Summary
Denne protokollen beskriver en flerfarget immunfluorescensteknikk for evaluering av rottemodellen av allergisk rhinitt.
Abstract
Allergisk rhinitt (AR) er en kronisk, ikke-smittsom inflammatorisk sykdom i neseslimhinnen, primært mediert av spesifikt immunglobulin E (IgE), som påvirker omtrent 10% -20% av verdens befolkning. Mens immunfluorescens (IF) farging lenge har vært en standardteknikk for å oppdage sykdomsspesifikt proteinuttrykk, er konvensjonelle IF-teknikker begrenset i deres evne til å oppdage ekspresjonsnivåene av tre eller flere proteiner i samme prøve. Følgelig har flerfarget IF-teknikker blitt utviklet de siste årene, noe som tillater samtidig merking av flere mål i celler eller vev.
Denne protokollen gir en omfattende oversikt over prosessen for å etablere en rottemodell av AR, oppnå neseslimhinneprøver og de tekniske prosedyrene for flerfarget immunfluorescens. Alle rotter i AR-gruppen viste typiske symptomer som nysing, rennende nese og kløende nese, med atferdsobservasjoner som scoret ≥5 poeng. Farging av hematoksylin og eosin (H&E) viste økt inflammatorisk celletall og forstyrret neseslimhinneintegritet i AR-gruppen. Flerfarget immunfluorescens (mIF) viste økt ekspresjon av RORγt og TICAM-1, mens Foxp3-ekspresjon ble redusert i neseslimhinnevevet hos AR-rotter.
Introduction
Allergisk rhinitt (AR) er en kronisk, ikke-infeksiøs betennelsessykdom i neseslimhinnen primært mediert av spesifikt immunglobulin E (IgE)1,2. Det er preget av symptomer som nysing, rennende nese, nesetetthet og nesekløe. Med industrialisering og urbanisering øker forekomsten av AR gradvis, og påvirker omtrent 10% -20% av verdens befolkning1. Immunfluorescens (IF) teknikken er en fluorescerende fargemetode som benytter en antistoff-antigenbindende reaksjon. Det kan brukes til å oppdage og kvantifisere fordelings- og ekspresjonsnivåene av spesifikke proteiner i biologiske vev eller celler. I AR-forskning kan IF samtidig oppdage flere mål, inkludert AR-relaterte cytokiner, inflammatoriske celler, reseptorer og mer, noe som letter utforskningen av AR-patogenesen og effekten av narkotika 3,4,5,6.
Den flerfargede immunfluorescensfargeprosessen (mIF) ligner på tradisjonell IF, med tillegg av et antistoffelueringstrinn under hver fargingsrunde. Denne modifikasjonen muliggjør samtidig påvisning av flere biomarkører på samme vevsseksjon gjennom sekvensiell enkeltmerking og flere runder med ny farging. mIF er basert på tyramidsignalforsterkning (TSA), noe som muliggjør gjentatte sykluser med TSA-fluorescerende farging og bruk av mikrobølgeoppvarming for å fjerne antistoffer samtidig som fluorescerende signaler 7,8 beholdes. Sammenlignet med konvensjonell IF har mIF flere fordeler: (1) det kan oppdage svakt uttrykte antigener som er utfordrende å identifisere med konvensjonell IF 9,10; (2) det gir farging av høy kvalitet med et forbedret signal-støy-forhold; (3) det gjør det mulig å kvantifisere vevsspesifikke strukturer og regioner av interesse11; (4) multipleksing av flere veier utnytter effektivt vev og sparer begrensede patologiske ressurser12; (5) multiparameteranalyse gjennom mIF gir dypere innsikt i vev, og avdekker skjult biologisk informasjon13.
Samlet sett tillater mIF observasjon av forskjellige antigenuttrykk og distribusjoner i samme prøve, noe som letter studiet av målproteiner. I fremtiden vil forskere som ønsker å forstå uttrykket og fordelingen av flere målproteiner, finne denne teknikken et verdifullt valg. Denne studien demonstrerer anvendelsen av mIF for farging av neseslimhinneprøver fra rotter med AR og evaluerer etableringen av en rottemodell av AR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den eksperimentelle protokollen og prosedyrene har fått godkjenning fra administrasjons- og dyreforskningskomiteen ved Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (rekordnummer: 2022DL-010). Åtte uker gamle hannrotter av typen Sprague Dawley (SD), som veide 180-200 g, ble kommersielt innhentet (se materialfortegnelse) og plassert under en naturlig lys/mørke-syklus med kontrollert temperatur (23 ± 2 °C) og relativ fuktighet (55 % ± 10 %). Tolv rotter ble tilfeldig delt inn i to grupper: kontrollgruppen og AR-gruppen. Alle rotter ble akklimatisert til disse forholdene og gitt fri tilgang til mat og vann i en uke før forsøket.
1. Etablering av en rottemodell av AR
- Tilberedning av sensibiliserende oppløsning: suspender 30 mg ovalbumin (OVA) og 3 g Al(OH)3 i 100 ml saltvann (se materialfortegnelse)14,15.
- Grunnleggende sensibilisering: Ta tak i og hold den helt våkne rotta med magen vendt opp. Desinfiser magen med 75% alkoholholdige bomullsdotter. Bruk en 1,5 ml sprøyte til å injisere 1 ml av den sensibiliserende oppløsningen tilberedt i trinn 1.1 inn i venstre bukhule hos rotter i AR-gruppen. Gjenta injeksjonen én gang annenhver dag i 14 dager (figur 1A).
MERK: Forsikre deg om at rottens hode er plassert lavere enn halen for å forhindre skade på tykk- og tynntarmen når du setter inn sprøyten. Injeksjonsstedet ligger 1,5 cm fra ventral midtlinje. Rotter i kontrollgruppen bør få intraperitoneale injeksjoner med 1 ml vanlig saltvann én gang annenhver dag i 14 dager. - Neseprovokasjon: Administrer 50 μL 5 % OVA via nesedråper med en 100 μL pipette (figur 1B) dagen etter basal sensibilisering, gjenta denne prosedyren i 7 dager (figur 1C).
MERK: Forbered 5% OVA-oppløsningen ved å blande 5 g OVA med 100 ml saltvann. For kontrollgruppen, administrer dråper med samme volum saltvann.
2. Behavioral scoring av rotter
- Innen 30 minutter etter å ha fullført den siste neseutfordringen, observer og registrer rottene ved hjelp av et digitalkamera for å identifisere symptomer som nesekløe, nysing og rennende nese, basert på skåringskriteriene beskrevet i tabell 1 (figur 1D).
MERK: Bekreftelsen av vellykket AR-modellering er basert på å oppnå en total poengsum på ≥5 poeng14.
3. Oppkjøp av neseslimhinneprøver
- Ofre rotter: ofre rottene ved å utsette dem for en overdose av CO2. Desinfiser deretter rottene med 75% etanol (se materialfortegnelse). Bruk en skalpell til å lage et snitt langs de to hjørnene av munnen for å eksponere muskelvevet (figur 2A). Deretter kutter du leddene i det zygomatiske beinet og kjeven på begge sider av skallen ved hjelp av vevsaks (figur 2B), og fjerner mandibelen (figur 2C).
- Eksponering for nesehulen: separer huden på maxillaen ved hjelp av en hemostat (figur 2D) for å eksponere nesehulen (figur 2E). Klipp benforbindelsen mellom nesehulen og maxillaen med vevsaks (figur 2F). Deretter kutter du forbindelsen mellom nesehulen og orbitalbeinene på begge sider ved infraorbitalt foramen (figur 2G) og fjerner nesehulen (figur 2H).
- Fiksering: Plasser det ekstraherte nesehulen i 4% paraformaldehyd for fiksering og oppbevar det ved romtemperatur i 24-72 timer (se materialfortegnelse).
MERK: Forsikre deg om at mengden paraformaldehydfikseringsmiddel som brukes, er tilstrekkelig til å dekke seksjonene fullstendig for riktig fiksering.
4. Forbehandling av neseslimhinneprøver
- Avkalkning: begynn med å fikse det fjernede vevet fra trinn 3.1. Vask dem tre ganger med PBS i 20 min hver. Følg dette ved å vaske dem tre ganger med destillert vann, hver gang i 20 minutter. Deretter avkalkes vevet i en avkalkningsløsning med et volum på 20-30 ganger vevet ved romtemperatur.
- Avkalkningsløsningen (se materialfortegnelse) skal opprettholde en pH på 7,2-7,4. Til slutt plasserer du det avkalkede vevet i en dehydreringsboks.
MERK: Avkalkingsløsningen må skiftes ukentlig. Avkalkningsprosessen kan konkluderes når vevet mykner (ca. 2 måneder).
- Avkalkningsløsningen (se materialfortegnelse) skal opprettholde en pH på 7,2-7,4. Til slutt plasserer du det avkalkede vevet i en dehydreringsboks.
- Dehydrering og voksing: Overfør dehydreringsboksen til en dehydrator (se materialfortegnelse). Begynn med 75% alkohol i 4 timer, etterfulgt av 85% alkohol i 2 timer, 90% alkohol i 2 timer og 95% alkohol i 1 time.
- Deretter senker du vevet i vannfri etanol i 30 minutter, gjenta prosessen i ytterligere 30 minutter, bruk xylen i 5-10 minutter, gjenta dette trinnet i ytterligere 5-10 minutter, senk vevet i voks i 1 time, gjenta dette trinnet i en time til, og senk til slutt vevet i voks i ytterligere 1 time.
- Innebygging: Legg den smeltede voksblokken i innebyggingsboksen (se materialfortegnelse) og oppbevar den i en fryser på -20 °C. Når voksen stivner, fjern den og trim voksblokken.
- Skiver: sett den trimmede voksblokken inn i en parafinmikrotome (se materialtabell) og kutt den i skiver med en tykkelse på 3 μm. Legg skivene i et vannbad på 40 °C på en lysbildespreder. Flat ut papirlommetørkleet, løft det med et glassglass og stek det i en ovn på 60 °C.
- Etter at vannet har fordampet og voksen er riktig innstilt, fjern lysbildene og oppbevar dem ved en temperatur på 25 °C.
5. H&E-farging av neseslimhinnevev
- Avvoksing og hydrering: Legg skivene i xylen i 20 minutter, gjenta prosessen i ytterligere 20 minutter, absolutt etanol i 5 minutter, gjenta dette trinnet i ytterligere 5 minutter, 75% alkohol i 5 minutter, og vask til slutt i 5 minutter.
- Hematoksylinfarging: dispenser 100 μL hematoksylinfargeløsning (se materialtabell) i 3-5 minutter ved bruk av en 100 μL pipette, skyll i 5-10 s, tilsett 100 μL 0,5% saltsyreetanol i 10-30 s, skyll i 5-10 s, tilsett 100 μL 0,2% ammoniakkvann i 10-30 s og skyll i 30 s.
MERK: Etter hematoksylinfarging er differensiering med 0,5% saltsyreetanol nødvendig for å fjerne overdreven hematoksylinfargestoff bundet til kjernen og absorbert av cytoplasma. Når eosinfarging utføres, vil kjernene og cytoplasma bli tydelig farget. Skivene vil vises røde eller rosa etter differensiering med 0,5% saltsyreetanol, så skyll umiddelbart etter differensiering for å fjerne syren fra vevskivene for å stoppe differensieringen. Bruk deretter 0,2% ammoniakkvann for å forbedre atomfarging. - Eosinfarging: Bruk en 100 μL pipette til å dispensere 100 μL eosinfargeløsning (se materialfortegnelse) i 5 minutter og skyll i 30 s.
- Dehydrering og forsegling: senk skivene i absolutt etanol i 5 minutter, gjenta prosessen i ytterligere 5 minutter, gjenta en gang til i 5 minutter, dimetyl i 5 minutter og xylen i 5 minutter. Til slutt, forsegle med nøytral harpiks (se materialfortegnelse).
- Plasser den fargede delen på mikroskopet: plasser den fargede delen på mikroskopet, juster mikroskopets fokus til bildet er tydelig synlig, sett forstørrelsen til 40x og ta bildet.
6. Flerfarget immunfarging av neseslimhinnevev
- Avvoksing og hydrering: Følg det samme som nevnt i trinn 5.1.
- Citratfosfatbufferbehandling: plasser citratfosfatbufferen (pH 6,0) (se materialtabellen) i en mikrobølgeovnsikker beholder. Varm den til den koker, fjern den, og legg deretter lysbildene til beholderen. Mikrobølgeovn på middels varme i 8 min til koking, slå av varmen i 8 min, og bytt deretter til middels lav varme i 7 min.
- Etter naturlig avkjøling, overfør skivene til PBS (pH 7,4), rist og vask dem tre ganger med en avfargingshaker, hver gang i 5 minutter.
NOTAT: Forsikre deg om at bufferen ikke fordamper under denne prosessen, og forhindre at skivene tørker ut.
- Etter naturlig avkjøling, overfør skivene til PBS (pH 7,4), rist og vask dem tre ganger med en avfargingshaker, hver gang i 5 minutter.
- Blokkering av endogen peroksidase: tørk skivene, tegn en sirkel rundt vevet med en immunhistokjemisk penn (for å forhindre at antistoffet strømmer bort), og påfør 3% hydrogenperoksidoppløsning (hydrogenperoksid: rent vann = 1: 9).
- Inkuber ved romtemperatur i mørket i 15 minutter. Etter naturlig avkjøling, legg skivene i PBS (pH 7,4) og rist dem på en avfargingshaker i tre sykluser på 5 minutter hver.
- Blokkering: Påfør 5% geitserum i sirkelen og inkuber i 30 minutter.
- Tilsetning av primært antistoff: Fjern blokkeringsløsningen forsiktig, tilsett FOXP3 (fortynning: 1:200, se materialfortegnelse) i skiven, og legg den i et fuktig kammer. Inkuber ved 4 °C over natten.
MERK: Tilsett en liten mengde vann til det fuktige kammeret for å forhindre antistofffordampning. - Sekundær antistofftilsetning: legg skivene i PBS (pH 7,4) og rist dem på en avfargingshaker i tre sykluser på 5 minutter hver. Tørk skivene forsiktig og påfør det sekundære antistoffet (Geitantikanin IgG H&L, se materialfortegnelse) i sirkelen. Inkuber ved romtemperatur i 50 minutter i mørket.
- Fremstilling av tyramidfortynningsløsning: kombiner 100 μL 3%H2O2med 100 ml 1x TBST (se materialfortegnelse).
- Tilsetning av TSA-arbeidsløsning: Bland 1 ml tyramidfortynningsmiddel med 2 mikrol CY3-tyramid for å forberede TSAs arbeidsløsning. Påfør 100 μL TSA-arbeidsløsning på hver skive og inkuber ved romtemperatur i mørket i 10 minutter. Deretter vasker du skivene med PBS tre ganger, 5 min hver gang.
MERK: Klargjør og bruk TSAs arbeidsløsning umiddelbart, og oppbevar den ved 4 °C i mørket. Den er gyldig i opptil 24 timer. - Gjenta trinn 6.2-6.8: bytt til en 1:200 fortynning av RORγt (FITC fluorescerende fargestoff) og deretter til en 1:200 fortynning av TICAM1 (TYP620 fargestoff) (se Materialfortegnelse).
- DAPI motfargede kjerner: rist skivene forsiktig for å tørke dem, påfør DAPI-fargeløsning og rug ved romtemperatur i 10 minutter i mørket.
- Slukke autofluorescens: Legg skivene i PBS (pH 7,4) og rist dem på en avfargingshaker i tre sykluser på 5 minutter hver. Påfør autofluorescensslukkeren (se materialfortegnelse) på skivene, vent i 5 minutter, og vask deretter i 10 minutter.
- Blokkering: Legg skivene i PBS (pH 7,4) og rist dem på en avfargingshaker i tre sykluser på 5 minutter hver. Rist skivene forsiktig for å tørke dem og forsegl dem med antifluorescensslukkeren (se materialfortegnelse).
- Mikroskopi: plasser den fargede delen på mikroskopet, juster mikroskopets fokus for klar synlighet, sett forstørrelsen til 20x og 40x, og ta bildet.
MERK: DAPI har en UV-eksitasjonsbølgelengde på 330-380 nm og en utslippsbølgelengde på 420 nm (blått lys). FITC har en eksitasjonsbølgelengde på 465-495 nm og en emisjonsbølgelengde på 515-555 nm (grønt lys). CY3 har en eksitasjonsbølgelengde på 510-560 nm og en emisjonsbølgelengde på 590 nm (rødt lys). TYP-690 har en eksitasjonsbølgelengde på 630 nm og en emisjonsbølgelengde på 690 nm (rosa lys).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Seks SD-rotter ble vellykket indusert i AR-modellen gjennom OVA, intraperitoneal injeksjon og nasal utfordring. AR ble indusert hos alle rotter i AR-gruppen, og utgjorde 100% av gruppen. Alle rotter i AR-gruppen viste typiske symptomer som nysing, rennende nese og kløende nese. Alle atferdsobservasjoner fikk ≥5 poeng (tabell 2).
H&E-fargeresultater den 21. dagen av modelleringen viste at hos kontrollrottene var neseslimhinnens epitelceller og flimmerhår godt arrangert, uten tegn til inflammatorisk celleinfiltrasjon. I AR-gruppen var derimot neseseptumslimhinnen skadet og løsrevet, med merkbar nøytrofil infiltrasjon (figur 3).
Ved sammenligning av neseslimhinnevevet til AR-rotter med kontrollgruppen ble det observert at ekspresjonen av RORγt (en Th17-cellespesifikk transkripsjonsfaktor) og TICAM-1 (Toll-lignende reseptorlinkermolekyl-1) ble økt, mens Foxp3 (en Treg-cellespesifikk transkripsjonsfaktor) ble redusert (figur 4).
Figur 1: Den eksperimentelle arbeidsflyten . (A) Skjematisk diagram over intraperitoneal injeksjon. (B) Skjematisk diagram over nesedrypp. (C) Flytskjema for modellering av allergiske rhinittrotter. (D) Skjematisk diagram over atferdsobservasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Nasal fjerningsprosess . (A) Skjæring av muskelvev i munnvikene. (B) Skjæring av forbindelsen mellom kinnbenet og kjeven. (C) Separasjon av kjeven. (D) Fjerning av huden på maxilla. (E) Utsette nesehulen. (F) Kutte forbindelsen mellom nesehulen og maxilla. (G) Skjæring av forbindelsen mellom nesehulen og orbitalbenet. (H) Den fjernede nesehulen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Representative histopatologiske H&E-fargebilder dag 14 etter AR-modellering (n = 6). (A) Epitelcellene og flimmerhårene i neseslimhinnen hos kontrollrottene var godt ordnet, og det ble ikke observert noen inflammatorisk celleinfiltrasjon. (B) Slimhinnen i neseseptum i AR-gruppen ble skadet og løsnet med nøytrofil infiltrasjon. Skalastenger = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: MIF-fargeanalyse av RORγt, Foxp3 og TICAM-1 (n = 6). Sammenlignet med kontrollgruppen var uttrykket av RORγt og TICAM-1 i neseslimhinnevevet hos rotter i AR-gruppen forhøyet, mens uttrykket av Foxp3 ble redusert. Skalastenger = 100 μm (venstre paneler); 50 μm (høyre paneler). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Prinsipp for mIF-teknikk. MIF-teknikken er basert på TSA-teknikken, som innebærer kovalent binding av fluorescerende signal til antigenet. I denne prosessen katalyserer pepperrotperoksidase-merket på det sekundære antistoffet overgangen av fluoresceinsubstratet fra en inaktiv til en aktivert tilstand. Denne aktiverte tilstanden kan kovalent binde seg til tyrosinet på antigenet, noe som resulterer i en stabil kovalent festing av fluorescein til prøven. Deretter fjernes ikke-kovalent bundne antistoffer gjennom termisk reparasjon. Prosedyren gjentas deretter med ytterligere primære antistoffer, sekundære antistoffer og fluorescein for å muliggjøre påvisning av et helt annet antigen. Dette bildet ble tegnet på nytt og fargematchet med referanse til mIF skjematisk diagram17. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Score | Nysing frekvens | Rhinoré | Nasal gnidning |
| 1 | <3 | vannaktig utslipp i nesehulen | små og sporadiske nesegnidninger |
| 2 | 4~10 | vannaktig utslipp som søler ut av den fremre naris | gjentatte nesegnidninger |
| 3 | ≥11 | ansiktet dekket med rikelig vannaktig utslipp | gnidninger fra nese til ansikt |
Tabell 1: Kvantifisert skalatabell over rotteatferdstest.
| Individiuals | Dag 1 | Dag 21 |
| Kontroll 1 | 0 | 0 |
| Kontroll 2 | 0 | 0 |
| Kontroll 3 | 0 | 0 |
| Kontroll 4 | 0 | 0 |
| Kontroll 5 | 0 | 0 |
| Kontroll 6 | 0 | 0 |
| AR 1 | 0 | 7 |
| AR 2 | 0 | 6 |
| AR 3 | 0 | 5 |
| AR 4 | 0 | 5 |
| AR 5 | 0 | 5 |
| AR 6 | 0 | 6 |
Tabell 2: Resultater av atferdsmessig scoring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Allergisk rhinitt (AR) er en ikke-smittsom inflammatorisk sykdom i neseslimhinnen som skyldes en kombinasjon av miljømessige og genetiske faktorer. Det har blitt et globalt helseproblem, som påvirker arbeidseffektiviteten, reduserer livskvaliteten, svekker søvn, kognitiv funksjon og forårsaker irritabilitet og tretthet. AR påvirker 10%-20% av verdens befolkning¹ og har betydelige økonomiske kostnader, noe som forårsaker årlige tap på opptil 30-50 milliarder euro i EU-land18. Videre har flere studier etablert en sterk sammenheng mellom AR og astma18,19,20, med personer som har AR er syv ganger mer sannsynlig å utvikle astma enn de uten AR 21. Nåværende forskning tyder på at en ubalanse mellom type 1 hjelper T-celler (Th1) og type 2 hjelper-T-celler (Th2) med en forspenning mot Th2-celler er en betydelig bidragsyter til AR. Th2-celler, stimulert av interleukin-4, produserer Th2-lignende cytokiner som IL-5 og IL-13, og utløser betennelse i B-lymfocytter, mastceller, eosinofiler og dendrittiske celler22. Videre indikerer nyere AR-forskning en sterk sammenheng mellom en ubalanse i hjelper-Th17/regulatoriske T-cellepopulasjoner (Treg)23. Th17- og Treg-celler, begge avledet fra CD4 + T-celler, spiller kritiske roller i immunsystemet. RORγt er essensielt for Th17-celledifferensiering24, mens Treg-celler, med immunsuppressive funksjoner, er nøkkelen til å opprettholde immuntoleranse. Endringer i Foxp3-uttrykk påvirker Treg-cellefunksjonen25,26. Dermed reflekterer endringer i RORγt og Foxp3 nivåer Th17 / Treg ubalanser, potensielt indusere en inflammatorisk respons primært drevet av Th17 celler27. Toll-lignende reseptorer (TLR) er viktige proteiner i kroppens medfødte immunsystem, som formidler intracellulære signalveier for å aktivere spesifikt genuttrykk28. Forskning av He Shan et al.29 fant at variasjoner i TLR4-genet, spesielt CT heterozygot og TT rene mutasjoner ved rs10759930-lokuset, var assosiert med AR-utvikling. Gitt TICAM-1s rolle som bromolekylet mellom TLR3 og TLR4, ble det antatt at AR kunne knyttes til TICAM-1. Faktisk viste resultatene forhøyet TICAM-1-uttrykk i AR-gruppen, i samsvar med Xu et al.s studie30.
MIF-teknikken (Multiplex immunofluorescence) som brukes i denne studien, er en relativt ny deteksjonsmetode utviklet de siste 20 årene. Det gir flere fordeler i forhold til konvensjonelle immunfluorescens (IF) teknikker, inkludert økt spesifisitet, følsomhet og gjennomstrømning, sammen med evnen til visuell analyse. Denne teknikken er basert på TSA-metoden (Tyramide Signal Amplification), som kovalent binder fluorescerende signaler til antigener og forblir upåvirket av mikrobølgeoppvarming. Dette muliggjør flerfarget merking av vev gjennom gjentatte sykluser av TSA-fluorescerende farging, etterfulgt av mikrobølgeoppvarming for å fjerne antistoffer samtidig som det fluorescerende signalet 17,31,32 beholdes (figur 5). Avanserte algoritmer brukes deretter for automatisk identifisering og segmentering av målvevsregioner som viser spesifikke strukturer i flermerkede bilder. Dette muliggjør kvantitativ statistisk analyse av regioner av interesse, noe som muliggjør kvantitativ vurdering av cellulære immunfenotyper og funksjonell lokalisering av immunceller. Den gir også informasjon om vevskontekst og romlig fordeling33,34.
Teknisk sett er imidlertid mIF fortsatt avhengig av tradisjonelle IF-teknikker og står overfor utfordringer som antistoffkryssreaktivitet og optisk krysstale. Bruk av flere antistoffer kan føre til kryssreaktivitet og falske positive resultater, mens overlappende fluorescensspektra kan resultere i blanding av fluorescenssignaler fra flere mål, noe som gjør differensiering av det blotte øye utfordrende og økende tillit til spesialiserte bildeanalysealgoritmer35. Videre, ettersom fluorescerende fargestoffer brukes til å merke antistoffer, kan mIF påvirkes av fluorescensslukking og bleking, noe som fører til redusert signalintensitet. Spesielt, mens konvensjonelle IF-teknikker evaluerer hele vevet, fokuserer mIF-teknikker på spesifikke regioner av interesse i vevsseksjonen for analyse. Dette kan introdusere avvik fra virkeligheten på grunn av vevsheterogenitet, noe som potensielt kan resultere i unøyaktig histologisk kvantifisering eller utelatelse av sjeldne hendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Sichuan Provincial Department of Science and Technology (2021YJ0175).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Al(OH)3 | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A7130 | |
| 75% ethanol | Anhui Yiren An Co., Ltd | 20210107 | |
| Ammonia | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anhydrous ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Anti-fluorescence quenching sealer | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Automatic dyeing machine | Thermo scientific | Varistain Gemini ES | |
| Carrier slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Citrate-phosphate buffer | Servicebio biotechnology co., Ltd | G1201 | |
| Citric acid antigen repair solution (PH 6.0) | Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1201 | |
| Coverslip | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Coverslip | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | CS01-2450 | |
| CY3-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1223-50UL | |
| DAPI | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1012 | |
| Decoloring shaker | SCILOGEX | S1010E | |
| EDTA decalcification solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Electric heating blast dryer | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fast tissue dewatering machine | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Film sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| FITC-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1222-50UL | |
| Fluorescence microscope | Sunny Optical Technology Co.Ltd | CX40 | |
| Foxp3 | Affinity Biosciences Co., Ltd | bs-10211R | |
| Freezing table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Liankebio Co., Ltd | GAR0072 | |
| Goat serum | Biosharp | BL210A | |
| H&E staining kit | Leagene | DH0020 | |
| Hemostatic forceps | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J31010 | |
| Hydrochloric acid | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| Immunohistochemical pen | Biosharp | BC004 | |
| Microwave oven | Midea | M1-L213B | |
| Neutral gum | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Ovalbumin | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A804010 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Palm centrifuge | SCILOGEX | D1008E | |
| Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0099-100ml | |
| Pathology section scanner | 3DHISTECH Kft | Pannoramic SCAN | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Pipette | Dragon | KE0003087/KA0056573 | |
| Rorγt | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF3196 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B | Bioengineering Co., Ltd | A602008-0025 | |
| Slicer | Thermo scientific | HM325 | |
| Slicing machine | Thermo scientific | HM325 | |
| Slide | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | PC2-301 | |
| Sprague Dawley rats | Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine | SYX  2023-0100 |
|
| TICAM-1 | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF6289 | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J22120 | |
| Tissue spreading baking sheet machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| TYR-690 fluorescent dyes | Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd | RC0086-34RM | |
| Vortex mixer | SCILOGEX | SLK-O3000-S | |
| Water bath-slide drier | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Wax trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Brożek, J. L., et al. Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) Guidelines-2016 revision. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 950-958 (2017).
- Maurer, M., Zuberbier, T. Undertreatment of rhinitis symptoms in Europe: findings from a cross-sectional questionnaire survey. Allergy. 62 (9), 1057-1063 (2007).
- Ding, Y., et al. Alpha-linolenic acid improves nasal mucosa epithelial barrier function in allergic rhinitis by arresting CD4+ T cell differentiation via IL-4Rα-JAK2-STAT3 pathway. Phytomedicine: International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology. 116, 154825 (2023).
- Zhou, H., et al. Activation of NLRP3 inflammasome contributes to the inflammatory response to allergic rhinitis via macrophage pyroptosis. International Immunopharmacology. 110, 109012 (2022).
- Watts, A. M., Cripps, A. W., West, N. P., Cox, A. J. Modulation of allergic inflammation in the nasal mucosa of allergic rhinitis sufferers with topical pharmaceutical agents. Frontiers in pharmacology. 10, 294 (2019).
- Patel, N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy & Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1(+)CD8(+) T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoua, C., et al. PD-1-ex pressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Fedchenko, N., Reifenrath, J. Different approaches for interpretation and reporting of immunohistochemistry analysis results in the bone tissue - a review. Diagnostic Pathology. 9, 221 (2014).
- Faget, L., Hnasko, T. S. Tyramide signal amplification for immunofluorescent enhancement. Methods in Molecular Biology. 1318, 161-172 (2015).
- Parra, E. R., Villalobos, P., Rodriguez-Canales, J. The multiple faces of programmed cell death ligand 1 expression in malignant and nonmalignant cells. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology.: AIMM. 27 (4), 287-294 (2019).
- Welsh, A. W., et al. Standardization of estrogen receptor measurement in breast cancer suggests false-negative results are a function of threshold intensity rather than percentage of positive cells. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 29 (22), 2978-2984 (2011).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Miao, M., Xiang, L., Miao, Y. Specification for preparation of allergic rhinitis animal model (draft). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 49 (1), 50-57 (2018).
- Xu, J., et al. Astragalus polysaccharides attenuate ovalbumin-induced allergic rhinitis in rats by inhibiting nlrp3 inflammasome activation and nod2-mediated nf- κ b activation. Journal of Medicinal Food. 24 (1), 1-9 (2021).
- Bousquet, J., et al.
- Free Thinking. Multiplex fluorescence immunohistochemistry. , http://www.freethinking.com.cn/?xinwendongtai/156.html (2023).
- Huang, C., et al. Expression of activated signal transducer and activator of transcription-3 as a predictive and prognostic marker in advanced esophageal squamous cell carcinoma. World Journal of Surgical Oncology. 13, 314 (2015).
- Leynaert, B., Bousquet, J., Neukirch, C., Liard, R., Neukirch, F. Perennial rhinitis: An independent risk factor for asthma in nonatopic subjects: results from the European Community Respiratory Health Survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 104 (2), 301-304 (1999).
- Guerra, S., et al. Rhinitis is an independent risk factor for developing cough apart from colds among adults. Allergy. 60 (3), 343-349 (2005).
- Greisner, W. A., Settipane, R. J., Settipane, G. A. Co-existence of asthma and allergic rhinitis: a 23-year follow-up study of college students. Allergy and Asthma Proceedings. 19 (4), 185-188 (1998).
- Pawankar, R., Mori, S., Ozu, C., Kimura, S. Overview on the pathomechanisms of allergic rhinitis. Asia Pacific Allergy. 1 (3), 157-167 (2011).
- Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of α-lipoic acid via balancing th17/treg expression and enhancing nrf2/ho-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor rorγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Zhou, X., et al. Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in Vivo. Nature Immunology. 10 (9), 1000-1007 (2009).
- Ziegler, S. F., Buckner, J. H. Foxp3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation. Microbes and Infection. 11 (5), 594-598 (2009).
- Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis. Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).
- Shan, H., Jie, C. Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis. Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).
- Xu, O., et al. Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis. Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoual, C., et al. PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
- Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
- Hernandez, S., et al. Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067 (2021).
