 세포에서 세포 대사를 보다 정확하고 포괄적으로 측정할 수 있게 한다12.
희귀 일차 세포에서 광범위한 대사 프로파일을 강력하게 측정할 수 있는 능력은 이러한 세포와 관련된 생물 의학 연구의 새로운 실험의 문을 열어줍니다. 예를 들어, HSC의 대사 매개 조절은 빈혈 및 백혈병에 대한 영향과 함께 휴면 자가 재생 능력에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다11,17. 환자 유래 순환 종양 세포에서 종양과 인접 세포 간의 대사 유전자 발현의 차이가18,19로 나타났습니다. 이 프로토콜을 통해 연구자들은 일반적으로 유전자 발현보다 세포 표현형에 더 가까운 것으로 간주되는 대사 수준에서 이러한 차이를 체계적으로 연구할 수 있습니다.
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Protocol
이 프로토콜에 사용된 모든 마우스의 번식 및 사육은 지역 당국(Regierungspräsidium Freiburg)의 규정에 따라 막스 플랑크 면역생물학 및 후성유전학 연구소(MPI-IE)의 기존 동물 시설에서 수행되었습니다. 마우스는 MPI-IE의 동물 복지 위원회와 지역 당국이 승인한 지침 및 규정에 따라 FELASA B 교육을 받은 직원에 의해 CO2 및 자궁 경부 탈구로 안락사되었습니다. 동물 실험은 실시되지 않았으며, 생쥐는 건강에 대한 부담이 없었다.
참고: 이 프로토콜에 사용된 LC-MS 분석법과 같은 고감도 분석 방법은 샘플에서 매우 작은 오염도 검출할 수 있습니다. 따라서 이러한 오염을 최소화하는 것이 가장 중요합니다. 가장 중요한 조치는 샘플과 접촉하는 모든 것을 만질 때마다 깨끗한 장갑을 착용하는 것입니다. 여기에는 예를 들어 완충액 및 피복 유체 준비, 시료 튜브 라벨링 및 실험실 장비 세척이 포함됩니다. 또한 가능하면 일회용 실험기구를 사용해야 합니다. 유리 제품은 사용하기 전에 LC-MS 등급 용매로 헹궈야 합니다. 깨끗한 작업 환경은 오염을 줄이는 데 도움이 됩니다.
1. 일반적인 준비
- 내부 표준 원액 준비: 초순수에서 6mg/mL 클로로-페닐알라닌(CLF) 및 6mg/mL 아미노테레프탈산(ATA)을 30% v/v 2-프로판올로 준비합니다.
- FACS 재현탁액 준비: NaCl 0.9g, 초순수 99.5mL, 내부 표준물질 원액 0.5mL를 추가합니다. 4 °C로 예열하십시오.
- 시스 유체 준비: 시스 유체 탱크에서 30L의 탈이온수에 NaCl 6g을 녹이고 세포 분류기에 연결합니다.
참고: 시스 유체의 NaCl 농도는 PBS를 시스 유체로 사용할 때와 마찬가지로 강력한 선별기에서 액적의 편향을 허용하고 동시에 LC-MS12에 의한 대사 산물 검출에 대한 부정적인 영향을 최소화하도록 최적화되었습니다. 낮은 농도의 NaCl은 대사 산물 검출에 유리하지만 세포의 강력한 분류를 손상시킵니다.
2. 비장에서 B 세포와 T 세포의 분리
- 생쥐당 90mL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 냉장고 또는 얼음 위에서 4°C로 사전 냉각합니다. 원심분리기를 4°C로 사전 냉각합니다.
- 비장의 격리
참고: 세포 분리 및 다음 염색 단계에서 얼음 위에서, 그리고 차가운(4°C) 완충액을 사용하여 빠르게 작업하는 것이 가장 중요합니다. 그렇지 않으면 세포의 대사 프로필이 크게 바뀔 수 있습니다.- 얼음 위의 2mL 반응 튜브에 PBS 1.5mL를 준비합니다.
- 지역 당국에서 승인한 지침과 방법에 따라 C57BL6/J 마우스를 안락사시킵니다.
- 70% 에탄올로 모피를 살균하십시오.
- 가위로 복부를 열고 장기를 파열시키지 않고 미세한 집게를 사용하여 비장을 제거합니다. 즉시 비장을 차가운 PBS(4°C)에 놓습니다.
- single-cell suspension의 생성
- 50mL 원심분리기 튜브에 70μm 셀 스트레이너를 놓고 PBS로 적십니다. 주사기 플런저의 엄지 받침대와 30mL의 차가운 PBS(4°C)를 사용하여 메쉬를 통해 비장을 통과시킵니다.
- 300 x g 에서 5분 동안 원심분리기 상층액을 제거합니다.
- 펠릿을 1mL의 ACK 용해 완충액에 재현탁시키고 실온(RT, 20°C)에서 2분 동안 배양합니다.
- 50mL의 차가운 PBS(4°C)를 추가합니다. 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
- FACS 염색
- 마우스당 500μL의 저온 PBS(4°C)로 항체 칵테일을 준비합니다: CD3-PE(1:200), B220-A647(1:200).
- 항체 칵테일에 세포 펠릿을 재현탁시킵니다. 5mL FACS 튜브로 옮깁니다. 어두운 곳에서 4 °C에서 30분 동안 배양합니다.
- 3mL의 차가운 PBS(4°C)를 추가합니다. 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
- 세포 펠릿을 1mL의 저온 FACS 재현탁 완충액(4°C)에 재현탁시킵니다. 필터 캡 FACS 튜브를 통해 세포를 여과합니다. 세포는 유세포 분석 기반 분류를 위한 준비가 되었습니다.
3. 골수에서 HSC 및 MPP의 분리
- 골수를 절개하고 분리합니다.
알림: 정확한 결과를 얻으려면 전체 절차 동안 빠르게 작업하고 격리된 뼈와 세포를 차갑게(4°C) 유지하는 것이 가장 중요합니다. 또한 배경 신호를 최소화하려면 깨끗한 공간과 실험실 장비를 작업하고 사용하십시오.- 지역 당국이 승인한 지침과 방법에 따라 쥐를 안락사시킵니다.
- 생쥐의 아랫부분에 70% 에탄올을 뿌립니다.
- 가위를 사용하여 다리와 척추를 해부하십시오. 등을 절개하고 상처 부위를 복부까지 확장합니다. 뒷다리의 피부를 벗겨냅니다.
- 뒷다리를 찢거나 자르고 다리에 경골, 대퇴골 및 고관절이 포함되어 있는지 확인하십시오.
- 가위를 잡고 완전히 제거될 때까지 척추를 따라 가깝게 자릅니다.
- 다리와 척추를 차가운 PBS(6°C)가 들어 있는 4웰 플레이트에 분배하고 플레이트를 얼음 위에 유지합니다.
- 메스와 가위를 사용하여 대퇴골, 경골, 고관절 및 연조직의 척추뼈를 청소합니다.
- 5mL의 차가운 PBS(4°C)에서 절구와 유봉으로 세척한 뼈를 으깬다.
- 40μm 셀 스트레이너를 통해 셀 현탁액을 50mL 튜브로 여과합니다.
- 뼈가 완전히 하얗게 나타날 때까지 3.1.8-3.1.9단계를 반복합니다.
- 적혈구의 용해:
- 수확한 세포 현탁액을 400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
- 세포 펠릿을 1mL의 저온 ACK 완충액(4°C)에 재현탁시킵니다. 얼음 위에서 5분간 배양합니다.
- 차가운 PBS(4°C)를 추가하여 반응을 중지합니다(선택 사항).
- 400 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
- 혈통 고갈:
참고: 계통 음성(Lin-) 세포를 농축하기 위해 CD4 세포용 음성 선택 키트를 사용했습니다.- 마그네틱 비드를 준비합니다.
- 500μL의 비드를 2mL 마이크로 원심분리기 튜브에 추가합니다. 튜브를 자석에 놓고 상층액을 버립니다.
- 1mL의 차가운 PBS(4°C)로 비드를 세척하고 상층액을 버립니다.
- 500μL의 차가운 PBS(4°C)를 추가하고 비드를 차갑게(4°C) 유지합니다.
- 어두운 곳에서 500μL의 리니지 칵테일(키트에서 제공하는 항체 50μL + PBS 450μL)로 세포를 25분(진탕, 4°C) 동안 배양합니다.
- 차가운 PBS(4°C)로 셀을 세척합니다.
- 400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 튜브를 원심분리하고 상층액을 버립니다.
- 1000μL의 차가운 PBS(4°C)에 세포를 재현탁시키고 세포 현탁액을 비드 용액으로 옮깁니다.
- 4°C의 회전하는 바퀴에서 15분 동안 배양합니다.
- 튜브를 자석에 놓고 용액이 맑아질 때까지 기다립니다. 상층액을 새 FACS 튜브로 옮깁니다.
- 500μL의 PBS로 비드를 세척합니다.
- 튜브를 자석에 놓고 용액이 맑아질 때까지 기다립니다.
- 상층액을 새 FACS 튜브로 옮깁니다.
- 400 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
- 마그네틱 비드를 준비합니다.
- FACS를 위한 염색
- 저온 PBS(4°C)에서 마우스당 300μL의 항체 혼합물을 준비합니다.
- 줄기세포/전구세포용 항체믹스: HSC: CD4(1:1000)/ CD8a(1:1000)/ B220(1:1000)/ Ter119(1:500)/ Gr-1(1:1000)/ CD11b - PeCy7(1:1000), c-Kit - PE(1:1000), Sca1 - APC-Cy7(1:500), CD48 - BV421(1:1000), CD150 - BV605(1:300)
- 4°C의 어두운 곳에서 40분 동안 세포를 배양합니다.
- 1mL의 차가운 PBS(4°C)로 세척합니다. 400 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
- 세포 펠릿을 1mL의 FACS 재현탁 완충액에 재현탁시키고 필터 캡 FACS 튜브를 통해 세포를 여과합니다.
4. FACS 분류
- 셀 정렬기를 설정합니다.
- 70μm 노즐 팁을 삽입합니다. 405nm, 488nm, 561nm, 633nm 레이저를 활성화합니다.
- 정렬 모드를 4 Way Purity로 설정: 수율 마스크 0, 순도 마스크 32, 위상 마스크 0
- 드롭 주파수를 90,400Hz로 설정하고 제조업체의 지침에 따라 진폭과 드롭 지연을 조정합니다. 플레이트 전압을 5000V로 설정합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 분류 게이트를 정의합니다.
- 모든 세포 유형에 대해 먼저 전방 산란 및 측면 산란 신호에 따라 단일 세포를 선택한 다음 세포 유형별 염색을 기반으로 선택합니다.
- B 세포의 경우 AF647 양성, PE 음성 모집단을 선택합니다.
- T 세포의 경우 PE 양성, AF647 음성 모집단을 선택합니다.
- HSC의 경우 PE-Cy7-낮음, PE-양성, APC-Cy7-양성, BV605-양성, BV421-음성 모집단을 선택합니다.
- MPP의 경우 PE-Cy7-낮음, PE-양성, APC-Cy7-양성, BV421-양성, BV605-음성, 모집단을 선택합니다.
- 파편 샘플의 경우, 너무 작아서 전방 산란 및 측면 산란 신호를 기반으로 온전한 세포를 나타낼 수 없는 이벤트를 선택합니다. 이러한 게이팅 전략을 보여주는 일반적인 FACS 플롯은 그림 2 와 그림 3에 나와 있습니다.
- 15,000 events/s 미만을 얻도록 유속을 조정합니다.
- 수집 플레이트 준비
- 효모 추출물 원액 준비: 13C효모 추출물 1분취액을 7.5mL의 초순수 H2O및 2.5mL의 메탄올에 재현탁시킵니다.
- 추출 완충액 준비: 10μL의 13C효모 추출물 원액을 10mL의 아세토니트릴에 넣고 혼합합니다.
- 수집 플레이트 준비: 검체를 수집하는 데 사용할 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 추출 완충액 25μL를 추가합니다. 증발을 최소화하려면 PCR 뚜껑(줄무늬가 단일항으로 자른 것)으로 웰을 덮습니다.
- 셀 정렬을 수행합니다.
- 분류된 세포를 수집하기 위해 필요에 따라 수집 웰을 열고 증발을 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 닫습니다.
- 샘플을 즉시 측정할 수 없는 경우 -80°C의 밀봉된 용기에 며칠 동안 보관하십시오. 해동 후 대사 산물의 완전한 재현탁을 보장하기 위해 5 분 동안 샘플을 초음파 처리합니다.
5. LC-QQQ-MS 측정
- LC 용매 준비
- 메드론산 원액(100mM) 준비: 메드론산 17.6mg을 초순수 H2O1mL에 녹입니다.
- 완충액 A 제조: 탄산암모늄 1.92g을 초순수 H2O1L에 녹이고 메드론산 원액 50μL를 첨가합니다.
- 완충액 B 준비: 완충액 50mL와 아세토니트릴 450mL를 혼합합니다.
- LC 테스트 믹스 준비: 류신, 이소류신, AMP, ADP 및 ATP를 각각 1ppm씩 80:20 아세토니트릴: 초순수 H2O로 혼합합니다.
참고: 메드론산 스톡은 -20°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다. 다른 버퍼는 2일 동안 RT에 보관할 수 있습니다.
- LC-QQQ-MS 방법 프로그래밍
- 제조업체의 지침에 따라 화합물별 MS 설정(예: 충돌 에너지)을 최적화합니다. Agilent 6495 시리즈 기기의 경우 보충 표 1의 설정을 사용하십시오.
- 제조업체의 지침에 따라 소스별 MS 설정을 최적화합니다. JetStream 가열식 ESI 소스가 있는 기기의 경우 가스 온도: 240 °C, 가스 유량: 15 L/min, 분무기: 50 psi, 시스 가스 온도: 400 °C, 시스 가스 유량: 11 L/min, 모세관 전압: 2000 V, 노즐 전압: 300 V.
- 제조업체의 지침에 따라 이온 전달 광학 장치의 설정을 최적화합니다. iFunnel 이온 광학을 사용하는 애질런트 기기의 경우 고압 RF 포지티브: 110V, 고압 RF 네거티브: 90V, 저압 RF 포지티브: 80V, 저압 RF 네거티브: 60V 파라미터를 사용하십시오.
- LC 그래디언트 프로그래밍: 0분, 95% B, 150μL/분; 18분, 55% B, 150μL/분; 19분, 30% B, 150μL/분; 21.5분, 30% B, 150μL/분; 22분, 95% B, 150μL/분; 22.7 분, 95 % B, 200 μL / 분, 23.5 분, 95 % B, 400 μL / 분; 정지 시간 28 분. 컬럼 온도: 35°C.
- LC-MS 기기를 설정합니다.
- 크로마토그래피 컬럼을 온도 제어 컬럼 컴파트먼트에 연결합니다.
- 버퍼를 연결하고 모든 줄을 제거합니다.
- 최소 4개의 빈 샘플을 실행하거나 샘플을 풀하여 컬럼을 평형화합니다.
- LC 테스트 믹스를 실행하여 크로마토그래피 성능을 확인합니다. 다음 기준이 충족되는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 샘플을 실행하기 전에 기기를 청소하거나 문제를 해결하십시오.
- 초기 배압이 <150bar이고 최대 배압이 <400bar인지 확인합니다.
- 머무름 시간이 이소류신 6.0분, 류신 6.4분, AMP 9.5분, ADP 11.2분, ATP 12.7분과 같이 ±1분 범위인지 확인합니다.
- +132->86 전이에서 류신과 이소류신 사이의 골짜기가 피크 높이의 20%< 있는지 확인합니다.
- AMP에서 ADP로의 머무름 시간 차이는 1.5분에서 1.9분으로, ADP에서 ATP로의 머무름 시간 차이는 1.1분에서 1.9분으로 설정합니다.
- 작업 목록 설정
- LC 테스트 혼합물의 캐리오버를 최소화하기 위해 빈 샘플로 시작합니다.
- 샘플을 무작위 순서로 실행합니다.
- 향후 실험을 위해 컬럼을 청소하기 위해 빈 샘플로 끝납니다.
6. automRm에서 데이터 전처리
참고: 다음 단계에서는 msconvert에서 .d에서 .mzML로의 변환, metabdb 준비, 데이터 및 모델 및 metabdb 로드, 수동 피크 검토를 위한 일반적인 전략에 대해 설명합니다.
- 바이너리 인코딩 정밀도: 32비트, MS 레벨 1-2, 쓰기 인덱스 선택, zlib 압축 사용 선택 설정과 함께 ProteoWizard20을 사용하여 원시 데이터를 .d 형식에서 .mzML 형식으로 변환합니다.
- R을 시작합니다.
- 패키지 설명서에 따라 automRm21 을 설치합니다(처음 사용하기 전에 한 번만 필요).
- R에서 automRm GUI 시작: automRm::automrm_gui()
- Process > Process Batch(일괄 처리 탭)에서 .d 파일의 배치를 처리합니다.
- 대사 산물 정보를 담고 있는 .xlsx 파일을 선택합니다. 이 파일은 LC-QQQ-MS 방법과 일치해야 합니다.
- 고르다. 피크 피킹 ML 모델을 보유하는 RData 파일.
- 고르다. 피크 보고 ML 모델을 포함하는 RData 파일입니다.
- .mzML 파일이 포함된 프로젝트 폴더를 선택합니다.
- 일괄 처리(Process Batch)를 클릭하여 데이터 전처리를 시작합니다.
- 전처리가 완료된 후 peakoverview.pdf 열어 크로마토그래피 피크가 올바르게 검출되는지 확인합니다. 선택적으로 automRm GUI의 Review 탭에서 automRmdata_Review.RData를 로드하여 피크 필터링 및 피크 적분을 수동으로 수정합니다.
- 프로젝트 폴더에서 peakinfo.xlsx 열고 데이터를 확인합니다.
- 탭 13CArea에서 13C내부 표준 신호 확인: 실험 그룹 간 및 세포 샘플과 파편 샘플 간의 강도 값에 체계적인 차이가 없는지 확인합니다. 이러한 차이가 있는 경우 후속 분석을 위해 NormArea 또는 NormHeight 탭의 데이터만 사용합니다. 그렇지 않으면 RawArea 또는 RawHeight 탭의 데이터를 사용합니다.
- RawArea 탭에서 내부 표준 ATA 및 CLF의 신호 강도를 확인합니다. 실험 그룹 간에 두 화합물의 강도에 체계적인 차이가 없는지 확인합니다.
- 각 대사 산물에 대해 세포를 포함하는 샘플의 신호 강도를 동일한 세포 현탁액의 파편 샘플과 비교합니다. 적절한 통계적 검정을 사용하여 세포를 포함하는 샘플이 파편 샘플보다 강도가 높은 대사 산물을 식별합니다. 후속 데이터 분석에서 이 테스트를 통과한 대사 산물만 포함하십시오.
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Representative Results
FACS 분류를 통해 동일한 세포 현탁액에서 서로 다른 세포 유형의 깨끗한 집단을 분리할 수 있습니다(그림 2 및 그림 3). 이 방법의 특이성은 특정 표면 마커(예: 비장의 B 세포 및 T 세포) 또는 표면 마커의 특정 조합(예: HSC 및 MPP)을 사용한 다양한 세포 유형의 염색에 따라 달라집니다. 세포 내 마커의 염색에는 일반적으로 세포막의 투과화가 필요합니다. 이로 인해 대사 산물이 누출될 수 있으므로 이러한 유형의 염색은 이 프로토콜에 사용하기에 적합하지 않습니다.
LC는 MS에 의해 검출되기 전에 대사 산물의 분리를 제공합니다(그림 4). 대사 산물은 극성에 따라 대략적으로 분류된 HILIC 컬럼에서 용리되며, 극성이 적은 화합물은 초기에 용리되고 극성 대사 산물은 나중에 용리됩니다. 신호 강도는 시료 내 표적 대사 산물의 양과 대사 산물 특이적 반응 인자에 의해 결정됩니다. 결과적으로, 신호 강도는 대사 산물 간에 의미 있게 비교할 수 없으며 샘플 전체에 걸쳐 하나의 대사 산물에 대해서만 비교할 수 있습니다. 그림 4 에서 강조 표시된 3개의 피크는 1: 나이아신아마이드는 파편과 세포 추출물 모두에서 검출되며, 2: 세포 추출물에서 거의 독점적으로 검출되는 아세틸-카르니틴, 3: 파편 샘플과 세포 추출물에서 동일한 수준으로 검출되는 내부 표준 아미노테레파탈산을 나타냅니다.
동일한 조직의 세포 유형 간 대사 차이는 결합된 FACS-LC-MS 프로토콜을 사용하여 보존됩니다(그림 5). HSC 및 MPP의 경우 6마리의 마우스에서 채취한 세포를 사용하여 6개의 샘플을 생성해야 했으며, 이는 동일한 쥐 비장에서 분류된 B 세포 및 T 세포에 비해 각 그룹 내에서 더 큰 변동성을 초래했습니다. 공정 블랭크 대조군 시료를 나타내는 파편 시료는 세포 추출물이 포함된 시료와 명확하게 분리됩니다. 파편 샘플 내에서 두 실험의 명확한 분리를 볼 수 있으며, 이는 정렬 전에 세포가 경험하는 대사 환경의 차이를 강조합니다. 클러스터링된 히트맵(그림 6)으로 표시하면 시료 전반에 걸친 대사 산물의 상대적 수준과 같은 추가 정보를 볼 수 있습니다.
그림 1: 제시된 프로토콜의 주요 단계 개요. 이 그림은 Schoenberger et al.12의 허가를 받아 재인쇄되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 비장에서 B 세포와 T 세포의 순수 집단 분리. 세포 및 파편 이벤트는 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC) 신호를 기반으로 선택되었습니다. B 세포와 T 세포는 세포 유형별 염색 신호에 따라 선택되었습니다. 이 그림은 Schoenberger et al.12의 허가를 받아 각색되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 골수에서 HSC 및 MPP의 분리. 세포 및 파편 이벤트는 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC) 신호를 기반으로 선택되었습니다. HSC 및 MPP 집단은 세포 유형별 염색 신호의 여러 단계를 기반으로 선택되었습니다. 이 그림은 Schoenberger et al.12의 허가를 받아 각색되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 크로마토그램의 예. 동일한 종류의 (A) 5000개의 HSC 및 (B) 5000개의 파편 이벤트가 있는 샘플. 축은 두 패널에서 동일한 배율을 공유합니다. 강조된 대사 산물은 1: 니코틴아미드, 2: 아세틸-카르니틴, 3: 아미노테레프탈산(ATA)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 동일한 실험에서 다양한 세포 유형 및 파편 배경 샘플의 대사 프로파일에 대한 주성분 분석(PCA). 다른 장기와 모든 장기의 파편 배경 샘플 사이에서 주요 분리가 관찰됩니다. 또한 각 장기의 세포 내에서 세포 유형이 명확하게 구분되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 다양한 세포 유형에서 측정된 대사 산물과 일치하는 배경 대조군 샘플(파편)을 나타내는 히트맵. 결측값은 모든 샘플에서 동일한 대사산물의 절반 최소값으로 귀속되었습니다. 플로팅을 위해 데이터는 모든 행에서 개별적으로 최대값으로 정규화되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 표에는 머무름 시간(RT), 극성(Pol), 전구체 m/z(Q1), 단편 m/z(Q3) 및 충돌 에너지(CE)를 포함하여 선택한 대사 산물에 대한 화합물별 설정이 나열되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜을 사용하여 표적 대사체학을 성공적으로 구현하기 위한 가장 중요한 단계는 1) 깨끗한 세포 집단을 산출하는 강력한 염색 및 게이팅 전략, 2) 액체 부피의 정확한 처리, 3) 모든 실험 단계, 특히 대사체 추출 전 모든 단계의 재현 가능한 타이밍입니다. 이상적으로는, 하나의 실험에 속하는 모든 샘플은 배치 효과를 최소화하기 위해 하나의 배치로 처리되고 측정되어야 한다22. 대규모 실험의 경우 -80°C에서 세포 추출물을 수집한 다음 모든 추출물을 한 배치로 측정하는 것이 좋습니다.
저투입 시료로 작업할 때는 실험 과정에서 사용되는 모든 재료를 깨끗하게 취급하는 것이 강조되어야 합니다23. 일반적인 오염은 잔류 완충제, 세제 및 스킨 케어 제품입니다. 오염을 최소화하기 위한 가장 중요한 조치는 실험 전반에 걸쳐 적절한 장갑을 사용하는 것입니다.
세포가 비생리적 조건에 노출되어 대사 산물 조성의 잠재적인 변화를 최소화하려면 얼음과 차가운 시약(4°C)으로 샘플을 준비하는 것이 중요합니다. 또한 FACS 단계 전에 가능한 한 빨리 측정하면 측정 품질이 향상됩니다2. 항체 염색을 위해 표시된 시간은 우수한 염색 효율을 위해 합리적으로 짧습니다. Fc-블록 항체를 사용하여 Fc 수용체에 대한 항체의 비특이적 결합을 차단하기 위한 추가 단계는 FACS 염색 절차24,25 전에 추가될 수 있다. 이는 표적 세포 집단의 오염을 방지하며, 많은 Fc 수용체 고세포 유형(예: 단핵구 또는 대식세포) 또는 혈청 없이 배양된 세포를 포함하는 세포 현탁액으로 작업할 때 특히 권장됩니다. 그러나 전체 처리 시간이 10-15분 증가하므로 결과에 비생리학적 변동성이 추가될 수 있습니다.
최신 질량분석기에서 동적 MRM 분석법을 사용하면 화합물별 설정에 나열된 모든 대사 산물을 한 번의 주입으로 기록할 수 있습니다. 표적 대사 산물의 수를 제한하면 구형 질량 분석기에서 설명된 프로토콜을 구현할 수 있으며 데이터 전처리 및 데이터 분석을 가속화할 수 있습니다.
LC-MS 데이터에서 일정 수준의 배경 신호는 불가피합니다. 따라서 배경 위에서 감지할 수 있는 대사 산물을 식별하기 위해 세심한 주의를 기울여야 합니다. 너무 작아서 온전한 세포(파편)를 나타내지 못하는 이벤트를 분류하면 행렬 종속 배경 신호 강도를 나타내는 관련 공정 블랭크 샘플이 생성됩니다. 또한, 내부 표준은 추가 데이터 분석에서 제외되어야 하는 문제가 있는 샘플을 식별할 수 있도록 한다26. 두 품질 보증 측도 모두 충분히 많은 수의 반복실험을 사용할 수 있을 때 가장 효과적입니다. 그룹당 최소 6번의 반복실험을 사용하는 것이 좋습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
저자들은 이 연구에 사용된 동물을 제공한 막스 플랑크 면역생물학 및 후성유전학 연구소(Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics)의 동물 시설에 감사의 뜻을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C yeast extract | Isotopic Solutions | ISO-1 | |
| 40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
| Acetonitrile, LC-MS grade | VWR | 83640.32 | |
| ACK lysis buffer | Gibco | 104921 | Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E |
| Adenosine diphosphate (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
| Adenosine monophosphate (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Ammonium Carbonate, HPLC grade | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
| Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters | 186009982 | |
| B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
| B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
| CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
| CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
| CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
| CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
| CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
| CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
| cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
| Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit | Invitrogen | 11415D | |
| FACSAria III | BD | ||
| Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
| Heat sealing foil | Neolab | Jul-18 | |
| Isoleucine | Sigma Aldrich | 58880 | |
| JetStream ESI Source | Agilent | G1958B | |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| Medronic acid | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
| Methanol, LC-MS grade | Carl Roth | HN41.2 | |
| NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
| TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
| Triple Quadrupole Mass Spectrometer | Agilent | 6495B | |
| Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted | Eppendorf | 30129512 | |
| UHPLC Autosampler | Agilent | G7157B | |
| UHPLC Column Thermostat | Agilent | G7116B | |
| UHPLC Pump | Agilent | G7120A | |
| UHPLC Sample Thermostat | Agilent | G4761A |
References
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