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Immunology and Infection

इंटीग्रिन-निरोधात्मक दवाओं की स्क्रीनिंग के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित उच्च-थ्रूपुट तकनीक

Published: February 2, 2024 doi: 10.3791/64401
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4,5, 3,4, 1
1Department of Immunology, School of Medicine, UConn Health, 2Center for Molecular Discovery, University of New Mexico Health Sciences Center, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center, 4Department of Pathology, University of New Mexico Health Sciences Center, 5Autophagy, Inflammation, & Metabolism (AIM) Center, University of New Mexico

Summary

यह प्रोटोकॉल मानव न्यूट्रोफिल पर β2 इंटीग्रिन सक्रियण को बाधित करने वाली छोटे-अणु दवाओं की पहचान करने के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित, उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग विधि का वर्णन करता है।

Abstract

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य β2 इंटीग्रिन सक्रियण के छोटे आणविक विरोधियों की पहचान करने के लिए एक विधि स्थापित करना है, जो विरूपण-परिवर्तन-रिपोर्टिंग एंटीबॉडी और उच्च-थ्रूपुट प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करता है। विधि अन्य एंटीबॉडी-आधारित उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग विधियों के लिए एक गाइड के रूप में भी काम कर सकती है। β2 इंटीग्रिन ल्यूकोसाइट-विशिष्ट आसंजन अणु हैं जो प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में महत्वपूर्ण हैं। न्यूट्रोफिल रक्तप्रवाह से बाहर निकलने के लिए इंटीग्रिन सक्रियण पर भरोसा करते हैं, न केवल संक्रमण से लड़ने के लिए बल्कि कई सूजन संबंधी बीमारियों में भी शामिल होने के लिए। β2 इंटीग्रिन सक्रियण को नियंत्रित करना न्यूट्रोफिल से जुड़े भड़काऊ रोगों के इलाज के लिए एक व्यवहार्य दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है। इस प्रोटोकॉल में, एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, mAb24, जो विशेष रूप से β2 इंटीग्रिन के उच्च-आत्मीयता हेडपीस से बांधता है, का उपयोग पृथक प्राथमिक मानव न्यूट्रोफिल पर β2 इंटीग्रिन सक्रियण की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है। एन-फॉर्माइलमेथियोनिल-ल्यूसिल-फेनिलएलनिन (एफएमएलपी) का उपयोग न्यूट्रोफिल β2 इंटीग्रिन को सक्रिय करने के लिए उत्तेजना के रूप में किया जाता है। इस अध्ययन में स्वचालित रूप से 384-अच्छी तरह से प्लेट नमूने चलाने में सक्षम एक उच्च-थ्रूपुट प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग किया गया था। β2 इंटीग्रिन निषेध पर 320 रसायनों के प्रभाव का मूल्यांकन 3 घंटे के भीतर किया जाता है। अणु जो सीधे β2 इंटीग्रिन को लक्षित करते हैं या जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर-इनसाइड-आउट सक्रियण सिग्नलिंग मार्ग में इंटीग्रिन इनसाइड-आउट एक्टिवेशन सिग्नलिंग मार्ग में अणुओं को लक्षित करते हैं, उन्हें इस दृष्टिकोण के माध्यम से पहचाना जा सकता है।

Introduction

कई सूजन संबंधी बीमारियों को सूजन या चोट के स्थल पर न्यूट्रोफिल की घुसपैठ की विशेषता है1. इन ऊतकों में घुसपैठ करने के लिए, न्यूट्रोफिल को न्यूट्रोफिल भर्ती कैस्केड को पूरा करना होगा, जिसमें एंडोथेलियम को गिरफ्तारी, पोत की दीवार पर अपव्यय और ऊतक2 में भर्ती करना शामिल है। परिसंचारी न्यूट्रोफिल को इस कैस्केड को पूरा करने के लिए β2 इंटीग्रिन सक्रियण की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से गिरफ्तारी चरण के लिए। इस प्रकार, न्यूट्रोफिल आसंजन, एक्सट्रावेशन और भर्ती को कम करने वाली दवाओं को प्रभावी ढंग से सूजन संबंधी बीमारियों 3,4 का इलाज कर सकते हैं।

β2 इंटीग्रिन को पहले भी भड़काऊ बीमारियों के लिए लक्षित किया गया है। Efalizumab, एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी सीधे इंटीग्रिन αLβ2 को लक्षित करता है, जिसे सोरायसिस5 के इलाज के लिए विकसित किया गया था। हालांकि, इसके घातक दुष्प्रभाव के कारण efalizumab को वापस ले लिया गया था - जेसी वायरसपुनर्सक्रियन 6,7 के परिणामस्वरूप प्रगतिशील मल्टीफोकल ल्यूकोएन्सेफैलोपैथी। नए विरोधी भड़काऊ इंटीग्रिन-आधारित उपचारों को साइड इफेक्ट्स को कम करने के लिए ल्यूकोसाइट्स के संक्रमण-विरोधी कार्यों को बनाए रखने पर विचार करना चाहिए। efalizumab के दुष्प्रभाव रक्तप्रवाह में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के लंबे समय तक परिसंचरण के कारण हो सकते हैं, जो लंबी अवधि में प्रतिरक्षा कार्यों को बाधित कर सकता है8. हाल के एक अध्ययन से पता चलता है कि efalizumab αLβ2 क्रॉसलिंकिंग और α4 इंटीग्रिन के अवांछित आंतरिककरण की मध्यस्थता करता है, जो दुष्प्रभावों के लिए एक वैकल्पिक स्पष्टीकरण प्रदान करताहै। इस प्रकार, अल्पकालिक, छोटे-अणु विरोधी इस समस्या से बच सकते हैं।

मानव न्यूट्रोफिल का उपयोग करके छोटे-अणु β2 इंटीग्रिन विरोधी को स्क्रीन करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट विधि यहां प्रस्तुत की गई है। β2 इंटीग्रिन सक्रियण के लिए इंटीग्रिन एक्टोडोमेन के विरूपण परिवर्तनों की आवश्यकता होती है ताकि इसके लिगैंड तक पहुंच प्राप्त हो सके और इसकी बाध्यकारी आत्मीयता बढ़ सके। विहित स्विचब्लेड मॉडल में, बेंट-क्लोज्ड इंटीग्रिन एक्टोडोमेन पहले एक विस्तारित-बंद रचना तक फैला हुआ है और फिर अपने हेडपीस को पूरी तरह से सक्रिय विस्तारित-खुले रचना10,11,12,13 में खोलता है। एक वैकल्पिक मार्ग भी है जो बेंट-क्लोज्ड से शुरू होकर बेंट-ओपन और एक्सटेंडेड-ओपन तक होता है, अंततः 14,15,16,17,18,19। रचना-विशिष्ट एंटीबॉडी mAb24 मानव β2-I-जैसे डोमेन में एक एपिटोप से बांधता है जब एक्टोडोमेन का हेडपीस20,21,22,23 खुला होता है।

यहां, mAb24-APC का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जाता है कि β2 इंटीग्रिन सक्रिय हैं या नहीं। न्यूट्रोफिल और इंटीग्रिन को सक्रिय करने के लिए, एन-फॉर्माइलमेथियोनील-ल्यूसिल-फेनिलएलनिन (एफएमएलपी), एक बैक्टीरिया-व्युत्पन्न लघु केमोटैक्टिक पेप्टाइड जो न्यूट्रोफिल β2 इंटीग्रिन24 को सक्रिय कर सकता है, इस प्रोटोकॉल में एक उत्तेजना के रूप में उपयोग किया जाता है। जब fMLP न्यूट्रोफिल पर Fpr1 से बांधता है, तो G-प्रोटीन, फॉस्फोलिपेज़ Cβ, और फॉस्फोइनोसाइटाइड 3-किनेज γ वाले डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग कैस्केड सक्रिय होते हैं। इन सिग्नलिंग घटनाओं के परिणामस्वरूप अंततः अंदर-बाहर सिग्नलिंग मार्ग18,25 के माध्यम से इंटीग्रिन सक्रियण होता है। छोटे अणु विरोधी के अलावा जो सीधे β2 इंटीग्रिन से बंधते हैं और इंटीग्रिन सक्रियण26 के संरूपण परिवर्तनों को रोकते हैं, यौगिक जो β2 इंटीग्रिन अंदर-बाहर सक्रियण सिग्नलिंग मार्ग में घटकों को बाधित कर सकते हैं, इस विधि से भी पता लगाया जाएगा। स्वचालित प्रवाह साइटोमीटर उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग को सक्षम करते हैं। नए प्रतिपक्षी की पहचान करना न केवल इंटीग्रिन फिजियोलॉजी की हमारी समझ को गहरा कर सकता है, बल्कि इंटीग्रिन-आधारित एंटी-इंफ्लेमेशन थेरेपी में ट्रांसलेशनल अंतर्दृष्टि भी प्रदान कर सकता है।

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Protocol

हेलसिंकी की घोषणा के सिद्धांतों का पालन करते हुए, सूचित सहमति प्राप्त करने के बाद, सूचित सहमति प्राप्त करने के बाद हेपरिनाइज्ड पूरे रक्त के नमूने डी-आइडेंटिफाइड स्वस्थ मानव दाताओं से प्राप्त किए गए थे। सभी दानदाताओं से सूचित सहमति प्राप्त की गई। इस अध्ययन के लिए समावेश / बहिष्करण मानदंड प्रतिभागियों की उपयुक्तता सुनिश्चित करने और संभावित जोखिमों को कम करने के लिए सावधानीपूर्वक विकसित किए गए थे। योग्य प्रतिभागियों की आयु 18 से 65 वर्ष के बीच थी, किसी भी जातीयता के, अंग्रेजी में धाराप्रवाह, और सूचित सहमति प्रदान करने में सक्षम। बहिष्कृत प्रतिभागियों में वे लोग शामिल थे जो स्वयं के लिए सूचित सहमति प्रदान करने में असमर्थ थे, जैसे कि कानूनी रूप से अधिकृत प्रतिनिधि की आवश्यकता होती है, 18 वर्ष से कम या 65 वर्ष से अधिक आयु के व्यक्ति, जेल में बंद व्यक्ति और गर्भवती महिलाएं। इसके अतिरिक्त, प्रतिभागियों को विरोधी भड़काऊ दवा के उपयोग और भड़काऊ स्थितियों से मुक्त होना था। वर्तमान संक्रमण या चल रही पुरानी या तीव्र भड़काऊ स्थितियां भी बहिष्करण मानदंड थीं। अंत में, COVID-19 संक्रमण के वर्तमान या हाल के इतिहास वाले व्यक्ति अध्ययन के लिए अयोग्य थे। इन मानदंडों को प्रतिभागी सुरक्षा और उपयुक्तता सुनिश्चित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जबकि संभावित भ्रमित कारकों को कम किया जा सकता है जो अध्ययन के परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं।

1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. न्यूट्रोफिल माध्यम: फिनोल लाल के बिना RPMI-1640 में 2% मानव सीरम एल्ब्यूमिन जोड़कर न्यूट्रोफिल माध्यम तैयार करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. fMLP समाधान: फिनोल लाल के बिना RPMI 1640 के साथ 10 mM fMLP डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (DMSO) भंडारण समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) से 100 बार पतला करके fMLP समाधान तैयार करें, जिसके परिणामस्वरूप 100 माइक्रोन fMLP समाधान होता है।
  3. एंटीबॉडी समाधान: एलोफिकोसायनिन (एपीसी) -संयुग्मित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी एमएबी 24 (एमएबी 24-एपीसी) ( सामग्री की तालिका) के 120 माइक्रोन को पतला करें, जो न्यूट्रोफिल माध्यम के 10 एमएल में β2 इंटीग्रिन के उच्च-आत्मीयता विरूपण की रिपोर्ट करता है, जिससे 1.2 माइक्रोग्राम / एमएल एमएबी 24-एपीसी समाधान बनता है।
  4. यौगिक पुस्तकालय: तरल हैंडलर का उपयोग करके 384-अच्छी प्लेटों में डीएमएसओ के 45 माइक्रोन में 10 एमएम लाइब्रेरी ( सामग्री की तालिकादेखें) के 5 माइक्रोन जोड़कर 10 एमएम से 1 एमएम की एकाग्रता के साथ प्रारंभिक यौगिक पुस्तकालय को पतला करें। इसके बाद, तरल हैंडलर का उपयोग करके एक खाली 384-अच्छी प्लेट में 1 मिमी यौगिक पुस्तकालय के कुएं के प्रति 5 माइक्रोन स्थानांतरित करें।
  5. जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, चार कॉलम ( 1, 2, 23, 24) में केवल डीएमएसओ था, लेकिन कोई यौगिक नहीं था, जो स्क्रीनिंग में सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता था। फिनोल लाल के बिना आरपीएमआई-1640 के 45 माइक्रोन जोड़कर प्रत्येक अच्छी तरह से पतला करें, जिसके परिणामस्वरूप सभी यौगिकों के लिए 100 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता हो।

2. मानव रक्त से न्यूट्रोफिल अलगाव

  1. एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब(चित्रा 2ए)में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध घनत्व ढाल माध्यम (सामग्री की तालिकादेखें) के 8 एमएल पर रक्त के 4 एमएल को ध्यान से परत करें।
  2. 20 डिग्री सेल्सियस पर 30-50 मिनट के लिए 550 × ग्राम पर रक्त अपकेंद्रित्र. रोटर को धीरे-धीरे धीमा करें (1 का मंदी कारक)।
    नोट: लाल रक्त कोशिकाओं से न्यूट्रोफिल ( चित्रा 2 बी में बैंड 2) का सफल पृथक्करण दाताओं के बीच भिन्न हो सकता है। अधिकांश दाताओं के लिए, 30 मिनट का सेंट्रीफ्यूजेशन पर्याप्त है। हालांकि, कुछ दाताओं के लिए, पृथक्करण सफल नहीं होने पर अतिरिक्त 10-30 मिनट सेंट्रीफ्यूजेशन की आवश्यकता हो सकती है(चित्र 2सी)।
  3. प्लाज्मा (शीर्ष पर पीला तरल) और मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (ऊपरी बादल बैंड; चित्रा 2 बी में पीबीएमसी बैंड) एक 1 एमएल विंदुक का उपयोग कर.
  4. निचले बादल बैंड ( चित्रा 2 बी में न्यूट्रोफिल बैंड) से न्यूट्रोफिल इकट्ठा करें और फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 10 एमएल युक्त 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्पष्ट तरल के नीचे लगभग 3-4 एमएल इकट्ठा करें। धीरे यह 2-3 बार उलटा द्वारा न्यूट्रोफिल निलंबन मिश्रण.
  5. 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर निलंबन अपकेंद्रित्र, और फिर ध्यान से सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
  6. धीरे पीबीएस के 5 एमएल के साथ गोली को फिर से निलंबित करें और इसे 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
  7. decanting द्वारा सतह पर तैरनेवाला निकालें, और ध्यान से वैक्यूम चूषण का उपयोग ट्यूब मुंह के आसपास और ट्यूब की दीवार पर किसी भी अवशिष्ट सतह पर तैरनेवाला को खत्म. न्यूट्रोफिल माध्यम के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें।
  8. एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल नंबरों की गणना करें। आमतौर पर, मानव रक्त के 8 एमएल से 1 से 4 × 107 न्यूट्रोफिल प्राप्त किए गए थे।
    नोट: न्यूट्रोफिल निलंबन में लाल रक्त कोशिका संदूषण हो सकता है। लाल रक्त कोशिकाएं अधिकांश परख को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं करती हैं और न्यूट्रोफिल सक्रियण / एक सटीक न्यूट्रोफिल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए गिनती से पहले लाल रक्त कोशिकाओं को lysed करने की आवश्यकता होती है। लाल रक्त कोशिकाओं को लाइज़ करने के लिए 10-30 s के लिए विआयनीकृत पानी के 891 μL में सेल निलंबन के 10 माइक्रोन जोड़ें, फिर आसमाटिक दबाव को संतुलित करने के लिए 10× पीबीएस के 99 माइक्रोन जोड़ें, न्यूट्रोफिल के लसीका को रोकें।
  9. न्यूट्रोफिल माध्यम जोड़कर सेल घनत्व को 6.25 × 105 कोशिकाओं / एमएल में समायोजित करें।

3. 384 अच्छी तरह से थाली की तैयारी

  1. 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में, 1 माइक्रोग्राम / एमएल एमएबी 24-एपीसी समाधान बनाने के लिए न्यूट्रोफिल माध्यम के 0.2 एमएल के साथ एंटीबॉडी समाधान (1.2 माइक्रोग्राम / एमएल एमएबी 24-एपीसी) के 1 एमएल को मिलाएं। फिर, एक 384 अच्छी तरह से थाली ( चित्रा 1 में नीले कुओं) में नकारात्मक नियंत्रण कुओं के लिए इस मिश्रण के 25 माइक्रोन जोड़ें.
  2. 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में, एंटीबॉडी समाधान के 9 एमएल को एफएमएलपी समाधान (100 माइक्रोन) के 21.6 माइक्रोन और न्यूट्रोफिल माध्यम के 1.7784 एमएल के साथ मिलाकर 1 माइक्रोग्राम / एमएल एमएबी 24-एपीसी और 200 एनएम एफएमएलपी युक्त समाधान बनाएं। अगला, सकारात्मक नियंत्रण और एक 384 अच्छी तरह से थाली ( चित्रा 1 में लाल और नीले कुओं) में परीक्षण कुओं के लिए इस मिश्रण के 25 माइक्रोन जोड़ें.
  3. एक बहु चैनल विंदुक का उपयोग कर 384 अच्छी तरह से थाली के लिए यौगिक पुस्तकालय प्लेट से 100 माइक्रोन यौगिक समाधान के 5 माइक्रोन स्थानांतरण.
  4. कमरे के तापमान पर 500 × ग्राम पर 1 मिनट के लिए तरल अपकेंद्रित्र.
    नोट: प्लेटों को अपकेंद्रित्र करने के लिए, एक स्विंग-बाल्टी रोटर और प्लेट बाल्टी की आवश्यकता होती है।

4. कोशिकाओं का उपचार

  1. 16-चैनल विंदुक (384-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक स्तंभ के लिए 5-50 माइक्रोन रेंज) का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से न्यूट्रोफिल निलंबन के 20 माइक्रोन जोड़ें। धीरे विंदुक का उपयोग कर 5-10 बार मिश्रण, प्रत्येक pipetting के बीच एक सुसंगत समय अंतराल बनाए रखने.
    नोट: कुओं में अंतिम सांद्रता निम्नानुसार हैं: न्यूट्रोफिल 2.5 × 105 कोशिकाओं/एमएल (सभी कुओं); एमएबी 24-एपीसी 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल (सभी कुएं); fMLP 100 एनएम (सकारात्मक नियंत्रण और परीक्षण कुओं); यौगिक 10 माइक्रोन (परीक्षण कुओं)।
  2. 300 आरपीएम पर एक प्रकार के बरतन पर थाली सेते हैं, कमरे के तापमान (आरटी) पर, 10 मिनट के लिए.
  3. 16-चैनल विंदुक (अंतिम पीएफए एकाग्रता ~ 0.91%) का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से 16% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 3 माइक्रोन जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें। फिर, 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
    नोट: न्यूट्रोफिल और पीएफए जोड़ते समय विभिन्न स्तंभों के बीच एक सुसंगत समय अंतराल बनाए रखने की सिफारिश की जाती है। यह सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक कुएं में न्यूट्रोफिल fMLP और mAb24-APC के साथ समान इनक्यूबेशन समय है।

5. फ्लो साइटोमेट्री

  1. प्रवाह साइटोमीटर चालू करें ( सामग्री की तालिकादेखें), और सुनिश्चित करें कि उपकरण से जुड़ा कंप्यूटर भी चालू है।
  2. सुनिश्चित करें कि म्यान द्रव कंटेनर भरा हुआ है, और अपशिष्ट कंटेनर खाली है और उपकरण से ठीक से जुड़ा हुआ है।
  3. प्रवाह साइटोमीटर के नमूना लोडर पर 384 अच्छी तरह से थाली लोड. सुनिश्चित करें कि प्लेट का A1 कुआं लोडर पर A1 चिह्न के साथ संरेखित होता है।
  4. सॉफ़्टवेयर खोलें और एक नया प्रयोग बनाएं। 384 अच्छी तरह से चुनें और वांछित फ्लोरोफोर्स चुनें। अगला, प्लेट सेटअप पर क्लिक करें, सभी कुओं का चयन करने के लिए खींचें, और फिर नमूना पर क्लिक करें। "उच्च थ्रूपुट" स्विच चालू करें, और दर पैनल के तहत उच्च का चयन करें।
    1. वॉल्यूम बॉक्स में, 50 दर्ज करें. विषम संख्या वाले कॉलम में नमूनों का चयन करें और फिर "आंदोलन" स्विच को सक्रिय करें। अंत में, सही पैनल में नमूनों का नाम.
  5. प्लॉट और गेट पर क्लिक करें। फिर, अप्लाई बटन (हरे रंग से भरे सर्कल पर दो तीर) पर क्लिक करें, और बाद में, प्ले बटन (त्रिकोण आकार) पर क्लिक करें। पहले कुएं से कुछ कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए कुछ सेकंड प्रतीक्षा करें, और फिर ठहराव बटन पर क्लिक करें।
    1. साजिश पर कोशिकाओं के उचित दृश्य सुनिश्चित करने के लिए एफएससी और एसएससी वोल्टेज समायोजित करें। अधिग्रहण पर क्लिक करें, और फिर परख शुरू करने के लिए प्ले बटन (त्रिकोण आकार) पर क्लिक करें।
  6. प्रवाह साइटोमीटर क्रमिक रूप से प्रत्येक कुएं से 1000-3000 न्यूट्रोफिल के ~ 50 माइक्रोन का नमूना लेगा। यह पूरे 384 अच्छी तरह से थाली को पूरा करने के लिए लगभग 3 घंटे ले जाएगा.
  7. सभी नमूने पूरा करने के बाद, अगले चरण के लिए .fcs फ़ाइलें निर्यात करें।

6. डेटा विश्लेषण

  1. प्रवाह साइटोमेट्री डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिकादेखें)। सॉफ़्टवेयर विंडो में सभी .fcs फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर का चयन करें और खींचें, फिर सॉफ़्टवेयर में डेटा आयात करने के लिए रिलीज़ करें।
  2. एक नमूने पर डबल-क्लिक करें, पॉप-अप विंडो में एफएससी और एसएससी28,29,30 पर आधारित गेट सिंगल न्यूट्रोफिल, जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है। गेटेड पंक्तियों का चयन करें और उन्हें फ़ोल्डर में खींचें, फिर उस फ़ोल्डर में सभी नमूनों पर गेटिंग लागू करने के लिए छोड़ दें।
  3. गणना और निर्यात एपीसी औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) प्रत्येक अच्छी तरह से सॉफ्टवेयर की तालिका संपादक समारोह का उपयोग कर. एडिट टैब के तहत Add Column पर क्लिक करें। सांख्यिकीय टैब में माध्यिका का चयन करें, गेटेड जनसंख्या न्यूट्रोफिल चुनें, और पैरामीटर के रूप में एपीसी का चयन करें। ओके बटन पर क्लिक करें।
  4. "तालिका संपादक" टैब पर लौटें, "समूह" टैब में सभी नमूने चुनें, और तालिका बनाएं बटन दबाएं। बनाई गई तालिका को प्रदर्शित करने वाली एक नई विंडो दिखाई देगी। इसे टेक्स्ट, CSV या Excel फ़ाइल के रूप में सहेजें।
  5. निर्यात की गई तालिका खोलें, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण नमूनों (चित्रा 4) के लिए एपीसी एमएफआई के औसत मूल्य और मानक विचलन की गणना करें।
  6. समीकरण का उपयोग करके प्लेट के Z'-कारक (Z') की गणना करें:
    Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μp - μn),
    जहांσ पी और σ एन क्रमशः सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों के मानक विचलन हैं, और μपी और μएन क्रमशः सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के साधन हैं,31.
    नोट: जेड 'कारक सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण वितरण के पृथक्करण को इंगित करता है। 0 के Z' का अर्थ है कोई पृथक्करण नहीं, जबकि 0.5 का Z' समान पृथक्करण को इंगित करता है। जैसा कि पिछले अध्ययन31 में उल्लेख किया गया है, जेड '> 0.5 यौगिक स्क्रीनिंग के लिए एक उत्कृष्ट परख इंगित करता है। 0.5 से 0 की सीमा में एक जेड स्वीकार्य है, लेकिन यह केवल परख में मजबूत हिट की पहचान कर सकता है, जिसे माध्यमिक परख में और सत्यापन की आवश्यकता होगी।
  7. स्क्रीनिंग के लिए "हिट" के रूप में यौगिकों पर विचार करें जब यौगिक-उपचारित न्यूट्रोफिल का एपीसी एमएफआई सकारात्मक नियंत्रण एमएफआई (पी = 0.0013, चित्रा 4 में बिंदीदार रेखा द्वारा दर्शाया गया) से घटाए गए सकारात्मक नियंत्रण एमएफआई के मानक विचलन के तीन गुना से कम है।

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Representative Results

एक प्रतिनिधि 384 अच्छी तरह से थाली स्क्रीनिंग (चित्रा 4) से डेटा नकारात्मक नियंत्रण 3236 ± 110 के mAb24-APC के एक MFI था, जबकि सकारात्मक नियंत्रण mAb24 के एक एमएफआई था ± 858 से पता चला. इस प्लेट के लिए Z' कारक लगभग 0.33 है, जो एक स्वीकार्य सीमा31 के भीतर है। हालांकि, जेड 'माध्यमिक assays में आगे सत्यापन की आवश्यकता है.

डेटा को सामान्य करने के लिए, सभी मानों को धनात्मक माध्य को 1 का अधिकतम मान और ऋणात्मक माध्य को 0 का न्यूनतम मान असाइन करने के लिए स्केल किया गया था। जेड 'कारक माध्यमिक assays में अधिक कठोर सत्यापन से गुजरना होगा. इस प्लेट के लिए कटऑफ 0.41 पर सेट किया गया है, जिसका अर्थ है कि 0.41 से कम रिश्तेदार एमएफआई वाले नमूनों को मानव न्यूट्रोफिल में एफएमएलपी-प्रेरित β2 इंटीग्रिन सक्रियण को बाधित करने वाले हिट के रूप में माना जाएगा। इस प्लेट से कोई हिट की पहचान नहीं की गई थी।

प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता की पुष्टि करने के लिए, Nexinhib20, जो Rac-2 फ़ंक्शन का विरोध करके β1 इंटीग्रिन सक्रियण को रोकता है, और lifitegrast, जो इंटीग्रिन αLβ2 सीधे32,33 का विरोध करता है, का उपयोग किया गया था। हालांकि, इनक्यूबेशन बार Nexinhib20 के लिए एक घंटे और lifitegrast के लिए आधे घंटे के लिए समायोजित किया गया था। इन प्रयोगों से परिणामी डेटा ऊपर वर्णित एक ही स्केलिंग विधि का उपयोग कर सामान्यीकृत किया गया. इन डेटा बिंदुओं को तब प्लेट परिणामों के साथ जोड़ा गया और सामूहिक रूप से विश्लेषण किया गया (चित्र 4)।

Figure 1
चित्रा 1: यौगिक स्क्रीनिंग के लिए प्लेट लेआउट। एक योजनाबद्ध आरेख एक 384 अच्छी तरह से थाली में स्क्रीनिंग यौगिकों और नियंत्रण की व्यवस्था को दर्शाता है. नकारात्मक नियंत्रण कुओं नीले (कॉलम 1 और 23) में दर्शाया गया है, और सकारात्मक नियंत्रण कुओं लाल (कॉलम 2 और 24) में दिखाए जाते हैं. परीक्षण कुओं बेज (कॉलम 3 से 22) में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. तीर प्लेट को पढ़ने के लिए अनुक्रम का संकेत देते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: घनत्व ढाल माध्यम का उपयोग कर न्यूट्रोफिल जुदाई. प्रतिनिधि तस्वीरें घनत्व ढाल माध्यम का उपयोग करके न्यूट्रोफिल के सफल और असफल पृथक्करण का प्रदर्शन करती हैं। (ए) प्रारंभ में, 4 एमएल रक्त घनत्व ढाल माध्यम के 8 एमएल पर स्तरित होता है। (बी) सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, दो बादल बैंड दिखाई देने चाहिए: ऊपरी बैंड जिसमें मुख्य रूप से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं (पीबीएमसी) होती हैं और निचला बैंड जिसमें कुछ लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) के साथ ज्यादातर न्यूट्रोफिल होते हैं। अधिकांश आरबीसी नीचे की तरफ पेलेट किए जाते हैं। (सी) एक असफल पृथक्करण जहां आरबीसी को गोली नहीं दी जाती है, और न्यूट्रोफिल बैंड नहीं देखा जाता है। न्यूट्रोफिल बैंड को अलग करने के लिए अतिरिक्त सेंट्रीफ्यूजेशन (10-30 मिनट) की आवश्यकता होगी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एफएससी / एसएससी भूखंडों का उपयोग कर न्यूट्रोफिल की गेटिंग। प्रतिनिधि फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) और साइड स्कैटर (एसएससी) न्यूट्रोफिल की पहचान के लिए गेटिंग रणनीति को दर्शाते हुए भूखंड। (ए) न्यूट्रोफिल फ्लो साइटोमीटर द्वारा दर्ज फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी-ए) और साइड स्कैटर (एसएससी-ए) के क्षेत्र के आधार पर गेटेड होते हैं। (बी) एकल कोशिकाओं को आगे स्कैटर की चौड़ाई (एफएससी-डब्ल्यू) और ऊंचाई (एफएससी-एच) के आधार पर गेट किया जाता है, और (सी) साइड स्कैटर की चौड़ाई (एसएससी-डब्ल्यू) और ऊंचाई (एसएससी-एच)। रंग पैमाना सेल घनत्व का प्रतिनिधित्व करता है, घनत्व कम होने पर लाल से पीले, हरे और नीले रंग में संक्रमण होता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एक प्रतिनिधि 384 अच्छी तरह से थाली में स्क्रीनिंग परिणाम. एक प्रतिनिधि 384 अच्छी तरह से थाली से स्क्रीनिंग परिणाम, 0.3 के एक जेड कारक का प्रदर्शन. नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण क्रमशः नीले और लाल बिंदुओं द्वारा इंगित किए जाते हैं। विभिन्न यौगिकों के साथ इलाज किए गए परीक्षण नमूनों को बेज डॉट्स के रूप में दर्शाया जाता है। धराशायी रेखा हिट की पहचान के लिए मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) कट-ऑफ का प्रतिनिधित्व करता है. परीक्षण किए गए यौगिकों में से किसी को भी β2 इंटीग्रिन विरोधी के रूप में पहचाना नहीं गया था, क्योंकि सभी परीक्षण किए गए यौगिकों ने कट-ऑफ लाइन के ऊपर एमएफआई मान प्रदर्शित किए थे। अलग-अलग इनक्यूबेशन समय के साथ ज्ञात β2 इंटीग्रिन विरोधी का परीक्षण करने वाले स्वतंत्र प्रयोगों के परिणाम (1 घंटे के लिए Nexinhib20, आधे घंटे के लिए lifitegrast) इस आंकड़े में प्रस्तुति के लिए जमा किए गए हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

न्यूट्रोफिल उत्तेजना और धुंधला की दीक्षा और समाप्ति न्यूट्रोफिल और लगानेवाला पीएफए के अतिरिक्त द्वारा निर्धारित की जाती है। इसलिए, प्रत्येक स्तंभ में न्यूट्रोफिल या पीएफए को पाइप करने के बीच एक ही समय अंतराल सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है। यह सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक कुएं से न्यूट्रोफिल की उत्तेजना और धुंधला समय लगातार बना रहता है। न्यूट्रोफिल के छोटे जीवनकाल के कारण, दाताओं से रक्त एकत्र करने से लेकर प्रवाह साइटोमेट्री को पूरा करने तक का पूरा प्रयोग उसी दिन किया जाना चाहिए। न्यूट्रोफिल तापमान परिवर्तन के प्रति अत्यधिक संवेदनशील होते हैं और तेजी से तापमान बढ़ने पर सक्रिय हो सकते हैं, जैसे कि 4 डिग्री सेल्सियस से कमरे के तापमान या कमरे के तापमान से 37 डिग्री सेल्सियस तक संक्रमण। इसके अतिरिक्त, हमारे पिछले अनुभव के आधार पर, fMLP-प्रेरित न्यूट्रोफिल β2 इंटीग्रिन सक्रियण तब नहीं होता है जब कोशिकाओं को बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस (डेटा नहीं दिखाया गया) पर संग्रहीत किया जाता है। इसलिए, निर्धारण से पहले, पूरे रक्त और न्यूट्रोफिल को कमरे के तापमान या 20 डिग्री सेल्सियस (अलगाव सेंट्रीफ्यूजेशन चरण के दौरान) पर रखा जाना चाहिए। बर्फ पर पूरे रक्त और न्यूट्रोफिल न रखें।

नकारात्मक नियंत्रणों में mAb24 के धुंधला हो जाना बहुत कम परिणाम उपज चाहिए. यदि एक प्रयोग में एक उच्च mAb24 धुंधला स्तर मनाया जाता है, तो कृपया निम्नलिखित की जांच करें: (1) क्या निर्धारण से पहले प्रयोग के दौरान एक महत्वपूर्ण तापमान परिवर्तन था; (2) क्या न्यूट्रोफिल माध्यम में एफएमएलपी या एंडोटॉक्सिन संदूषण था; (3) क्या नमूना हैंडलिंग बहुत आक्रामक थी, जैसे कि पाइपिंग और मिश्रण के दौरान बुलबुले पैदा करना।

वर्तमान प्रोटोकॉल mAb24 को β2 इंटीग्रिन हेडपीस के उद्घाटन की रिपोर्ट करने के लिए नियोजित करता है। सैद्धांतिक रूप से, KIM127, एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जो β2 इंटीग्रिन 34,35 के विस्तार की रिपोर्ट करता है, का उपयोग mAb24 के साथ संयोजन में β2 इंटीग्रिन रचना का व्यापक रूप से आकलन करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, KIM127 धुंधला (1.5 से 2 गुना) का सिग्नल-टू-शोर अनुपात mAb24 (5 से 10-गुना) जितना अनुकूल नहीं है, जो आमतौर पर 384-वेल प्लेट परख में संतोषजनक Z कारक प्रदान नहीं करता है। 96 अच्छी तरह से थाली परख में, नमूने प्रवाह cytometry प्रदर्शन करने से पहले धोया जा सकता है, घुलनशील एंटीबॉडी व्युत्पन्न पृष्ठभूमि संकेतों को कम. इसलिए, KIM127-आधारित परख 96-अच्छी प्लेट परख में आयोजित की जा सकती है, जिसमें 384-अच्छी प्लेट परख की तुलना में कम थ्रूपुट है।

चूंकि यह विधि दवाओं के एकीकृत निरोधात्मक प्रभाव का आकलन करने के लिए एक रीडआउट के रूप में प्रतिदीप्ति तीव्रता का उपयोग करती है, इसलिए कुछ फ्लोरोसेंट दवाएं परिणामों में हस्तक्षेप कर सकती हैं। इसके अतिरिक्त, विषाक्त दवाएं जो 10 मिनट की उत्तेजना अवधि के भीतर न्यूट्रोफिल मौत को प्रेरित करती हैं, वे इंटीग्रिन निषेध की रिपोर्ट भी करेंगी। ड्रग्स जो न्यूट्रोफिल क्षरण को रोकते हैं, समग्र β2 इंटीग्रिन अभिव्यक्ति को दबा देंगे। इन क्षरण अवरोधकों की पहचान हमारी स्क्रीनिंग में भी की जाएगी। इसलिए, हिट के निरोधात्मक प्रभावों की पुष्टि करने के लिए अन्य नियंत्रणों के साथ माध्यमिक स्क्रीनिंग की आवश्यकता होती है। माध्यमिक स्क्रीन को हिट की कार्रवाई के तंत्र को मान्य और निर्धारित करने के साधन के रूप में संदर्भित किया जाता है। mAb24 परीक्षणों को दोहराने के अलावा, सेल की सतह पर कुल CD18 अभिव्यक्ति का मूल्यांकन पैन एंटी-ह्यूमन CD18 एंटीबॉडी का उपयोग करके किया जाएगा। सक्रिय β2 इंटीग्रिन का स्तर, जैसा कि mAb24 द्वारा मापा जाता है, कुल CD18 अभिव्यक्ति द्वारा सामान्यीकृत किया जाएगा। यह हमें यह निर्धारित करने में सक्षम करेगा कि एजेंट की कार्रवाई के तंत्र में इंटीग्रिन सक्रियण का विरोध करना और/या सेल की सतह पर सीडी 18 की अभिव्यक्ति को रोकना शामिल है या नहीं। हिट के किसी भी विषाक्त प्रभाव को बाहर करने के लिए माध्यमिक स्क्रीन में एक व्यवहार्यता परख भी की जानी चाहिए।

इस प्रोटोकॉल की सीमाएँ हैं। सबसे पहले, mAb24 केवल उन मामलों में β2 I-जैसे डोमेन का पता लगाने में सक्षम है जहां इंटीग्रिन उच्च-आत्मीयता की स्थिति में है। इसलिए, यह α/β I-जैसे एलोस्टेरिक विरोधी जैसे कि mAb24 बाइंडिंग को कम करने के माध्यम से lifitegrast की पहचान नहीं कर सकता है। Lifitegrast अधिक mAb24 बाध्यकारी32 लाती है और mAb24(चित्रा 4)के साथ असामान्य रूप से बढ़ी हुई MFI मान दिखाती है। ऐसे असामान्य मूल्यों के लिए, यह सत्यापित करने के लिए अन्य परखों की आवश्यकता हो सकती है कि क्या ये हिट α/β हैं, जैसे एलोसरिक विरोधी जैसे लिफिटेग्रास्ट। दूसरा, इस परख के लिए Z' कारक उप-इष्टतम है और संभावित रूप से स्वचालित पाइपिंग और आंदोलन के उपयोग के माध्यम से सुधार किया जा सकता है। दुर्भाग्य से, हमारी प्रयोगशाला में इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए आवश्यक उपकरणों का अभाव है। डुप्लिकेटिंग या ट्रिप्लिकेटिंग परख झूठी सकारात्मकता और नकारात्मकता की पहचान करने में सहायक होगी, यदि Z कारक को उपरोक्त विधियों के साथ और बेहतर नहीं बनाया जा सकता है। इसके अलावा, अधिक हिट की पहचान करने के लिए इनक्यूबेशन समय का विस्तार करना फायदेमंद हो सकता है, जैसा कि ज्ञात β2 इंटीग्रिन सक्रियण अवरोधक Nexinhib20 के साथ देखा गया है, जिसके लिए निरोधात्मक प्रभाव उत्पन्न करने के लिए एक घंटे की इनक्यूबेशन की आवश्यकता होती है। यह अध्ययन तेजी से अभिनय करने वाले एजेंटों की पहचान करने पर केंद्रित था। शोधकर्ताओं को ध्यान देना चाहिए कि वे अपनी विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुरूप इनक्यूबेशन समय को संशोधित कर सकते हैं।

हमारे ज्ञान के लिए, यह β2 इंटीग्रिन विरोधी के लिए पहली उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग विधि है। इस दृष्टिकोण का उपयोग छोटे अणु यौगिकों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो सीधे β2 इंटीग्रिन से बंधते हैं और मध्यवर्ती/उच्च-आत्मीयता इंटीग्रिन राज्यों की ओर ले जाने वाले संरूपण परिवर्तनों को रोकते हैं, हाल ही में इंटीग्रिन αIIbβ3 और α4β126 के लिए वर्णित "एगोनिस्टिक" गुणों के बिना विरोधी के समान। न्यूट्रोफिल कई भड़काऊ रोगों में महत्वपूर्ण हैं, जैसे कि मायोकार्डियल इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट 36, सेप्सिस37, और ऑटोइम्यून रोग38,39। एंटीबॉडी-आधारित दवाओं की तुलना में छोटे अणु दवाएं इन बीमारियों के इलाज में अधिक लचीलापन प्रदान कर सकती हैं। हमारी स्क्रीन से हिट सूजन संबंधी बीमारियों के लिए संभावित उपचार प्रदान कर सकते हैं।

वर्तमान विधि एक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी-आधारित, उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन है। चूंकि सक्रियण रिपोर्टर एंटीबॉडी β1 40,41,42,43,44, αIIbβ3 45,46, और αL इंटीग्रिन47,48,49,50 के लिए भी उपलब्ध हैं, इसलिए इस पद्धति को अन्य इंटीग्रिन के लिए विरोधी की पहचान करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। HUTS-21 की तरह एक conformationly संवेदनशील एंटीबॉडी, जो β1 हाइब्रिड डोमेन 51,52,53 को बांधता है, बहुत देर से एंटीजन -4 (VLA-4, इंटीग्रिन α4β1) एलोस्टेरिक विरोधी 54 की पहचान करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन में उपयोग किया गया है। वर्तमान स्क्रीनिंग विधि को उन दवाओं को खोजने के लिए भी संशोधित और विस्तारित किया जा सकता है जो अन्य सतह रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति को रोकते हैं या बढ़ावा देते हैं, जैसे यौगिक जो सिस्टिक फाइब्रोसिस ट्रांसमेम्ब्रेन कंडक्टेंस रेगुलेटर (सीएफटीआर) सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) कोशिकाओं पर सतह अभिव्यक्ति को बढ़ाते हैं। सीएफ में, कई उत्परिवर्तन सीएफटीआर मिसफोल्डिंग की ओर ले जाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप कोशिका झिल्ली55 पर सीएफटीआर की अनुपस्थित अभिव्यक्ति होती है। छोटे अणु दवाओं CFTR अभिव्यक्ति56 को बहाल करने के लिए दिखाया गया है. प्रोटोकॉल संशोधनों के लिए, प्रोटीन अभिव्यक्ति परिवर्तन होने की अनुमति देने के लिए कई घंटों तक दवाओं के इनक्यूबेशन समय को बढ़ाना आवश्यक है।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम फ्लो साइटोमेट्री में उनकी सहायता के लिए UConn Health में फ्लो साइटोमेट्री कोर में डॉ. इवान जेलिसन और सुश्री ली झू को धन्यवाद देते हैं, UConn Health में इम्यूनोलॉजी विभाग में डॉ. लिन पुडिंग्टन को उपकरणों के समर्थन के लिए, सुश्री स्लावा गजेवस्का और डॉ. पॉल एपलटन को रक्त के नमूने प्राप्त करने में उनकी मदद के लिए UConn Health में क्लिनिकल रिसर्च कोर में। हम इस पांडुलिपि के वैज्ञानिक लेखन और संपादन में उनकी मदद के लिए UConn स्कूल ऑफ मेडिसिन के डॉ. क्रिस्टोफर "किट" बोनिन और डॉ. जिनेवा हरगिस को स्वीकार करते हैं। इस शोध को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, नेशनल हार्ट, फेफड़े और ब्लड इंस्टीट्यूट (R01HL145454), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज (P20GM121176), यूएसए से अनुदान, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (18CDA34110426) से एक कैरियर डेवलपमेंट अवार्ड और UConn Health से एक स्टार्टअप फंड द्वारा समर्थित किया गया था। चित्रा 1 BioRender.com के साथ बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16-channel pipettes Thermo 4661090N Instrument
384-well plate Greiner 784201 Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 BioLegend 363410 Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform  Agilent 16050-102 384 multi-channel liquid handler
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
FlowJo Becton, Dickinson & Company NA Software
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Lifitegrast Thermofisher  50-208-2121 Reagents
Nexinhib20 Tocris 6089 Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Sigma F3506 Reagents
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
Plate shaker  Fisher 88-861-023 Instrument
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) Prestwick Chemical Libraries Ver19_384 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol red Gibco 11-835-030 Reagents
Swing-bucket rotor  Eppendorf A-4-62 Rotor
ZE5 Cell Analyzer Bio-Rad Laboratories Model ZE5 Instrument

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 204
इंटीग्रिन-निरोधात्मक दवाओं की स्क्रीनिंग के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित उच्च-थ्रूपुट तकनीक
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Cao, Z., Garcia, M. J., Sklar, L.… More

Cao, Z., Garcia, M. J., Sklar, L. A., Wandinger-Ness, A., Fan, Z. A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs. J. Vis. Exp. (204), e64401, doi:10.3791/64401 (2024).

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