Summary
Vi beskriver en metod för microarray analys för att bestämma relativ aminoacylation nivåer av alla tRNAs från
Abstract
tRNA aminoacylation eller laddning kan nivåerna snabbt ändras i en cell som svar på miljön [1]. Förändringar i tRNA laddning nivåer i både prokaryota och eukaryota celler leder till translationell reglering som är en viktig cellulär mekanism av stress. Bästa exempel är de stränga svar i
Protocol
Del 1: Isolering av totalt laddade tRNA
- Pellets celler i en bordsskiva centrifugera vid 2000 RFC i 5 minuter. Motsvarande 1 OD 600 av celler ska producera minst 1μg av total RNA och minst 30 mikrogram rekommenderas för förfarandet.
- Resuspendera cellerna i lyseringsbuffert lösning bestående av 0,3 M buffrad Na +-acetat (pH 4,5) och 10 mM EDTA. Vortex med en lika stor volym av Na +-acetat-mättad fenol / kloroform (pH 4,5) tre gånger vardera för 30 s. Var noga med att alltid hålla prover på is mellan vortexa. Buffrat acetat kan framställas från NaOAC och HOAc medan acetat mättade fenol / kloroform kan tillagas genom att blanda 1 del 5 M buffrad acetat (pH 4,5) med 9 delar fenol / kloroform.
OBS: Total RNA isolering utförs under milt sura förhållanden och på is för att undvika deacylation av laddade tRNA. - Centrifugera vid 18.600 RFC i 15 minuter vid 4 ° C. Ta bort vattenskiktet och utföra annat acetat-mättad fenol / kloroform extraktion.
- Efter andra extraktionen fällningen RNA genom att lägga till 2.7x volymer av etanol och centrifugering på 18.600 RFC i 30 minuter vid 4 ° C.
- Resuspendera RNA pellets i lyseringsbuffert lösning och sedan fällningen med etanol en andra gång.
- Slutligen resuspendera RNA i en lösning innehållande 10 mM buffrad acetat (pH 4,5) och 1 mM EDTA för efterföljande behandling. Provet kan vara stabilt förvaras vid -80 ° C i cirka två veckor. Längre lagring rekommenderas inte som några laddade tRNA börjar deacylate.
Del 2: Förberedelse av tRNA Standards
- Värme E. coli tRNA standarder 10,5 mikroM till 85 ° C i 45 mM Tris-Cl pH 7,5 i 2 minuter. Ta tuben ut och låt stå i rumstemperatur i 3 minuter.
- Lägg MgCl 2 till en slutlig koncentration på 20 mm och inkubera vid 37 ° C i 5 minuter.
- Tillsätt blandningen syntetas reaktionen så den slutliga reaktionen innehåller 5 mikroM tRNA, 60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 12,5 mm MgCl 2, 10 mm KCl, 3 mm ditiotreitol 1,5 mm ATP, 1 mm spermine, 1 mm respektive aminosyror och 4,2 enheter / l E. coli aminoacyl-tRNA syntetas mix. Inkubera vid 37 ° C i 15 minuter.
- Lägg till en lika stor volym 0,5 buffrade M acetat (pH 4,5) och extrahera med acetat-mättade fenol / Chkl 3 vid pH 4,5.
- Fällning av tRNA-standarder med 2.7x volymer av etanol och centrifugering på 18.600 RFC i 30 minuter vid 4 ° C.
- Resuspendera standarder i 50 buffrad mM acetat (pH 4,5) med 1 mM EDTA och förvara vid -80 ° C upp till en månad.
Del 3: Cy3/Cy5 märkning av tRNA
- För de laddade tRNA-prov inkubera totalt RNA vid en koncentration av 0,1 mikrogram / l med 0,066 mikroM varje E. coli tRNA-standarder (dvs. 0,67 pmole varje standard per mikrogram totalt RNA) och 100 mm buffrad acetat (pH 4,5) i närvaro av 50 mM NaIO4 i 30 minuter i rumstemperatur. För kontroll totala tRNA-prov används 50 mM NaCl i stället för NaIO4. Kom ihåg att späda ut RNA bara buffrade lösningar för att bevara laddningen.
- Att släcka reaktionen lägga glukos till 100 mm och inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter.
- För att undanröja eventuella återstående NaIO4 från provet utföra en buffert utbyte med en G25 spin kolumn. För bästa resultat balansera kolumnen först genom att köra 200 mm buffrade acetatbuffert (pH 4,5) genom den före ansökan ditt prov.
- Fällning i provet genom att lägga buffrad acetat (pH 4,5) till en slutlig koncentration av 133 mm och NaCl till en slutlig koncentration av 66 mm och 2.7x volymer av etanol. Ibland en andra nederbörd kan behövas för oxiderade prover. Detta är nödvändigt endast om pellets ser väsentligt annorlunda än kontroll pellet av samma prov. Till exempel en betydligt större eller mer diffusa pelleten. Om en andra etanol nederbörd krävs återsuspendera pelleten i 50 mM acetatbuffert pH 4,5 och 200 mM NaCl innan tillsats av etanol.
- För deacylation den tRNA-proverna suspenderade i 50 mM Tris-HCl (pH 9) och inkuberas vid 37 ° C i 30 min. Reaktionen neutraliseras genom tillsats av en lika stor volym 50 buffrade mM acetat (pH 4,5) och 100 mM NaCl. Fällningen med 2.7x volymer av etanol. När nederbörden är RNA suspenderade i vatten ~ 1 mikrogram / l. Både kontroll och oxiderade prover bör köras på agarosgeler att kolla RNA kvalitet.
- Att fästa fluorescerande oligo-taggar på tRNA 0,1 mikrogram / l deacylated RNA inkuberas i 1x ligas buffert, 15% DMSO, 4 mikroM Cy3-eller Cy5 innehåller oligonukleotider, 0,5 enheter / l T4 DNA-ligas, och jäst exo-fosfatas (5000 enheter / l) vid 16 ° C över natten (över 16 h). Exo-fosfatas är endast nödvändig för prover från jäst och kan omitted Om detta protokoll används för E. coli eller mänskliga prover.
- Efter ligatur prover blandas med 4 volymdelar 50 mM KOAc (pH 7), 200 mm KCl, och sedan extraheras med en lika stor volym av fenol / kloroform. Efter extraktionen av vattenfasen, är RNA förberedelser fälls ut med etanol och suspenderade i vatten till ca 0,1 mikrogram / l.
- Ligatur effektivitet kan bedömas genom att köra 5-10% av proverna på 12% polyakrylamidgeler som innehåller 7M urea och visualiseras med en fluorescerande gel scanner. Den här sidan Analysen är också användbar för att fastställa beloppet av oxiderat och kontroll prover som behövs för microarray-hybridisering. Ett bra ligatur Resultatet bör visa ~ 10% eller mer av Cy3/Cy5 innehåller oligonukleotiden vara knyts ihop till tRNA. För prover med bra märkning effektivitet är 0,1-0,5 mikrog totala RNA per prov används för array hybridisering.
Del 4: hybridisering och analys av microarray
- Innan hybridisering microarray slides kokas i destillerat vatten i 1-2 minuter för att avlägsna obundna oligonukleotider.
- Cy3/Cy5 märkta prover kombineras med 140 l av hybridisering buffert och lax spermiens DNA till en slutlig koncentration av 140 mikrogram / ml och poly (A) till en slutlig koncentration på 70 mikrogram / ml.
- En hybridisering programmet (tabell 1), drivs med en automatisk rad hybridizer. För tRNA arbete är det starkt rekommenderat att en automatisk hybridisering maskin användas eftersom manuell hybridisering ger hög bakgrund.
- När programmet är klar manuellt tvätta objektglasen med Tvätta 3 lösningen minst två gånger genom att försiktigt skaka i en 50 ml koniska rör i 3-5 minuter.
- Diabilder kan torkas genom att centrifugera med låg hastighet, mindre än 200 RFC, i 5-10 minuter. Det är viktigt att hålla glider ut av ljuset, eftersom exponering för ljus kommer bleka fluoroforer.
- Efter den får torka de ska skannas omedelbart för optimalt resultat, om nödvändigt kan sparas i flera dagar på en torr mörk plats i rumstemperatur. Diabilder kan skannas 2-3 gånger utan märkbar försämring i bildkvalitet.
Del 5: representativa resultat
När isolerade ordentligt den totala RNA Provet bör ge en mycket ren spektrum med en OD 260: OD 280 kvoten nära 2. Det bör inte vara detekterbara protein eller fenol förorening. När den körs på 1% agarosgeler bör starka tRNA band observeras med andra möjliga nukleinsyra banden varierar mellan organismer. Efter oxidering en ren tRNA-bandet bör observeras. Om ett prov är märkbart svagare än andra prover eller smetar observeras ska proverna inte användas för mikroarrayer. Microarrays bör ha mycket låg bakgrund vilket är en storleksordning lägre än den svagaste tRNA sonden. Hög bakgrund beror vanligtvis på att problem under tvätten steg. Detta kan vanligtvis fastställas genom att förbereda fräscha tvätta lösningar och noggrant tvätta all utrustning och slangar för att avlägsna rester och fälls SDS.
| Steg | Detaljer |
| O-ringen luftkonditionering | 75 ° C, 2 min |
| Inför prov | 60 ° C |
| Denaturera Exempel på | 90 ° C, 5 min |
| Hybridisering | 60 ° C i 16 timmar |
| Tvätta 1 | 50 ° C, flöde 10s håller 20s |
| Tvätta 2 | 42 ° C, flöde 10s håller 20s |
| Tvätta 3 | 42 ° C, flöde 10s håller 20s |
Tabell 1: hybridisering protokoll
Discussion
Vi presenterar en metod för att samtidigt fastställa den relativa laddningsnivåerna av alla tRNAs på genomisk skala. Protokollet presenteras här har optimerats för S. cerevisiae, och det har också använts framgångsrikt för att mäta tRNA laddning profiler i E. coli och mänskliga cellkulturer. Det kan ändras för att rymma en organism med kända genomet sekvenser (som medger annotering av alla tRNA gener) så länge totalbelopp tRNA kan erhållas.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Jästen arbete i Pan labbet finansierades av ett stipendium från Ajinomoto, Inc. Japan och National Institutes of Health Training Grant T32GM007183-33. Vi tackar Dr Ronald Wek vid Indiana University School of Medicine för långsiktigt samarbete på jästen projekt. Vi vill också tacka Dr Kimberly Dittmar för utveckling av tRNA-laddning microarray-metoden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microspin G-25 columns | GE Healthcare | 25-5325-01 | |
| E. coli tRNAPhe | Sigma-Aldrich | R3143 | |
| E. coli tRNATyr | Sigma-Aldrich | R0258 | |
| E. coli tRNALys | Sigma-Aldrich | R6018 | |
| E. coli aminoacyl-tRNA synthetases | Sigma-Aldrich | A3646 | |
| T4 DNA ligase | USB Corp., Affymetrix | 70042X | |
| PerfectHyb Plus | Sigma-Aldrich | H-7033 | |
| Hyb4 station | Digilab | ||
| GenePix 4000B scanner | Axon instruments | ||
| GenePix 6.0 | Axon instruments |
References
- Zaborske, J. M. Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p. J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).
- Wek, S. A., Zhu, S., Wek, R. C. The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF-2 alpha protein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation in response to starvation for different amino acids. Mol Cell Biol. , 4497-4506 (1995).
- Hinnebusch, A. G. Translational Regulation of GCN4 and the General Amino Acid Control of Yeast. Annual Review of Microbiology. 59 (1), 407-450 (2005).
- Braeken, K. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).
- Dong, J. Uncharged tRNA Activates GCN2 by Displacing the Protein Kinase Moiety from a Bipartite tRNA-Binding Domain. Molecular Cell. 6 (2), 269-279 (2000).
- Cashel, M. The Stringent Response. Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington DC. 1458-1496 (1996).
- Dittmar, K. A. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation. EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).
- Zhou, Y. High levels of tRNA abundance and alteration of tRNA charging by bortezomib in multiple myeloma. Biochem Biophys Res Commun. 385 (2), 160-164 (2009).
