Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine mehrfarbige Immunfluoreszenztechnik zur Evaluierung des Rattenmodells der allergischen Rhinitis.
Abstract
Allergische Rhinitis (AR) ist eine chronische, nicht-infektiöse entzündliche Erkrankung der Nasenschleimhaut, die hauptsächlich durch spezifisches Immunglobulin E (IgE) vermittelt wird und etwa 10%-20% der Weltbevölkerung betrifft. Während die Immunfluoreszenzfärbung (IF) seit langem eine Standardtechnik zum Nachweis der krankheitsspezifischen Proteinexpression ist, sind herkömmliche IF-Techniken nur begrenzt in der Lage, die Expressionsniveaus von drei oder mehr Proteinen in derselben Probe nachzuweisen. Folglich wurden in den letzten Jahren mehrfarbige IF-Techniken entwickelt, die die gleichzeitige Markierung mehrerer Ziele in Zellen oder Geweben ermöglichen.
Dieses Protokoll bietet einen umfassenden Überblick über den Prozess zur Etablierung eines Rattenmodells der AR, zur Gewinnung von Nasenschleimhautproben und zu den technischen Verfahren für die mehrfarbige Immunfluoreszenz. Alle Ratten in der AR-Gruppe zeigten typische Symptome wie Niesen, eine laufende Nase und eine juckende Nase, wobei die Verhaltensbeobachtungen ≥5 Punkte erreichten. Die Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H&E) zeigte eine erhöhte Anzahl von Entzündungszellen und eine gestörte Integrität der Nasenschleimhaut in der AR-Gruppe. Die mehrfarbige Immunfluoreszenz (mIF) zeigte eine erhöhte Expression von RORγt und TICAM-1, während die Foxp3-Expression im Nasenschleimhautgewebe von AR-Ratten abnahm.
Introduction
Die allergische Rhinitis (AR) ist eine chronische, nicht-infektiöse entzündliche Erkrankung der Nasenschleimhaut, die hauptsächlich durch spezifisches Immunglobulin E (IgE)1,2 vermittelt wird. Sie ist gekennzeichnet durch Symptome wie Niesen, laufende Nase, verstopfte Nase und Juckreiz in der Nase. Mit der Industrialisierung und Urbanisierung nimmt die Verbreitung von AR allmählich zu und betrifft etwa 10 % bis 20 % der Weltbevölkerung1. Die Immunfluoreszenztechnik (IF) ist eine Fluoreszenzfärbemethode, bei der eine Antikörper-Antigen-Bindungsreaktion verwendet wird. Es kann eingesetzt werden, um die Verteilung und Expression bestimmter Proteine in biologischen Geweben oder Zellen zu erkennen und zu quantifizieren. In der AR-Forschung kann IF mehrere Ziele gleichzeitig erkennen, darunter AR-bezogene Zytokine, Entzündungszellen, Rezeptoren und mehr, was die Erforschung der AR-Pathogenese und der Wirkung von Medikamenten erleichtert 3,4,5,6.
Das mehrfarbige Immunfluoreszenz-Färbeverfahren (mIF) ähnelt stark dem traditionellen IF-Färbeverfahren, wobei bei jeder Färberunde ein Antikörper-Elutionsschritt hinzugefügt wird. Diese Modifikation ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Biomarker auf demselben Gewebeschnitt durch sequentielle Einzelmarkierung und mehrere Runden der Re-Färbung. mIF basiert auf der Tyramid-Signalverstärkung (TSA), die wiederholte Zyklen der TSA-Fluoreszenzfärbung und die Verwendung von Mikrowellenheizung zur Entfernung von Antikörpern unter Beibehaltung der Fluoreszenzsignale ermöglicht 7,8. Im Vergleich zu herkömmlichen IF bietet mIF mehrere Vorteile: (1) Es kann schwach exprimierte Antigene nachweisen, die mit konventionellem IF 9,10 nur schwer zu identifizieren sind; (2) Es bietet eine qualitativ hochwertige Färbung mit einem verbesserten Signal-Rausch-Verhältnis; (3) Es ermöglicht die Quantifizierung gewebespezifischer Strukturen und Regionen von Interesse11; (4) Multiplexing mehrerer Signalwege nutzt Gewebe effizient aus und schont begrenzte pathologische Ressourcen12; (5) Die Multiparameter-Analyse mittels mIF bietet tiefere Einblicke in Gewebe und deckt verborgene biologische Informationen auf13.
Insgesamt ermöglicht mIF die Beobachtung verschiedener Antigenexpressionen und -verteilungen innerhalb derselben Probe, was die Untersuchung von Zielproteinen erleichtert. In Zukunft werden Forscher, die die Expression und Verteilung mehrerer Zielproteine verstehen wollen, diese Technik als wertvolle Wahl empfinden. Diese Studie demonstriert die Anwendung von mIF zur Färbung von Nasenschleimhautproben von Ratten mit AR und evaluiert die Etablierung eines Rattenmodells für AR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Das Versuchsprotokoll und die Verfahren wurden vom Verwaltungs- und Tierforschungsausschuss der Chengdu University of Traditional Chinese Medicine genehmigt (Datensatznummer: 2022DL-010). Acht Wochen alte männliche Sprague Dawley (SD)-Ratten mit einem Gewicht von 180-200 g wurden kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle) und unter einem natürlichen Hell-Dunkel-Zyklus mit kontrollierter Temperatur (23 ± 2 °C) und relativer Luftfeuchtigkeit (55 % ± 10 %) gehalten. Zwölf Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen eingeteilt: die Kontrollgruppe und die AR-Gruppe. Alle Ratten wurden an diese Bedingungen gewöhnt und erhielten vor dem Versuch eine Woche lang freien Zugang zu Futter und Wasser.
1. Etablierung eines Rattenmodells der AR
- Herstellung der sensibilisierenden Lösung: 30 mg Ovalbumin (OVA) und 3 g Al(OH)3 in 100 ml Kochsalzlösung suspendieren (siehe Materialtabelle)14,15.
- Grundlegende Sensibilisierung: Fassen und halten Sie die voll wache Ratte mit dem Bauch nach oben. Desinfizieren Sie den Bauch mit 75% alkoholgetränkten Wattebäuschen. Verwenden Sie eine 1,5-ml-Spritze, um 1 ml der in Schritt 1.1 hergestellten sensibilisierenden Lösung in die linke Bauchhöhle der Ratten in der AR-Gruppe zu injizieren. Wiederholen Sie diese Injektion 14 Tage lang einmal alle zwei Tage (Abbildung 1A).
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Kopf der Ratte tiefer als ihr Schwanz positioniert ist, um Schäden am Dick- und Dünndarm beim Einführen der Spritze zu vermeiden. Die Injektionsstelle befindet sich 1,5 cm von der ventralen Mittellinie entfernt. Ratten in der Kontrollgruppe sollten 14 Tage lang alle zwei Tage intraperitoneale Injektionen von 1 ml normaler Kochsalzlösung erhalten. - Nasale Provokation: Verabreichen Sie 50 μl 5%ige OVA über Nasentropfen mit einer 100-μl-Pipette (Abbildung 1B) am Tag nach der basalen Sensibilisierung und wiederholen Sie diesen Vorgang 7 Tage lang (Abbildung 1C).
HINWEIS: Bereiten Sie die 5%ige OVA-Lösung vor, indem Sie 5 g OVA mit 100 ml Kochsalzlösung mischen. Verabreichen Sie der Kontrollgruppe Tropfen des gleichen Volumens Kochsalzlösung.
2. Verhaltens-Scoring von Ratten
- Beobachten und zeichnen Sie die Ratten innerhalb von 30 Minuten nach Abschluss der letzten nasalen Herausforderung mit einer Digitalkamera auf, um Symptome wie Nasenkratzen, Niesen und eine laufende Nase basierend auf den in Tabelle 1 (Abbildung 1D) beschriebenen Bewertungskriterien zu identifizieren.
HINWEIS: Die Bestätigung einer erfolgreichen AR-Modellierung basiert auf dem Erreichen einer Gesamtpunktzahl von ≥5 Punkten14.
3. Entnahme von Nasenschleimhautproben
- Ratten opfern: Opfern Sie die Ratten, indem Sie sie einer Überdosis CO2 aussetzen. Desinfizieren Sie die Ratten anschließend mit 75%igem Ethanol (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Schnitt entlang der beiden Mundwinkel zu machen, um das Muskelgewebe freizulegen (Abbildung 2A). Als nächstes werden die Gelenke des Jochbeins und des Unterkiefers auf beiden Seiten des Schädels mit einer Gewebeschere durchtrennt (Abbildung 2B) und der Unterkiefer entfernt (Abbildung 2C).
- Freilegung der Nasenhöhle: Trennen Sie die Haut des Oberkiefers mit einem Hämostat (Abbildung 2D) ab, um die Nasenhöhle freizulegen (Abbildung 2E). Durchtrennen Sie die knöcherne Verbindung zwischen Nasenhöhle und Oberkiefer mit einer Gewebeschere (Abbildung 2F). Dann wird die Verbindung zwischen der Nasenhöhle und den Augenhöhlen beidseits am Foramen infraorbitalis durchtrennt (Abbildung 2G) und die Nasenhöhle entfernt (Abbildung 2H).
- Fixierung: Die extrahierte Nasenhöhle wird zur Fixierung in 4% Paraformaldehyd gelegt und 24-72 h bei Raumtemperatur gelagert (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Menge des verwendeten Paraformaldehyd-Fixiermittels ausreicht, um die Abschnitte für eine ordnungsgemäße Fixierung vollständig zu bedecken.
4. Vorverarbeitung von Nasenschleimhautproben
- Entkalkung: Beginnen Sie mit der Fixierung des entfernten Gewebes aus Schritt 3.1. Waschen Sie sie dreimal mit PBS für jeweils 20 Minuten. Waschen Sie sie anschließend dreimal mit destilliertem Wasser, jeweils 20 Minuten lang. Anschließend wird das Gewebe in einer Entkalkungslösung mit einem Volumen von 20-30 mal so groß wie das Gewebe bei Raumtemperatur entkalkt.
- Die Entkalkungslösung (siehe Materialtabelle) sollte einen pH-Wert von 7,2-7,4 aufweisen. Zum Schluss legen Sie das entkalzte Gewebe in eine Dehydrierbox.
HINWEIS: Die Entkalkungslösung muss wöchentlich gewechselt werden. Der Entkalkungsprozess kann abgeschlossen werden, wenn das Gewebe weicher wird (ca. 2 Monate).
- Die Entkalkungslösung (siehe Materialtabelle) sollte einen pH-Wert von 7,2-7,4 aufweisen. Zum Schluss legen Sie das entkalzte Gewebe in eine Dehydrierbox.
- Dehydrierung und Waxing: Füllen Sie die Dörrbox in einen Dörrautomat (siehe Materialtabelle). Beginnen Sie mit 75 % Alkohol für 4 Stunden, gefolgt von 85 % Alkohol für 2 Stunden, 90 % Alkohol für 2 Stunden und 95 % Alkohol für 1 Stunde.
- Tauchen Sie anschließend das Gewebe für 30 Minuten in wasserfreies Ethanol, wiederholen Sie den Vorgang für weitere 30 Minuten, verwenden Sie Xylol für 5-10 Minuten, wiederholen Sie diesen Schritt für weitere 5-10 Minuten, tauchen Sie das Gewebe 1 Stunde lang in Wachs, wiederholen Sie diesen Schritt für eine weitere Stunde und tauchen Sie das Gewebe schließlich für weitere 1 Stunde in Wachs.
- Einbetten: Legen Sie den geschmolzenen Wachsblock in die Einbettbox (siehe Materialtabelle) und lagern Sie ihn in einem Gefrierschrank bei -20 °C. Sobald sich das Wachs verfestigt hat, entferne es und schneide den Wachsblock ab.
- Schneiden: Den getrimmten Wachsblock in ein Paraffinmikrotom (siehe Materialtabelle) stecken und in 3 μm dicke Scheiben schneiden. Die Scheiben in ein 40 °C warmes Wasserbad auf einen Objektträgerstreuer legen. Das Tuch flach drücken, dann mit einem Objektträger anheben und bei 60 °C backen.
- Nachdem das Wasser verdunstet ist und das Wachs richtig ausgehärtet ist, entfernen Sie die Objektträger und lagern Sie sie bei einer Temperatur von 25 °C.
5. H&E-Färbung von Nasenschleimhautgewebe
- Entwachsung und Hydratation: Legen Sie die Scheiben für 20 Minuten in Xylol, wiederholen Sie den Vorgang für weitere 20 Minuten, absolutes Ethanol für 5 Minuten, wiederholen Sie diesen Schritt für weitere 5 Minuten, 75% Alkohol für 5 Minuten und waschen Sie schließlich 5 Minuten lang.
- Hämatoxylin-Färbung: 100 μl Hämatoxylin-Färbelösung (siehe Materialtabelle) für 3-5 Minuten mit einer 100-μl-Pipette abgeben, 5-10 s lang spülen, 100 μl 0,5%iges Salzsäure-Ethanol für 10-30 s hinzufügen, 5-10 s spülen, 100 μl 0,2%iges Ammoniakwasser für 10-30 s hinzufügen und 30 s lang spülen.
HINWEIS: Nach der Hämatoxylin-Färbung ist eine Differenzierung mit 0,5% Salzsäure-Ethanol erforderlich, um überschüssigen Hämatoxylin-Farbstoff zu entfernen, der an den Zellkern gebunden und vom Zytoplasma absorbiert wird. Wenn eine Eosin-Färbung durchgeführt wird, werden die Zellkerne und das Zytoplasma deutlich gefärbt. Die Scheiben erscheinen nach der Differenzierung mit 0,5%igem Salzsäure-Ethanol rot oder rosa, also spülen Sie sofort nach der Differenzierung ab, um die Säure aus den Gewebeschnitten zu entfernen und die Differenzierung zu stoppen. Verwenden Sie dann 0,2 % Ammoniakwasser, um die Kernfärbung zu verbessern. - Eosin-Färbung: Verwenden Sie eine 100-μl-Pipette, um 100 μl Eosin-Färbelösung (siehe Materialtabelle) für 5 Minuten zu dosieren und 30 s lang zu spülen.
- Dehydrierung und Versiegelung: Tauchen Sie die Scheiben 5 Minuten lang in absolutes Ethanol, wiederholen Sie den Vorgang für weitere 5 Minuten, wiederholen Sie den Vorgang noch einmal für 5 Minuten, Dimethyl für 5 Minuten und Xylol für 5 Minuten. Zum Schluss mit Neutralharz abdichten (siehe Materialtabelle).
- Platzieren des gefärbten Schnitts auf dem Mikroskop: Positionieren Sie den gefärbten Bereich auf dem Mikroskop, stellen Sie den Fokus des Mikroskops ein, bis das Bild deutlich sichtbar ist, stellen Sie die Vergrößerung auf 40x ein und nehmen Sie das Bild auf.
6. Mehrfarbige Immunfärbung von Nasenschleimhautgewebe
- Entwachsung und Hydratation: Befolgen Sie die Anweisungen in Schritt 5.1.
- Citrat-Phosphat-Puffer-Behandlung: Citrat-Phosphat-Puffer (pH 6,0) (siehe Materialtabelle) in einen mikrowellengeeigneten Behälter geben. Erhitzen Sie es, bis es kocht, nehmen Sie es heraus und geben Sie dann die Objektträger in den Behälter. 8 Minuten lang bei mittlerer Hitze in der Mikrowelle erhitzen, bis sie kochen, den Herd für 8 Minuten ausschalten und dann für 7 Minuten auf mittlere bis niedrige Hitze umschalten.
- Nach dem natürlichen Abkühlen die Scheiben in PBS (pH 7,4) geben, schütteln und dreimal mit einem Entfärbungsshaker waschen, jeweils 5 Minuten lang.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Puffer während dieses Vorgangs nicht verdunstet, und verhindern Sie, dass die Scheiben austrocknen.
- Nach dem natürlichen Abkühlen die Scheiben in PBS (pH 7,4) geben, schütteln und dreimal mit einem Entfärbungsshaker waschen, jeweils 5 Minuten lang.
- Blockieren der endogenen Peroxidase: Trocknen Sie die Scheiben, ziehen Sie mit einem immunhistochemischen Stift einen Kreis um das Gewebe (um zu verhindern, dass der Antikörper wegfließt) und tragen Sie 3%ige Wasserstoffperoxidlösung auf (Wasserstoffperoxid: reines Wasser = 1:9).
- Bei Raumtemperatur im Dunkeln 15 min inkubieren. Nach dem natürlichen Abkühlen legen Sie die Scheiben in PBS (pH 7,4) und schütteln Sie sie auf einem Entfärbungsschüttler für drei Zyklen von jeweils 5 Minuten.
- Blockierung: 5% Ziegenserum innerhalb des Kreises auftragen und 30 Minuten inkubieren.
- Zugabe von Primärantikörpern: Entfernen Sie vorsichtig die blockierende Lösung, geben Sie FOXP3 (Verdünnung: 1:200, siehe Materialtabelle) in die Scheibe und legen Sie sie in eine feuchte Kammer. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
HINWEIS: Geben Sie eine kleine Menge Wasser in die feuchte Kammer, um die Verdunstung der Antikörper zu verhindern. - Zugabe von sekundären Antikörpern: Geben Sie die Scheiben in PBS (pH 7,4) und schütteln Sie sie auf einem Entfärbungsschüttler für drei Zyklen von jeweils 5 Minuten. Trocknen Sie die Scheiben vorsichtig ab und tragen Sie den Sekundärantikörper (Goat Anti-Rabbit IgG H&L, siehe Materialtabelle) innerhalb des Kreises auf. Bei Raumtemperatur 50 Minuten im Dunkeln inkubieren.
- Herstellung der Tyramid-Verdünnungslösung: 100 μl 3 %H2O2mit 100 ml 1x TBST vermischen (siehe Materialtabelle).
- Zugabe von TSA-Arbeitslösung: Mischen Sie 1 ml Tyramid-Verdünnungsmittel mit 2 μl CY3-Tyramid, um die TSA-Arbeitslösung herzustellen. 100 μl TSA-Arbeitslösung auf jede Scheibe geben und bei Raumtemperatur im Dunkeln 10 Minuten lang inkubieren. Waschen Sie die Scheiben dann dreimal mit PBS, jeweils 5 Minuten.
HINWEIS: Bereiten Sie die TSA-Arbeitslösung sofort vor, verwenden Sie sie und lagern Sie sie bei 4 °C im Dunkeln. Sie ist bis zu 24 h gültig. - Wiederholen Sie die Schritte 6.2-6.8: Wechseln Sie zu einer 1:200-Verdünnung von RORγt (FITC-Fluoreszenzfarbstoff) und dann zu einer 1:200-Verdünnung von TICAM1 (TYP620-Farbstoff) (siehe Materialtabelle).
- DAPI-gegengefärbte Kerne: Schütteln Sie die Scheiben vorsichtig, um sie zu trocknen, tragen Sie DAPI-Färbelösung auf und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Autofluoreszenz löschen: Die Scheiben in PBS (pH 7,4) legen und drei Zyklen à 5 Minuten lang auf einem Entfärbungsschüttler schütteln. Den Autofluoreszenzlöscher (siehe Materialtabelle) auf die Scheiben auftragen, 5 Minuten warten und dann 10 Minuten waschen.
- Blockierung: Legen Sie die Scheiben in PBS (pH 7,4) und schütteln Sie sie auf einem Entfärbungsschüttler für drei Zyklen von jeweils 5 Minuten. Schütteln Sie die Scheiben vorsichtig, um sie zu trocknen, und versiegeln Sie sie mit dem Anti-Fluoreszenz-Quencher (siehe Materialtabelle).
- Mikroskopie: Legen Sie den gefärbten Bereich auf das Mikroskop, stellen Sie den Fokus des Mikroskops für eine klare Sicht ein, stellen Sie die Vergrößerung auf 20x und 40x ein und nehmen Sie das Bild auf.
HINWEIS: DAPI hat eine UV-Anregungswellenlänge von 330-380 nm und eine Emissionswellenlänge von 420 nm (blaues Licht). FITC hat eine Anregungswellenlänge von 465-495 nm und eine Emissionswellenlänge von 515-555 nm (grünes Licht). CY3 hat eine Anregungswellenlänge von 510-560 nm und eine Emissionswellenlänge von 590 nm (rotes Licht). TYP-690 hat eine Anregungswellenlänge von 630 nm und eine Emissionswellenlänge von 690 nm (rosa Licht).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sechs SD-Ratten wurden erfolgreich durch intraperitoneale OVA-Injektion und nasale Provokation in das AR-Modell induziert. AR wurde bei allen Ratten in der AR-Gruppe induziert, was 100% der Gruppe ausmachte. Alle Ratten in der AR-Gruppe zeigten typische Symptome wie Niesen, eine laufende Nase und eine juckende Nase. Alle Verhaltensbeobachtungen wurden mit ≥5 Punkten bewertet (Tabelle 2).
Die Ergebnisse der H&E-Färbung am 21. Tag der Modellierung zeigten, dass bei den Kontrollratten die Epithelzellen und Zilien der Nasenschleimhaut gut angeordnet waren, ohne Anzeichen einer Infiltration von Entzündungszellen. Umgekehrt war in der AR-Gruppe die Schleimhaut der Nasenscheidewand beschädigt und abgelöst, mit einer bemerkenswerten Neutrophileninfiltration (Abbildung 3).
Beim Vergleich des Nasenschleimhautgewebes von AR-Ratten mit der Kontrollgruppe wurde beobachtet, dass die Expression von RORγt (einem Th17-zellspezifischen Transkriptionsfaktor) und TICAM-1 (Toll-like receptor linker molecule-1) erhöht war, während Foxp3 (ein Treg-Zell-spezifischer Transkriptionsfaktor) verringert war (Abbildung 4).
Abbildung 1: Der experimentelle Arbeitsablauf . (A) Schematische Darstellung der intraperitonealen Injektion. (B) Schematische Darstellung des Nasentropfens. (C) Flussdiagramm der Modellierung von Ratten mit allergischer Rhinitis. (D) Schematische Darstellung der Verhaltensbeobachtung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Prozess der Nasenentfernung . (A) Durchtrennen des Muskelgewebes an den Mundwinkeln. (B) Durchtrennen der Verbindung zwischen dem Jochbein und dem Unterkiefer. (C) Abtrennung des Unterkiefers. (D) Entfernung der Haut des Oberkiefers. (E) Freilegung der Nasenhöhle. (F) Durchtrennen der Verbindung zwischen der Nasenhöhle und dem Oberkiefer. (G) Durchtrennen der Verbindung zwischen der Nasenhöhle und dem Augenhöhlenknochen. (H) Die entfernte Nasenhöhle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative histopathologische H&E-Färbebilder am Tag 14 nach AR-Modellierung (n = 6). (A) Die Epithelzellen und Zilien in der Nasenschleimhaut der Kontrollratten waren gut angeordnet, und es wurde keine Entzündungszellinfiltration beobachtet. (B) Die Schleimhaut der Nasenscheidewand der AR-Gruppe wurde durch Neutrophileninfiltration geschädigt und abgelöst. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: MIF-Färbeanalyse von RORγt, Foxp3 und TICAM-1 (n = 6). Im Vergleich zur Kontrollgruppe war die Expression von RORγt und TICAM-1 im Nasenschleimhautgewebe von Ratten in der AR-Gruppe erhöht, während die Expression von Foxp3 vermindert war. Maßstabsbalken = 100 μm (linke Felder); 50 μm (rechte Tafeln). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Prinzip der mIF-Technik. Die mIF-Technik basiert auf der TSA-Technik, bei der das Fluoreszenzsignal kovalent an das Antigen gebunden wird. Dabei katalysiert Meerrettichperoxidase-markiert auf dem Sekundärantikörper den Übergang des Fluorescein-Substrats von einem inaktiven in einen aktivierten Zustand. Dieser aktivierte Zustand kann kovalent an das Tyrosin auf dem Antigen binden, was zu einer stabilen kovalenten Bindung von Fluorescein an die Probe führt. Anschließend werden nicht-kovalent gebundene Antikörper durch thermische Reparatur entfernt. Das Verfahren wird dann mit zusätzlichen Primärantikörpern, Sekundärantikörpern und Fluorescein wiederholt, um den Nachweis eines völlig anderen Antigens zu ermöglichen. Dieses Bild wurde unter Bezugnahme auf das mIF-Schaltplan17 neu gezeichnet und farblich angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Spielergebnisse | Häufigkeit des Niesens | Rhinorrhoe | Nase reiben |
| 1 | <3 | wässriger Ausfluss in der Nasenhöhle | leichtes und gelegentliches Reiben der Nase |
| 2 | 4~10 | wässriger Ausfluss, der aus der vorderen Naris austritt | Wiederholtes Reiben der Nase |
| 3 | ≥11 | das Gesicht mit reichlichem wässrigem Ausfluss bedeckt | Reibungen von der Nase ins Gesicht |
Tabelle 1: Quantitative Skalentabelle des Verhaltenstests von Ratten.
| Individuen | Tag 1 | Tag 21 |
| Steuerung 1 | 0 | 0 |
| Steuerung 2 | 0 | 0 |
| Steuerung 3 | 0 | 0 |
| Steuerung 4 | 0 | 0 |
| Steuerung 5 | 0 | 0 |
| Steuerung 6 | 0 | 0 |
| AR 1 | 0 | 7 |
| AR 2 | 0 | 6 |
| AR 3 | 0 | 5 |
| AR 4 | 0 | 5 |
| AR 5 | 0 | 5 |
| AR 6 | 0 | 6 |
Tabelle 2: Ergebnisse der Verhaltensbewertung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die allergische Rhinitis (AR) ist eine nicht-infektiöse entzündliche Erkrankung der Nasenschleimhaut, die durch eine Kombination von Umwelt- und genetischen Faktoren entsteht. Es ist zu einem globalen Gesundheitsproblem geworden, das sich auf die Arbeitseffizienz auswirkt, die Lebensqualität verringert, den Schlaf und die kognitiven Funktionen beeinträchtigt und Reizbarkeit und Müdigkeit verursacht. AR betrifft 10 % bis 20 % der Weltbevölkerung¹ und verursacht erhebliche wirtschaftliche Kosten, die in den EU-Ländern jährliche Verluste von bis zu 30 bis 50 Milliarden Euro verursachen18. Darüber hinaus haben mehrere Studien einen starken Zusammenhang zwischen AR und Asthma festgestellt18,19,20, wobei Personen mit AR siebenmal häufiger Asthma entwickeln als Personen ohne AR 21. Aktuelle Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass ein Ungleichgewicht zwischen Typ-1-T-Helferzellen (Th1) und Typ-2-T-Helferzellen (Th2) mit einer Vorliebe für Th2-Zellen einen signifikanten Beitrag zur AR leistet. Th2-Zellen, die durch Interleukin-4 stimuliert werden, produzieren Th2-ähnliche Zytokine wie IL-5 und IL-13, die Entzündungen in B-Lymphozyten, Mastzellen, Eosinophilen und dendritischen Zellen auslösen22. Darüber hinaus deuten neuere AR-Forschungen auf einen starken Zusammenhang zwischen einem Ungleichgewicht zwischen Th17-Helferpopulationen und regulatorischen T-Zellen (Treg) hin23. Th17- und Treg-Zellen, die beide von CD4+ T-Zellen abstammen, spielen eine entscheidende Rolle im Immunsystem. RORγt ist essentiell für die Differenzierung von Th17-Zellen24, während Treg-Zellen mit immunsuppressiven Funktionen der Schlüssel zur Aufrechterhaltung der Immuntoleranz sind. Veränderungen in der Foxp3-Expression beeinflussen die Funktion der Treg-Zellen25,26. Somit spiegeln Veränderungen der RORγt- und Foxp3-Spiegel ein Th17/Treg-Ungleichgewicht wider und induzieren möglicherweise eine Entzündungsreaktion, die hauptsächlich von Th17-Zellen angetrieben wird27. Toll-like-Rezeptoren (TLRs) sind lebenswichtige Proteine im angeborenen Immunsystem des Körpers, die intrazelluläre Signalwege vermitteln, um die spezifische Genexpression zu aktivieren28. Forschungen von He Shan et al.29 ergaben, dass Variationen im TLR4-Gen, insbesondere CT-heterozygote und TT-reine Mutationen am rs10759930-Locus, mit der AR-Entwicklung assoziiert waren. Angesichts der Rolle von TICAM-1 als Brückenmolekül zwischen TLR3 und TLR4 wurde die Hypothese aufgestellt, dass AR mit TICAM-1 in Verbindung stehen könnte. In der Tat zeigten die Ergebnisse eine erhöhte TICAM-1-Expression in der AR-Gruppe, was mit der Studie von Xu et al.übereinstimmt 30.
Die in dieser Studie verwendete mIF-Technik (Multiplex-Immunfluoreszenz) ist eine relativ neue Nachweismethode, die in den letzten 20 Jahren entwickelt wurde. Es bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Immunfluoreszenztechniken (IF), darunter eine erhöhte Spezifität, Sensitivität und Durchsatz sowie die Möglichkeit zur visuellen Analyse. Diese Technik basiert auf der TSA-Methode (Tyramide Signal Amplification), die Fluoreszenzsignale kovalent an Antigene bindet und durch Mikrowellenheizung unbeeinflusst bleibt. Dies ermöglicht die mehrfarbige Markierung von Geweben durch wiederholte Zyklen der TSA-Fluoreszenzfärbung, gefolgt von einer Mikrowellenerwärmung, um Antikörper zu entfernen und gleichzeitig das Fluoreszenzsignal beizubehalten 17,31,32 (Abbildung 5). Fortschrittliche Algorithmen werden dann für die automatische Identifizierung und Segmentierung von Zielgeweberegionen angewendet, die bestimmte Strukturen in mehrfach markierten Bildern zeigen. Dies ermöglicht eine quantitative statistische Analyse von Regionen von Interesse, die eine quantitative Bewertung von zellulären Immunphänotypen und die funktionelle Lokalisierung von Immunzellen ermöglicht. Es liefert auch Informationen über den Gewebekontext und die räumliche Verteilung33,34.
Technisch gesehen ist mIF jedoch immer noch auf traditionelle IF-Techniken angewiesen und steht vor Herausforderungen wie Antikörper-Kreuzreaktivität und optischem Übersprechen. Die Verwendung mehrerer Antikörper kann zu Kreuzreaktivität und falsch-positiven Ergebnissen führen, während überlappende Fluoreszenzspektren zur Vermischung von Fluoreszenzsignalen von mehreren Zielen führen können, was die Differenzierung mit bloßem Auge erschwert und die Abhängigkeit von spezialisierten Bildanalysealgorithmen erhöht35. Da Fluoreszenzfarbstoffe zur Markierung von Antikörpern verwendet werden, kann mIF außerdem durch Fluoreszenzlöschung und Bleichung beeinträchtigt werden, was zu einer verminderten Signalintensität führt. Während herkömmliche IF-Techniken das gesamte Gewebe bewerten, konzentrieren sich mIF-Techniken auf bestimmte Regionen von Interesse innerhalb des Gewebeschnitts für die Analyse. Dies kann aufgrund der Heterogenität des Gewebes zu Abweichungen von der Realität führen, was zu einer ungenauen histologischen Quantifizierung oder zum Auslassen seltener Ereignisse führen kann.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie der Provinz Sichuan unterstützt (2021YJ0175).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Al(OH)3 | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A7130 | |
| 75% ethanol | Anhui Yiren An Co., Ltd | 20210107 | |
| Ammonia | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anhydrous ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Anti-fluorescence quenching sealer | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Automatic dyeing machine | Thermo scientific | Varistain Gemini ES | |
| Carrier slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Citrate-phosphate buffer | Servicebio biotechnology co., Ltd | G1201 | |
| Citric acid antigen repair solution (PH 6.0) | Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1201 | |
| Coverslip | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Coverslip | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | CS01-2450 | |
| CY3-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1223-50UL | |
| DAPI | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1012 | |
| Decoloring shaker | SCILOGEX | S1010E | |
| EDTA decalcification solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Electric heating blast dryer | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fast tissue dewatering machine | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Film sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| FITC-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1222-50UL | |
| Fluorescence microscope | Sunny Optical Technology Co.Ltd | CX40 | |
| Foxp3 | Affinity Biosciences Co., Ltd | bs-10211R | |
| Freezing table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Liankebio Co., Ltd | GAR0072 | |
| Goat serum | Biosharp | BL210A | |
| H&E staining kit | Leagene | DH0020 | |
| Hemostatic forceps | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J31010 | |
| Hydrochloric acid | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| Immunohistochemical pen | Biosharp | BC004 | |
| Microwave oven | Midea | M1-L213B | |
| Neutral gum | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Ovalbumin | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A804010 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Palm centrifuge | SCILOGEX | D1008E | |
| Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0099-100ml | |
| Pathology section scanner | 3DHISTECH Kft | Pannoramic SCAN | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Pipette | Dragon | KE0003087/KA0056573 | |
| Rorγt | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF3196 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B | Bioengineering Co., Ltd | A602008-0025 | |
| Slicer | Thermo scientific | HM325 | |
| Slicing machine | Thermo scientific | HM325 | |
| Slide | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | PC2-301 | |
| Sprague Dawley rats | Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine | SYX  2023-0100 |
|
| TICAM-1 | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF6289 | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J22120 | |
| Tissue spreading baking sheet machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| TYR-690 fluorescent dyes | Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd | RC0086-34RM | |
| Vortex mixer | SCILOGEX | SLK-O3000-S | |
| Water bath-slide drier | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Wax trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Brożek, J. L., et al. Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) Guidelines-2016 revision. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 950-958 (2017).
- Maurer, M., Zuberbier, T. Undertreatment of rhinitis symptoms in Europe: findings from a cross-sectional questionnaire survey. Allergy. 62 (9), 1057-1063 (2007).
- Ding, Y., et al. Alpha-linolenic acid improves nasal mucosa epithelial barrier function in allergic rhinitis by arresting CD4+ T cell differentiation via IL-4Rα-JAK2-STAT3 pathway. Phytomedicine: International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology. 116, 154825 (2023).
- Zhou, H., et al. Activation of NLRP3 inflammasome contributes to the inflammatory response to allergic rhinitis via macrophage pyroptosis. International Immunopharmacology. 110, 109012 (2022).
- Watts, A. M., Cripps, A. W., West, N. P., Cox, A. J. Modulation of allergic inflammation in the nasal mucosa of allergic rhinitis sufferers with topical pharmaceutical agents. Frontiers in pharmacology. 10, 294 (2019).
- Patel, N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy & Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1(+)CD8(+) T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoua, C., et al. PD-1-ex pressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Fedchenko, N., Reifenrath, J. Different approaches for interpretation and reporting of immunohistochemistry analysis results in the bone tissue - a review. Diagnostic Pathology. 9, 221 (2014).
- Faget, L., Hnasko, T. S. Tyramide signal amplification for immunofluorescent enhancement. Methods in Molecular Biology. 1318, 161-172 (2015).
- Parra, E. R., Villalobos, P., Rodriguez-Canales, J. The multiple faces of programmed cell death ligand 1 expression in malignant and nonmalignant cells. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology.: AIMM. 27 (4), 287-294 (2019).
- Welsh, A. W., et al. Standardization of estrogen receptor measurement in breast cancer suggests false-negative results are a function of threshold intensity rather than percentage of positive cells. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 29 (22), 2978-2984 (2011).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Miao, M., Xiang, L., Miao, Y. Specification for preparation of allergic rhinitis animal model (draft). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 49 (1), 50-57 (2018).
- Xu, J., et al. Astragalus polysaccharides attenuate ovalbumin-induced allergic rhinitis in rats by inhibiting nlrp3 inflammasome activation and nod2-mediated nf- κ b activation. Journal of Medicinal Food. 24 (1), 1-9 (2021).
- Bousquet, J., et al.
- Free Thinking. Multiplex fluorescence immunohistochemistry. , http://www.freethinking.com.cn/?xinwendongtai/156.html (2023).
- Huang, C., et al. Expression of activated signal transducer and activator of transcription-3 as a predictive and prognostic marker in advanced esophageal squamous cell carcinoma. World Journal of Surgical Oncology. 13, 314 (2015).
- Leynaert, B., Bousquet, J., Neukirch, C., Liard, R., Neukirch, F. Perennial rhinitis: An independent risk factor for asthma in nonatopic subjects: results from the European Community Respiratory Health Survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 104 (2), 301-304 (1999).
- Guerra, S., et al. Rhinitis is an independent risk factor for developing cough apart from colds among adults. Allergy. 60 (3), 343-349 (2005).
- Greisner, W. A., Settipane, R. J., Settipane, G. A. Co-existence of asthma and allergic rhinitis: a 23-year follow-up study of college students. Allergy and Asthma Proceedings. 19 (4), 185-188 (1998).
- Pawankar, R., Mori, S., Ozu, C., Kimura, S. Overview on the pathomechanisms of allergic rhinitis. Asia Pacific Allergy. 1 (3), 157-167 (2011).
- Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of α-lipoic acid via balancing th17/treg expression and enhancing nrf2/ho-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor rorγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Zhou, X., et al. Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in Vivo. Nature Immunology. 10 (9), 1000-1007 (2009).
- Ziegler, S. F., Buckner, J. H. Foxp3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation. Microbes and Infection. 11 (5), 594-598 (2009).
- Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis. Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).
- Shan, H., Jie, C. Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis. Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).
- Xu, O., et al. Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis. Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoual, C., et al. PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
- Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
- Hernandez, S., et al. Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067 (2021).
