Summary
신호 전달 경로의 광유전학적 조작은 발달, 재생, 항상성 및 질병에서 신호전달이 어떻게 해독되는지 조사하는 강력한 전략이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 초기 제브라피시 배아에서 광-산소-전압 감지 도메인 기반 결절 및 뼈 형태 형성 단백질(BMP) 신호 활성제를 사용하기 위한 실용적인 지침을 제공합니다.
Abstract
신호 전달 경로는 발달, 재생, 항상성 및 질병을 포함한 기본적인 생물학적 과정을 조율합니다. 시그널링을 실험적으로 조작하는 방법은 이러한 광범위한 컨텍스트에서 시그널링이 어떻게 해석되는지 이해하는 데 필요합니다. 분자 광유전학 도구는 높은 수준의 시공간 제어로 신호 전달 경로 활성의 가역적이고 조정 가능한 조작을 제공할 수 있으며 in vitro, ex vivo 및 in vivo에 적용되었습니다. 이 도구는 청색광 동질화 광-산소-전압 감지(LOV) 도메인과 같은 빛에 반응하는 단백질 도메인을 신호 효과기와 결합하여 신호 전달에 대한 빛에 의존하는 실험 제어를 제공합니다. 이 프로토콜은 광학적으로 접근 가능한 초기 제브라피시 배아에서 LOV 기반 뼈 형태 형성 단백질(BMP)과 결절 신호 활성제인 bOpto-BMP 및 bOpto-Nodal을 사용하기 위한 실용적인 지침을 제공합니다. 적절한 실험 조건을 결정하기 위한 빠른 표현형 분석과 신호 전달을 직접 평가하기 위한 면역형광 분석의 두 가지 대조군 실험에 대해 설명합니다. 이러한 대조군 실험은 초기 제브라피시 배아에서 광유전학 도구를 사용하기 위한 파이프라인을 구축하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 전략은 발달, 건강 및 생리학에서 신호 전달의 역할을 조사할 수 있는 강력한 플랫폼을 제공합니다.
Introduction
신호 전달 경로를 통해 세포는 환경에 반응하고 조직 및 유기체 전체 규모에서 활동을 조정할 수 있습니다. 배아 발달에 중요한 신호에는 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원, 뼈 형태 형성 단백질(BMP) 및 결절 1,2,3이 포함됩니다. 배아 발생 과정에서 이러한 신호와 다른 신호에 의해 조절되는 경로는 유전자 발현과 추가 과정을 제어하여 다양한 조직과 기관이 적절하게 발달하고 상호 작용하도록 함으로써 신체 계획을 패턴화합니다. 선천적 기형과 암을 포함한 병리학은 신호전달 또는 신호전달에 대한 반응이 교란될 때 발생할 수 있다 4,5,6,7. 시그널링에 대한 엄격한 조사에도 불구하고, 레벨과 동역학이 다양한 맥락 8,9,10,11, 특히 개발 과정에서 어떻게 디코딩되는지에 대해서는 훨씬 더 많은 것이 발견되어야 한다 12,13,14,15,16,17,18,19.
시그널링이 디코딩되는 방식을 이해하기 위한 이상적인 실험은 높은 수준의 공간적, 시간적 제어를 통해 시그널링 레벨, 타이밍 및/또는 역학을 조작하고 결과를 평가하는 것입니다. 예를 들어, 발달 조직(20,21)을 패턴화하기 위해 정확한 공간 신호 구배가 제안된다. 신호 기울기 공간 분포를 변경하면 이 가설을 테스트하는 데 도움이 될 것입니다22. 또한, 다양한 세포 반응을 생성하는 데 있어 신호전달 역학의 중요성이 더욱 명확해지고 있다: 동일한 신호전달 경로는 세포가 신호전달 주파수에 따라 분화하거나 증식하도록 지시할 수 있다(예: 9,23). 신호전달 역학을 쉽게 조작할 수 있는 실험적 패러다임은 역학과 세포 운명 결정사이의 관계를 탐구하는 데 유용할 것이다 8,12,13,14,15.
역사적으로, 발달 맥락에서 신호 전달을 조작하기 위해 여러 가지 방법이 사용되어 왔으며, 이는 근본적인 발견으로 이어졌습니다 1,2,3. 신호전달은 pathway loss-loss-of-function mutant, ectopic inhibitor expression 또는 antagonist drugs를 사용하여 차단할 수 있습니다. 신호전달을 활성화하는 방법으로는 작용제 약물, 재조합 리간드, 리간드 또는 구성적으로 활성화된 수용체의 이소성 발현, 및 경로 억제제 기능 상실 돌연변이체가 있습니다. 이러한 방법은 실험 제어의 연속체를 따라 다양합니다. 예를 들어, 돌연변이와 이소성 발현은 연속체의 큰 망치 쪽에 속할 수 있습니다: 이러한 접근법을 사용하면 경로 활성의 극적이고 체계적인 변화로 인해 조기 사망이 발생하고 후기 단계에서 조사가 불가능할 수 있으며, 시간이 지남에 따라 풀기 어려운 다원성 효과가 발생할 수 있습니다. 또한 레벨 또는 지속 시간과 같은 한 번에 하나의 신호 기능을 독립적으로 조작하는 것이 어려운 경우가 많습니다. 연속체의 다른 쪽 끝으로, 시간적 및 때로는 공간적 제어가 있는 약물 또는 재조합 단백질에 샘플을 노출시키는 미세유체 장치 18,24,25 또는 유사한 이점을 제공할 수 있는 열 충격 유도 및 조직 특이적 프로모터를 포함하는 유전적 방법과 같은 일부 방법은 보다 정밀한 실험 제어를 제공합니다16,26,27. 그러나 이러한 방법은 실행하기 어렵고, 가역적이지 않을 수 있으며, 상대적으로 느린 역학 또는 불량한 분해능을 가질 수 있으며, 일부 모델 시스템에서는 사용하지 못할 수 있습니다.
분자 광유전학적 접근법은 이 툴킷에 추가된 강력한 기능입니다. 이러한 접근법은 신호 전달 8,12,13,14,15를 포함한 생물학적 과정을 조작하기 위해 다양한 광 파장에 반응하는 단백질을 사용하며, 세포 배양에서 전체 동물에 이르기까지 다양한 시스템에서 사용하기 위해 수십 년에 걸쳐 개발 되었습니다12,13,28. 과거의 접근법과 비교했을 때, 분자 광유전학은 종종 생물학적 과정에 대한 더 높은 수준의 시공간 제어를 제공할 수 있습니다: 광유전학 시스템의 컨트롤러는 빛이며, 빛의 파장, 강도, 지속 시간 및 노출 주파수의 제어는 비교적 간단합니다. 공초점 및 이광자 현미경과 같은 정교한 시스템을 사용하면 세포 내 범위의 공간 제어가 가능합니다 29,30,31. 신호전달을 광유전학적으로 조작하는 도구들은 Johnson et al.22, Čapek et al.32, Krishnamurthy et al.33 및 Huang et al.34에 기술된 것을 포함하여 여러 시스템에서 개발되고 적용되었다. 예를 들어, 광유전학(optogenetics)이 제공하는 공간적 제어(spatial control)를 이용하여, 이 전략은 최근 초파리 배아(Drosophila embryos)의 신호 구배(signaling gradient)를 수정하는 데 사용되었으며, 이는 파리 배아발생(fly embryogenesis)이 이 구배(gradient)의 변화에 놀라울 정도로 견고하다는 것을 보여주었다22. 광유전학적 신호전달 활성제의 가역성 및 빠른 온/오프 동역학은 또한 신호전달 역학 8,12,13,14,15,34,35,36의 디코딩을 조사하기 위한 매력적인 도구가 되었습니다.
초기 제브라피시 배아는 외부 수정이 가능하고, 투명하며, 현미경 검사 친화적이고, 유전적으로 다루기 쉽기 때문에 광유전학 연구에 매우 적합한 생체 내 시스템입니다. 빛에 노출되면 모체 밖에서 발달하는 배아에 전달하기가 더 쉽고, 빛은 불투명하지 않은 조직을 관통하여 접근할 수 있으며, 살아있는 제브라피시 배아는 이미징을 잘 견디며(투명할 뿐만 아니라), 기존의 유전적 방법은 유용한 형질전환유전자의 개발 외에도 녹다운(knockdown) 및 과발현 실험을 위한 직접적인 기회를 제공한다37.
최근에는 청색광에 노출된 제브라피시 배아에서 BMP38 및 Nodal39 신호 전달을 활성화하기 위한 광유전학 도구가 개발되었습니다(그림 1). 이러한 도구를 bOpto-BMP 및 bOpto-Nodal(b는 청색광 활성화, Opto는 광유전학)이라고 합니다. bOpto-BMP/Nodal은 유사한 경로 활성화 메커니즘을 기반으로 합니다. 각각의 수용체 세린-트레오닌 키나아제에 대한 BMP 또는 결절 리간드의 결합은 신호 효과기(BMP의 경우 Smad1/5/9 및 결절의 경우 Smad2/3)의 인산화로 이어지는 수용체 키나아제 도메인 상호 작용을 유도합니다. 그런 다음 인산화된 신호 전달 효과기는 핵으로 전위되어 표적 유전자 발현3을 조절합니다(그림 1A,D). 이러한 수용체 키나아제 상호작용은 수용체 키나아제를 빛에 반응하는 이합체 단백질에 결합시킴으로써 빛에 반응하게 할 수 있습니다: 빛에 노출되면 이러한 키메라 단백질이 이합체화되어 수용체 키나아제 도메인이 상호 작용하고 신호를 활성화해야 합니다(그림 1B,C,E,F). 중요한 것은 내인성 수용체와 달리 bOpto-BMP/Nodal은 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하지 않아 리간드 독립적 활성을 보장한다는 것입니다(그림 1C,F). 이 광유전학적 활성화 전략은 수용체 티로신 키나아제40,41,42로 먼저 달성된 다음 수용체 세린-트레오닌 키나아제에 적용되었습니다.
bOpto-BMP/Nodal은 조류 Vaucheria fridiga AUREO450 단백질(VfLOV)의 청색광 반응성(~1nm) 호모다이머화 광-산소-전압 감지(LOV) 도메인을 사용합니다.43,44. 이러한 구성물은 막-표적화 미리스토일화 모티프와 LOV 도메인에 융합된 BMP 또는 Nodal 수용체 키나아제 도메인으로 구성됩니다(그림 1B,E). 청색광 노출은 LOV 동질화(homodimerization)를 일으켜 각각의 Smad 인산화 및 경로 활성화로 이어지는 수용체 키나아제 도메인 상호 작용을 초래합니다(그림 1C,F). bOpto-BMP의 경우, Acvr1l(Alk8이라고도 함) 및 BMPR1aa(Alk3라고도 함)의 I형 수용체 키나아제 도메인과 BMPR2a의 II형 수용체 키나제 도메인과의 구축물의 조합이 신호전달38(Addgene #207614, #207615 및 #207616)을 최적으로 활성화하는 것으로 밝혀졌습니다. bOpto-Nodal의 경우, Acvr1ba로부터의 유형 I 수용체 키나제 도메인 및 Acvr2ba로부터의 유형 II 수용체 키나제 도메인과의 구축물의 조합이사용된다 39.
bOpto-BMP/Nodal은 단세포 단계에서 mRNA를 주입하여 초기 제브라피시 배아에 도입되었으며, Nodal 해석39에서 신호 지속 시간의 역할을 조사하고, 제브라피시가 Nodal45에 반응하는 능력을 상실하는 이유를 결정하고, BMP 표적 유전자가 다양한 BMP 신호 수준38에 어떻게 반응하는지 조사하는 데 사용되었습니다. 이러한 도구는 향후 다양한 조사에서 계속 유용할 것입니다. 그러나 광유전학적 신호 활성제의 강점은 약점이기도 합니다: 빛에 민감한 샘플은 의도하지 않은 이소성 신호 활성을 피하기 위해 주의해서 처리해야 합니다. 실내 조명이나 햇빛에 노출되면 bOpto-BMP/Nodal이 활성화될 수 있습니다.
이 프로토콜은 초기 제브라피시 배아에서 mRNA 인코딩 LOV 기반 BMP 및 Nodal 활성제를 사용하기 위한 실용적인 제안을 제공합니다. 균일한 빛 노출과 온도를 제어하기 위해 라이트 박스를 구축하는 한 가지 전략을 자세히 설명하는 것으로 시작합니다(그림 2, 보충 파일 1, 보충 파일 2, 보충 파일 3, 보충 파일 4, 보충 파일 5, 보충 파일 6, 보충 파일 7, 보충 파일 8). 그런 다음 광유전학적 신호 활성제가 예상대로 작용하는지, 즉 빛에 노출되었을 때만 경로 활성을 활성화하는지 여부를 결정하는 두 가지 주요 제어 실험에 대해 설명합니다(그림 3). 첫 번째 대조군 분석은 빛에 노출된 배아와 노출되지 않은 배아에서 수정 후 1일에 표현형을 검사하는 것입니다(그림 3A). mRNA가 주입된 빛에 노출된 배아(노출되지 않은 배아는 아님)는 표현형 BMP 또는 결절 과발현(그림 4A,B; 특히 BMP 표현형은 이 시점(46)에서 명확하게 구별할 수 있다. 이 분석은 빠른 활성 판독을 제공합니다. 제2 대조군 분석에서, 표현형이 특이적으로 과도한 BMP 또는 결절 신호전달에 의해 유발되는지 여부를 결정하고 신호전달 수준의 변화를 직접 관찰하기 위해, 면역형광 염색을 사용하여 후기/초기 배반기/초기 위축단계 부근에서 20분 동안 빛에 노출된 후 인산화된 신호전달 효과기(각각 pSmad1/5/9 또는 pSmad2/3)를 검출하고, 신호전달 활성이 잘 기술된 경우12, 16,17,47,48,49,50 (그림 3B 및 그림 4C). (bOpto-BMP38 및 bOpto-Nodal39 모두에 대해 공간적으로 국소화된 활성화가 입증되었지만, 이 프로토콜은 균일한 광 노출 및 신호 활성화 전략만 설명합니다.) 이상적인 국소 실험 조건을 결정하기 위해 특정 연구 질문에 bOpto-BMP/Nodal을 적용하기 전에 이러한 대조 실험을 실행하는 것이 좋습니다.
Protocol
제브라피시 연구 프로토콜은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 NICHD 동물 관리 및 사용 위원회(ASP 21-008)에서 검토 및 승인되었습니다. 모든 제브라피시 연구는 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었습니다.
1. 라이트 박스 만들기
- 빛 노출 및 온도를 제어하려면 발광 다이오드(LED) 마이크로플레이트 조명기를 광원으로 사용하는 라이트 박스를 구성합니다(그림 2A, 재료 표, 보충 파일 1, 보충 파일 2). 이 맞춤형 조명기는 여러 파장에 대해 동적으로 프로그래밍 가능한 제어를 제공합니다.
참고: 라이트 박스를 구축하기 위한 여러 가지 가능한 전략이 있으며 다른 접근 방식이 더 적절할 수 있습니다(예: Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar and Khammash 53 및 https://www.optobase.org/materials/ 참조). - 라이트 박스에는 온도 제어(28°C가 제브라피시 배아에 이상적), 원치 않는 빛(예: 실내 조명 및 햇빛) 차단, 대상 영역을 덮는 청색광의 균일한 전달(예: 6웰 플레이트), 광도 및 노출 역학 제어와 같은 기능이 포함되어 있습니다.
알림: bOpto-BMP/Nodal은 청색광에 의해 활성화되지만 일부 광유전학 도구는 다른 파장에 반응합니다. 광유전학 도구에 적합한 파장을 사용하십시오. - 인큐베이터 상단(그림 2B)을 통해 LED 출력 렌즈보다 약간 넓은 구멍을 뚫습니다.
- 인큐베이터 상단에 드릴로 인해 파괴될 전기 부품이 없는지 확인하십시오(재료 표). 이는 인큐베이터 제조업체에 연락하여 직접 문의하여 확인할 수 있습니다.
- 인큐베이터의 상단 패널에 기존 구멍이 있는 경우 스텝 드릴을 사용하여 구멍 크기를 1.25인치로 늘립니다. 그렇지 않으면 아버가 있는 1.25인치 구멍 톱을 사용하십시오.
- 광원을 차단하는 내부 패널이 있는 경우 라이트 콘이 막히지 않도록 적절한 구멍 크기를 뚫습니다(그림 2A). 패널은 일반적으로 얇은 판금으로 만들어지므로 손상을 방지하기 위해 저속과 금속 드릴 비트를 사용하십시오(코발트 드릴 비트 권장).
- LED 마이크로플레이트 조명기를 인큐베이터 상단에 고정하기 위한 LED 홀더를 구성합니다(그림 2C, 보충 파일 3, 보충 파일 4, 보충 파일 5, 보충 파일 6, 보충 파일 7, 보충 파일 8).
- M3 나사를 사용하여 4개의 M3 큐브 스탠드오프를 수직 브래킷 조각에 장착합니다.
- 두 개의 측면 브래킷을 수직 브래킷의 큐브 스탠드오프의 왼쪽과 오른쪽에 부착합니다. 측면 브래킷의 남은 구멍에 다른 큐브 스탠드오프를 장착합니다.
- M6 나사를 사용하여 수직 브래킷 조각을 LED 마이크로플레이트 조명기 어셈블리(재료 표)에 장착합니다. LED 렌즈 개스킷을 LED 시스템 렌즈 위에 놓습니다.
- 조립된 부품을 인큐베이터 패널 마운트에 장착한 다음 수직 및 측면 브래킷의 M3 스탠드오프에 장착합니다. 인큐베이터 상단의 뚫린 구멍 위에 인큐베이터 개스킷을 놓습니다.
- 인큐베이터 패널 마운트를 인큐베이터 개스킷 위에 놓고 개스킷과 패널 구멍이 인큐베이터의 구멍과 동심원이 되도록 합니다. 8번 나사를 사용하여 패널을 인큐베이터 상단에 장착합니다. 이 씰이 빛이 새지 않는지 확인하십시오.
- 인큐베이터의 상단 선반에 6웰 플레이트를 놓습니다. 광선이 플레이트를 균일하게 덮는지 확인합니다(그림 2A). 종이 한 장을 사용하여 빛의 범위를 시각화합니다.
- 전체 플레이트가 빔으로 덮여 있지 않은 경우 선반을 아래로 이동하여 LED와 플레이트 사이의 거리를 늘리십시오. 여기에 설명된 시스템의 경우 LED와 선반 사이에 ~14인치면 충분합니다.
- 조도계를 사용하여 방사 조도 수준과 공간 균일성을 결정합니다(재료 표).
- 부주의한 햇빛과 실내 조명 노출을 방지하려면 웨더 스트리핑을 사용하여 인큐베이터 도어가 빛을 차단하도록 합니다(그림 2A).
- 제브라피시 배아는 28°C54에서 튼튼하게 발달한다. 메모리 카드 온도계를 사용하여 라이트 박스가 28°C를 유지하는지 확인합니다.
2. 주입용 mRNA 생성
참고: pCS2+는 bOpto-BMP 구조체(38 ) 및 bOpto-Nodal 구조체(39)에 대한 벡터 백본입니다. 이 벡터는 암피실린에 내성이 있습니다. bOpto-BMP는 세 가지 구성물로 구성됩니다(그림 1B): BMPR1aa-LOV(Addgene # 207614): LOV에 융합된 유형 I BMPR1aa 수용체(Alk3라고도 함)의 추정 키나아제 도메인; Acvr1l-LOV (Addgene # 207615) : LOV에 융합 된 유형 I Acvr1l 수용체 (Alk8이라고도 함)의 추정 키나아제 도메인; 및 BMPR2a-LOV (Addgene # 207616) : 유형 II BMPR2a 수용체 및 LOV에 융합 된 C- 말단 도메인의 추정 키나아제 도메인. bOpto-Nodal은 두 가지 구성물로 구성됩니다 (그림 1E) : Acvr1ba-LOV : LOV에 융합 된 유형 I Acvr1ba 수용체 (Acvr1b라고도 함)의 추정 키나아제 도메인; Acvr2ba-LOV: LOV에 융합된 유형 II Acvr2ba 수용체(Acvr2b라고도 함)의 추정 키나아제 도메인.
- 플라스미드를 선형화하기 위해 NotI 제한 효소를 사용하여 37°C에서 1-3시간 동안 2-5μg 사이의 플라스미드 DNA를 절단합니다(재료 표).
NOTE: 플라스미드를 PCR 템플릿으로 사용하여 선형화된 DNA를 생성할 수도 있습니다. - 표준 컬럼 기반 정제 키트(Table of Materials)를 사용하여 DNA를 정제합니다.
- mMessage mMachine 키트와 같은 in vitro SP6 전사 키트를 사용하여 선형화된 템플릿(재료 표)에서 RNA를 전사합니다. 더 높은 수율을 보장하기 위해 제조업체의 권장 사항에 따라 두 가지 반응을 설정합니다.
- 표준 컬럼 기반 RNA 세척 키트(Table of Materials)를 사용하여 RNA를 정제합니다. 침전을 통해 정화하는 것도 가능합니다.
3. mRNA 주입
- 주사 최소 1일 전에 주사 접시와 아가로스 코팅된 6웰 플레이트를 만드십시오.
- 제브라피시 배아 배지에 1% 아가로스 200mL를 준비하고 아가로스가 완전히 녹을 때까지 전자레인지에 돌립니다. 모든 표준 제브라피시 배아 배지가 허용되어야 합니다. 그러나 배아 배지에서 메틸렌 블루는 다른 응용 분야의 다운스트림 이미징에 영향을 미칠 수 있으므로 제외하십시오.
- 녹은 아가로스를 100mm x 15mm 플라스틱 페트리 접시에 조심스럽게 붓습니다. 접시를 반쯤 채웁니다.
- 배아 배지로 주입 접시 몰드를 헹구고 용융된 아가로스 위에 부드럽게 올려 놓고 곰팡이와 아가로스 사이에 기포가 끼지 않도록 합니다. 테이프를 사용하여 금형 뒷면에 탭을 만들어 쉽게 배치하고 회수할 수 있습니다.
- 곰팡이는 용융된 아가로스에 떠야 합니다. 금형이 가라앉으면 용융된 아가로스에서 조심스럽게 제거하고 3.1.3단계를 반복합니다.
- 아가로스가 응고되면 탭을 사용하여 몰드를 부드럽게 제거합니다. 이것은 접시를 4 °C에 두면 가속화될 수 있습니다.
- 면역 형광 실험을 위해 탈융모 배아로 작업하는 경우 아가로스 코팅된 6웰 플레이트를 만드십시오.
- 일회용 10mL 플라스틱 피펫을 사용하여 6웰 플레이트의 각 웰 바닥을 덮을 만큼 충분한 용융 아가로스를 옮깁니다.
- 주입 접시와 6웰 플레이트는 4°C에서 보관하십시오. 즉시 사용하거나 아가로스가 건조되거나 오염될 때까지(보통 2-3주) 보관할 수 있습니다.
- 면역 형광 실험을 위해 탈코이온화된 배아로 작업하는 경우 화염 유리 피펫 팁을 준비합니다.
- 유리 피펫의 끝을 분젠 버너 불꽃에 삽입하고 가장자리가 매끄러워질 때까지 계속 돌립니다. 탈막화된 배아는 피펫 끝에 편안하게 맞아야 합니다. 개구부가 배아의 직경 아래로 줄어들지 않도록 하십시오.
- 미세 주입 바늘을 구입하거나 당깁니다(재료 표). 교체가 필요한 경우를 대비하여 주사 당일에 여분의 바늘을 준비하는 것이 좋습니다.
- 주사 전날, 연구소의 표준 운영 절차(SOP)에 따라 제브라피시 사육자를 설정합니다. 남성과 여성을 분리하십시오.
- 라이트 박스 온도 조절기를 켜서 28°C를 유지합니다. 라이트 박스 온도가 28°C로 유지되도록 하려면 메모리 카드 온도계를 사용하여 온도를 모니터링하십시오(재료 표).
- mRNA 주입 혼합물을 준비합니다. 각 구성물의 등몰 양을 주입합니다. 주입할 양을 경험적으로 결정할 필요가 있습니다.
- bOpto-BMP 대본 크기는 다음과 같습니다.
Acvr1l-LOV = 2007 뉴클레오티드(nt)
BMPR1aa-LOV = 1983 nt
BMPR2a-LOV = 3409 nt - 등몰량을 주입하려면 BMPR1aa보다 Acvr1l 구조체를 1.01배 더 많이 주입합니다. BMPR1aa보다 BMPR2a 구조체를 1.72배 더 많이 주입합니다.
- bOpto-Nodal 전사체 크기는 다음과 같습니다.
Acvr1ba-LOV와 Acvr2ba-LOV는 모두 1962 nt입니다. - 등몰 양을 주입하려면 각 구성물에 동일한 양을 주입합니다.
- 하나의 경로를 표적으로 하는 모든 mRNA를 하나의 주입 혼합물로 결합하는 등몰 주입 혼합물을 준비합니다. 원하는 경우 페놀 레드 주입 추적자를 포함합니다. 도 4에 도시된 데이터를 위해, 각 bOpto-Nodal 구조체(Acvr1ba-LOV 및 Acvr2ba-LOV)의 15 pg를 사용하였고, bOpto-BMP의 경우 7.8 pg Acvr1l-LOV 및 BMPR1aa-LOV, 및 13.4 pg BMPR2a-LOV를 사용하였다.
- 주입 혼합물은 -20 °C에서 보관하십시오. 주입 혼합물의 최적 농도가 결정되면 5-10 μL 부분 표본을 만들어 -20 °C 또는 -80 °C에서 보관합니다.
- 주입일
- 표현형 분석(그림 3A)을 수행하는 경우 실험실의 SOP에 따라 단일 세포 단계에서 융모막을 통해 세포 중앙에 직접 주입합니다. 융모막은 환경적 스트레스 요인으로부터 배아를 보호하고 용해된 배아를 격리합니다. 이는 용해된 배아의 정확한 정량화를 위해 스코어링하는 동안 유용합니다(그림 4A,B).
- 면역형광 분석(그림 3B)을 수행하는 경우, 이미징을 위해 배아를 탈코리온화해야 합니다(그림 4C). 그러므로, 단세포 단계에서 탈코리온화된 배아의 세포 중앙에 직접 주사한다(탈코리오네이션 프로토콜에 대해서는 Rogers et al.55 참조). 또는 배아는 고정 후 수동으로 탈코리오네이트될 수 있지만 이는 프로나제로 탈코리오네이션하는 것보다 더 번거롭습니다.
- 화염 유리 피펫을 사용하여 탈막화된 배아를 처리합니다(3.1.10단계). 탈농축된 배아를 공기나 플라스틱에 노출시켜 배아를 용해시키지 않도록 주의하십시오. 융모가 제거된 배아를 부드럽게 다루십시오.
- 단계 진행을 평가하기 위해 대리물로 주입되지 않은 배아의 추가 접시를 준비합니다(4.3.5단계 참조). 대리 배아가 동일한 실험 배아 세트에서 나온 것인지 확인하여 모든 배아가 동일한 부모로부터 동시에 수정되었는지 확인합니다. 이는 스테이지가 관련이 있지만 표현형 분석에는 필요하지 않은 immunofluorescence assay에 유용합니다.
- 표현형 분석 및 면역형광 분석 모두에 1) 비주입, 비노출, 2) 비주입, 빛에 노출, 3) 주입, 비노출, 4) 주입, 빛에 노출 등의 조건을 사용합니다. 조건당 최소 30개의 배아를 선택합니다. 최적의 배아 건강을 위해 6웰 플레이트에 웰당 30개 이상의 배아를 배양하지 마십시오.
- 주입 후, 배아를 라벨이 부착된 페트리 접시 또는 아가로스 코팅된 6-웰 플레이트(탈코리온화 배아용)로 옮기고 28°C에서 배양합니다. 배아는 아직 빛에 민감하지 않습니다. 주입된 배아는 수정 후 1.5시간(hpf) 후에 빛에 민감한 것처럼 취급합니다.
4. 노광 실험
알림: 450W/m2 의 조도로 ~450nm 빛에 노출되면 명백한 광독성 없이 bOpto-BMP/Nodal이 강력하게 활성화됩니다(조도계 정보는 재료 표 참조). 광유전학적으로 활성화된 신호전달의 수준은 조도 값(38)을 변경함으로써 조정될 수 있다. 그러나 광독성은 더 높은 조도에서 평가해야 합니다.
- 시간에 민감한 단계. 약 1.5hpf의 4-16세포 단계에서 수정되지 않은 건강하지 않은 배아를 제거합니다. 필요한 경우 재분배하여 각 웰에 동일한 수의 배아(30개 이하)를 확보합니다.
참고: 주입된 mRNA가 단백질로 번역됨에 따라 배아가 빛에 민감해지기 때문에 4-16세포 단계에서 이 단계를 수행하는 것이 중요합니다. 우리는 배아가 1.5hpf 이전에 빛에 상당히 민감하다는 증거를 관찰하지 못했습니다. 1.5hpf 이후에 배아를 평가할 때 의도하지 않은 광활성화를 최소화하려면 적색광을 사용하거나 LOV-dimerizing 청색 파장을 차단하는 적색 젤 여과지로 광원(현미경 스테이지 포함)을 덮습니다(재료 표).- 조건과 실험 사이에 편향되지 않은 분포를 보장하기 위해 배아를 일관되게 평가합니다.
- 표현형 분석의 경우 1.5hpf에서 시작하는 다음 1일 빛 노출 프로토콜을 사용합니다(그림 3A).
- 노출되지 않은 제어판을 알루미늄 호일로 감쌉니다. 이 플레이트에는 주입되지 않은 배아와 주입된 배아가 모두 포함되어야 합니다. 플레이트가 완전히 덮여 있는지 확인하고 호일에 찢어지지 않도록 주의하십시오. 이 플레이트를 28°C 라이트 박스의 하단 선반에 놓습니다(그림 2A).
- 노출판을 28°C 라이트 박스의 상단 선반에 놓습니다(그림 2A). 배아 배지 증발을 방지하기 위해 덮개가 접시 위에 있는지 확인하십시오. 청색광을 켭니다(45W/m2 의 조도는 신호를 강력하게 활성화합니다).
- 실수로 실내 조명에 노출되는 것을 방지하기 위해 라이트 박스 도어를 닫으십시오. 원하는 경우 도어를 닫기 전에 라이트 박스 내부에 메모리 카드 온도계를 포함하십시오. 수정 후 1일(dpf, 5.1단계 참조)에 표현형이 점수화될 때까지 문을 열지 마십시오.
- 면역형광 분석의 경우, 약 40% epiboly56 (~6 hpf)부터 시작하여 배아를 20분 동안 청색광에 노출시키고 노출되지 않은 대조군과 함께 빛에 노출된 직후 고정합니다(그림 3B). 40% 에피볼리에서 20분 동안 청색광에 노출되면 신호 전달이 재현 가능하게 활성화됩니다.
- 약 1.5hpf, 노출된 접시와 노출되지 않은 접시를 알루미늄 호일로 별도로 포장합니다. 접시가 완전히 덮여 있는지 확인하고 호일에 찢어지지 않도록 주의하십시오. 대리 접시를 포장하지 않은 상태로 두십시오. 포장된 접시와 포장을 뜯지 않은 대리 접시를 28°C 라이트 박스에 넣습니다(그림 2A). 아직 LED를 켜지 마십시오.
- 노출되지 않은 상태에 대해 두 개 이상의 mRNA 양을 검사하는 경우 서로 다른 양으로 주입된 배아를 개별 아가로스 코팅된 6웰 플레이트로 분류하면 후속 고정 중에 의도하지 않은 빛 노출을 최소화하는 데 도움이 됩니다.
- 실수로 실내 조명에 노출되는 것을 방지하기 위해 라이트 박스 도어를 닫으십시오.
- 포름알데히드 스톡을 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 4%로 희석하고 사전 라벨링된 2mL 둥근 바닥 마이크로 원심분리기 튜브에 1mL를 분취합니다(조건당 튜브 1개). 4 °C에서 보관하십시오.
- 약 5hpf에서 주입되지 않은 배아가 들어 있는 대리 접시를 제거하고 해부 스코프를 사용하여 발달 단계를 평가합니다. 대리 배아의 단계는 포장된 접시에 있는 빛에 민감한 배아의 단계를 반영해야 합니다.
- 포장된 접시도 제거하여 모든 접시가 동일한 온도를 갖도록 합니다. 대리 배아가 40% 에피볼리(~6hpf)에 도달할 때까지 반복합니다. 배아 발생 진행은 온도에 민감하다54; 따라서 접시가 인큐베이터 외부에 있는 시간이 길수록 배아가 40% 에피볼리에 도달하는 데 더 오래 걸립니다.
- 대리 배아가 40% 에피볼리에 도달하면 노출된 접시의 포장을 풀고 라이트 박스의 상단 선반에 놓습니다(그림 2A). 노출되지 않은 접시는 포장된 상태로 두고 하단 선반에 놓습니다. 즉시 파란색 조명을 켜고 문을 닫은 다음 타이머를 20분으로 설정합니다(45W/m2 의 조도는 신호를 강력하게 활성화함).
- 고정을 준비하려면 가능한 한 많은 실내 조명을 제거하십시오(창문 블라인드 닫기, 머리 위 조명 끄기, 스크린 끄기 등). 포름알데히드 함유 튜브에 적절한 라벨이 부착되어 있는지 확인하십시오. 고정 직전에 4°C에서 포름알데히드 함유 튜브를 제거하고 라이트 박스 옆에 놓습니다.
- 시간 및 빛에 민감한 단계. 20분의 빛 노출이 끝나면 빠르게 움직일 준비를 하십시오. 20분 후 라이트 박스 도어를 열고 노출되지 않은 접시를 꺼냅니다.
- 화염 유리 피펫 팁을 사용하여 빛에 민감한 배아를 준비된 4% 포름알데히드 튜브로 빠르고 부드럽게 옮깁니다.
- 빛에 민감한 배아의 이식 시간(<45초)을 최소화하여 의도하지 않은 빛 노출을 방지합니다. 피펫에 기포가 없는지 확인하십시오. 공기 노출은 탈막화된 배아를 파괴합니다.
- 배아를 포름알데히드로 배출하려면 유리 피펫 팁을 포름알데히드에 담그고 배아가 액체에 가라앉도록 합니다. 포름알데히드로 전달되는 배아 배지의 양을 최소화하여 배아를 팁 끝에 보관합니다.
- 배아를 이식한 후 피펫을 동일한 웰에 다시 넣고 위아래로 피펫팅하여 붙어있는 배아를 제거합니다. 이렇게 하면 여러 조건의 배아가 우연히 하나의 난관에 갇히는 것을 방지할 수 있습니다.
- 노출되지 않은 비주사 배아에 대해 즉시 4.3.11-4.3.13단계를 반복한 다음 노출된 배아(주입 및 비주사)를 반복합니다.
- 고정된 배아를 4°C에서 하룻밤 동안 보관합니다.
5. 실험 평가
- 표현형 스코어링 및 이미징
- 1 dpf, 이상적으로는 24-32 hpf 사이에서 라이트 박스에서 배아를 제거하여 해부 스코프를 사용하여 표현형을 평가하고 채점 기준표를 만듭니다. 이것이 실험 종점입니다. 의도하지 않은 광활성화는 더 이상 문제가 되지 않습니다.
- 편의를 위해 융모막에 있는 동안 배아에 점수를 매기십시오. 피펫 또는 프로브를 사용하여 배아를 움직여 여러 각도에서 볼 수 있습니다.
- 과도한 BMP 신호전달을 경험하는 배아는 Kishimoto et al.에 상세히 기술된 바와 같이 다양한 정도의 중증도로 복화될 것이다. 199746 (그림 4A, 왼쪽 패널). 과도한 결절 신호전달을 경험하는 배아는 과도한 중배엽과 관련된 다양한 발달 결함을 갖게 됩니다(그림 4A, 오른쪽 패널)1,3,47,57,58,59,60. 그들은 종종 1dpf로 용해되었을 것입니다.
- 모든 조건에서 각 배아에 점수를 매깁니다(그림 4B). 각 웰에 있는 모든 배아의 개요 이미지를 획득합니다. 원하는 경우, 메틸셀룰로오스에서 개별 대표 배아를 탈코리오네이트하고 이미지화합니다(그림 4A).
- 면역형광 염색 및 이미징
- 4°C에서 4% 포름알데히드로 배양을 하룻밤 동안 배양한 후 포름알데히드를 제거하고 Tween20(PBST)이 있는 1x 인산염 완충 식염수로 3-5배 세척합니다. PBST를 제거하고 100% 메탄올을 추가합니다.
- 튜브를 닫고 부드럽게 뒤집어 잔류 PBST와 메탄올을 혼합합니다. 메탄올로 2배 세척하고 -20°C에서 최소 2시간에서 최대 수년 동안 보관합니다.
- pSmad1/5/9(BMP) 면역형광 프로토콜에 대해서는 Rogers et al.38을 참조하십시오. pSmad2/3 (Nodal) 면역형광 프로토콜에 대해서는 van Boxtel et al.17 및 Rogers et al.47을 참조하십시오.
- 광학 절편이 가능한 현미경(예: 컨포칼 또는 광시트 현미경)을 사용하여 면역염색된 배아 이미지. 포화를 피하고 동일한 항체로 염색된 모든 샘플 간에 동일한 이미징 조건을 유지합니다.
- 시간이 지남에 따라 형광이 희미해질 수 있으므로 면역형광 염색을 완료한 후 5일 이내에 이미지를 촬영합니다.
Representative Results
여기에 설명된 두 가지 대조 실험의 목표는 bOpto-BMP/Nodal이 예상대로 빛이 없을 때 신호에 영향을 주지 않고 청색광 노출에 대한 반응으로 각각의 경로를 활성화하는지 여부를 결정하는 것입니다. 관심 있는 연구 질문에 bOpto-BMP/Nodal을 적용하기 전에 이러한 컨트롤을 사용하여 실험실에서 적절한 실험 워크플로우를 설정할 수 있습니다.
표현형 분석은 단 2일 만에 완료할 수 있으며 신호 활성 및 광독성에 대한 유용한 지표를 제공합니다(그림 3A). 주입된 청색광에 노출된 배아는 과도한 BMP 신호전달을 표현해야 한다(ventralization46; 그림 4A, 왼쪽 패널) 또는 결절 신호전달(여분의 중배엽 1,3,47,57,58,59,60(그림 4A, 오른쪽 패널)과 관련된 발달 결함). 주입된 경우 빛에 노출된 배아는 세포성(aphenotypic)이므로 mRNA의 품질을 테스트하고 더 많은 주입을 고려하고 밝은 빛에 지속적으로 노출되도록 광 노출 전략을 다시 확인하십시오(조도가 45W/m2인 ~450nm 빛은 신호 전달을 강력하게 활성화해야 함). 대조적으로, 주입된 노출되지 않은 배아는 주입되지 않은 형제자매와 동일하게 보여야 합니다. 주입된 경우 노출되지 않은 배아는 표현형을 나타내고, 주입된 mRNA의 양을 줄이고, 노출되지 않은 배아가 빛 노출로부터 보호되도록 실험 설정을 재평가합니다. 그림 4B에 표시된 데이터는 적절한 mRNA 양과 노출 조건을 사용한 일반적인 표현형 실험의 결과를 보여줍니다: 주입된 광노출 배아에서 강한 신호 활성이 분명하며, 주입된 노출되지 않은 배아의 극히 일부만이 표현형을 나타냅니다.
표현형 분석은 또한 광독성을 평가할 수 있는 기회를 제공합니다. 광독성이 무시할 수 있는 수준인 경우, 주입되지 않고 빛에 노출된 배아는 주입되지 않고 노출되지 않은 배아와 유사한 야생형으로 나타나야 합니다. 주입되지 않고 빛에 노출된 배아에는 결함이 있지만 주입되지 않은 노출되지 않은 배아에는 결함이 없는 경우 빛 방사 조도를 줄이는 것을 고려하십시오. 45W/m2 의 방사 조도는 명백한 광독성 없이 신호 전달을 강력하게 활성화합니다. 그림 4B 에 나타낸 데이터는 주입되지 않은 광노출된 배아와 주입되지 않은 노출되지 않은 배아 사이에 우려되는 차이를 보여주지 않았으며, 이는 무시할 수 있는 광독성을 나타낸다.
면역형광 분석은 표현형 분석(2일)에 비해 더 많은 시간과 노력(~1주일)이 필요하지만, 면역형광 염색은 신호 전달 경로 활성을 직접 판독할 수 있으며 총 형태학에 반영되지 않을 수 있는 미묘한 신호 변화를 나타낼 수 있습니다. 면역형광은 bOpto-Nodal에 대한 반응을 평가하는 데 특히 중요한데, 과도한 결절 신호전달은 종종 배아가 1 dpf에 의해 용해되는 결과를 초래하기 때문이며, 이는 과잉 BMP 신호전달의 특징인 특정 복화(ventralization) 표현형과 대조적으로 많은 원인이 있을 수 있기 때문입니다(그림 4A). 주입된 청색광 노출 배아는 주입되지 않은 빛에 노출된 배아에 비해 Smad1/5/9 또는 Smad2/3 인산화가 균일하게 증가해야 합니다. 수치가 증가하지 않거나 약간만 증가하면 mRNA의 품질을 테스트하고 더 많은 주입을 고려하고 광 노출 전략을 다시 확인하십시오. 45W/m2 약 40%의 에피볼리(epiboly)의 조도에서 청색광에 20분 동안 노출되면 신호가 강하게 활성화되어야 합니다. pSmad 염색이 균일하지 않은 경우 mRNA를 난황이 아닌 세포 중앙에 주입하면 mRNA 분포가 더 균일해질 수 있습니다.
주입된 노출되지 않은 배아는 주입되지 않은 배아와 비슷한 pSmad 수준을 가져야 합니다. 일화적으로, 우리는 bOpto-BMP보다 bOpto-Nodal에서 더 누출되는 Smad 인산화를 관찰했습니다. 주입된 노출되지 않은 배아에서 pSmad 수준이 증가하면 주입되는 mRNA의 양을 줄이십시오. 또한 1) 노출되지 않은 배아가 실수로 빛에 노출되지 않고 2) 고정 중 빛 노출이 최소화되도록 실험 설정을 재평가합니다. 고정 단계에서는 라이트 박스에서 제거하고 포름알데히드에 담그기까지 45초 이하가 경과하도록 하는 것이 중요합니다. 또한 이 단계에서는 창문 블라인드를 닫거나, 백색 광원을 끄거나, 적색광을 사용하거나, 청색광 차단 젤 여과지로 백색 광원을 덮어 실내 빛과 햇빛에 대한 노출을 최소화합니다(재료 표).
그림 4C의 데이터는 적절한 mRNA 양과 빛 노출 조건을 사용한 일반적인 면역형광 염색 실험의 결과를 보여줍니다: pSmad 수준은 주입되지 않은 배아와 노출되지 않은 배아에서 유사한 반면, 주입된 빛에 노출된 배아는 더 높은 수준의 Smad 인산화를 나타냅니다.
그림 1: bOpto-BMP 및 -Nodal 신호 활성화 전략 . (A) 내인성 BMP 신호 전달 경로는 BMP 리간드 결합에 의해 활성화되어 유형 I/II 수용체 복합체의 형성, Smad1/5/9의 인산화 및 BMP 표적 유전자의 발현으로 이어집니다. 유형 I 수용체 BMPR1aa 및 Acvr1l은 각각 Alk3 및 Alk8로도 알려져 있습니다. BMPR2a는 II형 수용체입니다. (B) bOpto-BMP 구성물38. BMPR1aa 및 Acvr1l의 추정 키나아제 도메인은 LOV에 융합됩니다. BMPR2a-LOV 융합은 추정 키나아제 도메인과 수용체 C-말단 도메인(CTD)을 포함합니다. 모든 융합체는 미리스토일화 모티프(Myr)로 막을 표적으로 합니다. 도메인은 글리신-세린(GS) 링커로 구분됩니다. 구성은 CTD에서 HA 에피토프 태그로 태그가 지정됩니다. 이러한 세 가지 구성물의 조합은 BMP 시그널링을 최적으로 활성화하는 것으로 밝혀졌다. (C) bOpto-BMP-매개 BMP 신호 활성화. 청색광에 노출되면 LOV 도메인이 이합체화되어 복잡한 형성 및 신호 활성화를 유발하는 것으로 생각됩니다. (D) 내인성 결절 신호 전달 경로는 결절 리간드 결합에 의해 활성화되어 유형 I/II 수용체 복합체의 형성, Smad2/3의 인산화 및 결절 표적 유전자의 발현으로 이어집니다. 유형 I 수용체 Acvr1ba 및 유형 II 수용체 Acvr2ba는 각각 Acvr1b 및 Acvr2b로도 알려져 있습니다. (E) bOpto-Nodal 구성39. Acvr1ba 및 Acvr2ba의 추정 키나아제 도메인은 LOV에 융합됩니다. 모든 융합체는 미리스토일화 모티프(Myr)로 막을 표적으로 합니다. 도메인은 GS 링커로 구분됩니다. 구성은 CTD에서 HA 에피토프 태그로 태그가 지정됩니다. (F) bOpto-Nodal-mediated Nodal 신호전달 활성화. 청색광에 노출되면 LOV 도메인이 이합체화되어 복잡한 형성 및 신호 활성화를 유발하는 것으로 생각됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 광유전학 실험을 위한 온도 제어 라이트 박스 . (A) LED 마이크로플레이트 조명기는 맞춤형 LED 홀더를 사용하여 인큐베이터 상단에 장착됩니다. 첫 번째 선반의 6웰 플레이트에 있는 제브라피시 배아는 인큐베이터 상단에 뚫린 구멍을 통해 빛에 노출됩니다. 하단 선반에는 알루미늄 호일로 감싼 6웰 플레이트에 노출되지 않은 대조군 배아의 두 번째 세트가 들어 있습니다. 인큐베이터 도어에는 실내 조명이나 햇빛에 부주의하게 노출되는 것을 방지하기 위해 웨더 스트리핑이 늘어서 있습니다. (B) 스텝 드릴을 사용하여 인큐베이터에 구멍을 만드는 절차의 세부 사항. 여기에 사용된 인큐베이터 모델에는 두 번째로 더 큰 구멍을 뚫어야 하는 내부 패널이 있습니다(재료 표). (C) 3파장 조명 시스템용으로 설계된 맞춤형 LED 홀더의 세부 사항. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: bOpto-BMP/Nodal 실험 워크플로우. bOpto-BMP/Nodal의 활성을 테스트하기 위한 표현형 분석 및 pSmad 면역형광 염색. 배아는 단세포 단계에서 mRNA를 주입하고 수정 후 1.5시간(hpf)에 라이트 박스로 옮깁니다. (A) 표현형 분석. 주입된 배아와 주입되지 않은 형제자매는 어둠 속에서 사육되거나 수정 후 1일(dpf)까지 1.5hpf에서 시작하여 균일한 청색광에 노출됩니다. 광유전학적 신호 전달 활성은 과도한 경로 활성과 일치하는 표현형에 대해 배아를 채점하여 평가할 수 있습니다. (B) pSmad 면역형광 염색. 주입된 배아와 주입되지 않은 형제자매는 40% 에피볼리(~6hpf)가 될 때까지 어둠 속에서 사육됩니다. 주입된 배아의 절반과 주입되지 않은 배아의 절반은 20분 동안 균일한 청색광에 노출됩니다. 노출 후 모든 배아는 고정되고 pSmad에 대한 면역 형광 염색을 받습니다. pSmad1/5/9 또는 pSmad2/3의 높은 수치는 각각 BMP 또는 결절 신호의 광유전학적 활성화를 반영합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 제브라피시 배아의 빛 활성화 신호 반응 평가. 제브라피시 배아를 bOpto-BMP/Nodal을 인코딩하는 mRNA를 단세포 단계에서 주입했습니다. (A) 배아는 어둠 속에서 사육되거나 수정 후 1.5시간(hpf)부터 균일한 청색광에 노출되었습니다. 표현형은 수정 후 1일(dpf)에 점수가 매겨졌습니다. 대표적인 표현형이 표시됩니다. 과도한 BMP 신호전달은 복부화(왼쪽 패널)로 이어지고, 과도한 결절 신호전달은 여분의 중배엽과 관련된 발달적 결함을 유발합니다(오른쪽 패널). 스케일 바 = 500 μm. (B) 표현형 정량화. 주입된 배아와 주입되지 않은 형제자매는 1.5hpf(검은색 전구)에서 시작하여 어둠 속에서 사육되었습니다. 주입된 배아의 절반과 주입되지 않은 배아의 절반은 균일한 청색광(청색 전구)에 노출되었습니다. (C) 주입된 배아와 주입되지 않은 형제자매는 1.5hpf(검은색 전구)에서 시작하여 어둠 속에서 사육되었습니다. 40% 에피볼리(~6hpf)에서 주입된 배아의 절반과 주입되지 않은 배아의 절반이 균일한 청색광(청색 전구)에 노출되었습니다. 20분 후, 모든 배아를 고정하고 인산화된 Smad1/5/9 또는 Smad2/3에 대한 면역형광 염색을 실시했습니다. pSmad 강도가 높을수록 BMP/노드 신호가 각각 증가했음을 나타냅니다. 스케일 바 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 라이트 박스 전체 조립. 전체 라이트 박스 어셈블리의 3D 뷰를 보여주는 3D PDF 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: 라이트 박스 분해도. 분해된 라이트 박스 어셈블리의 3D 뷰를 보여주는 3D PDF 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 3: 대형 경량 개스킷. CAD 도면 파일(. DWG 형식)을 사용하여 레이저 절단기를 사용하여 LED 홀더용 대형 조명 개스킷을 제작할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 4: 소형 경량 개스킷. CAD 도면 파일(. DWG 형식)을 사용하여 레이저 절단기를 사용하여 LED 홀더용 소형 조명 개스킷을 제작할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 5: 아크릴 플랫폼 베이스. CAD 도면 파일(. DWG 형식)을 사용하여 레이저 절단기를 사용하여 LED 홀더 아크릴 플랫폼 베이스를 제작합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 6: 아크릴 플랫폼 수직. CAD 도면 파일(. DWG 형식)을 사용하여 레이저 절단기를 사용하여 LED 홀더 아크릴 플랫폼 수직으로 제작합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 7: 아크릴 지지대 왼쪽. CAD 도면 파일(. DWG 형식)을 사용하여 레이저 절단기를 사용하여 LED 홀더 아크릴 좌측 지지대를 제작합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 8 : 아크릴 지지권. CAD 도면 파일(. DWG 형식)을 사용하여 레이저 절단기를 사용하여 LED 홀더 아크릴 오른쪽 지지대를 제작합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
mRNA 주입은 bOpto-BMP/Nodal을 제브라피시 배아에 전달하기 위한 현재 전략입니다. 이 방법에는 몇 가지 단점이 있습니다. 첫째, mRNA의 적절한 양은 실험실마다 다릅니다. 사용되는 양은 빛에 노출되어 신호를 강력하게 활성화하기에 충분해야 하지만 의도하지 않은 어두운 활성화 없이 작동해야 합니다. 최적의 mRNA 수준을 찾기 위해 여러 양을 테스트하는 것이 좋으며, 일단 확립되면 동일한 양의 mRNA를 재현성 있게 도입하기 위해 마스터 믹스의 부분 표본을 생성합니다. 둘째, 주입된 mRNA의 불균일한 분포는 불균일한 신호 활성화로 이어질 수 있습니다. 난황이 아닌 세포의 중앙에 주입하면 mRNA 분포도 촉진되는 것으로 생각됩니다. 마지막으로, 주입된 mRNA는 시간이 지남에 따라 분해되기 때문에 이 접근법은 오래된 배아의 실험에 적합하지 않을 수 있습니다. 미래에는 이러한 문제를 모계 또는 약물 유도 프로모터와 함께 bOpto-BMP/Nodal을 유비쿼터스로 발현하는 형질전환 제브라피시 계통에 의해 해결될 수 있습니다. 이러한 맥락에서 잠재적으로 빛에 민감한 성인 제브라피시로 작업하는 것은 어려울 수 있지만 광유전학 도구를 포함하는 제브라피시 61,62 및 초파리 22,34,35,63 형질전환이 성공적으로 개발되었습니다.
의도하지 않은 광활성화를 피하는 것은 광유전학 도구의 일반적인 과제입니다. 단순화를 위해 1.5hpf보다 오래된 주입된 배아는 빛에 민감한 배아로 취급하십시오. 부주의한 빛 노출은 종종 알루미늄 호일로 접시나 접시를 감싸는 것만으로도 피할 수 있습니다. 그러나 1.5hpf 이상의 살아있는 배아를 육안으로 관찰해야 하는 실험의 경우 적색 광원을 사용하거나 LOV-이합체 파장을 차단하는 저렴한 겔 여과지로 백색 광원을 덮을 수 있습니다(재료 표).
여기에 설명된 라이트 박스는 광사 조도 수준, 역학 및 파장을 정밀하게 제어해야 하는 특정 응용 분야를 위해 설계되었습니다(그림 2). 이 라이트 박스의 다른 이점으로는 균일한 광 노출, 무시할 수 있는 부주의한 시료 가열, 여러 개의 6웰 플레이트를 위한 충분한 공간, 수명이 길고 스펙트럼이 잘 특성화된 광원 등이 있습니다. 그러나, 연구 용도에 따라 상이한 광 노광 전략이 바람직할 수 있다. 많은 실험실에서 LED 스트립이 있는 라이닝 인큐베이터, 샘플 위에 LED 패널을 매달거나 배양 접시 뚜껑에 LED를 통합하는 것을 포함하여 더 작은 설치 공간을 가진 더 간단하고 비용 효율적인 균일한 광 노광 시스템을 개발했습니다 32,38,39,40,64,65,66. 중요한 것은 이 프로토콜에 사용된 라이트 박스는 사용자가 개별 웰을 독립적으로 조절하거나(Bugaj et al.52와 대조적으로) 빛 노출에 대한 공간 제어를 제공할 수 없다는 것입니다. 공간적으로 국소화된 광유전학적 활성화는 SPIM 또는 공초점 시스템에서 레이저를 사용하여 각각 bOpto-BMP38 및 bOpto-Nodal39로 입증되었으며, 다양한 모델 시스템에서 다른 많은 광유전학 전략으로도 실현되었습니다(Rogers 및 Müller12에서 논의됨). 일부 접근법은 심지어 세포 내 공간 분해능 29,30,31을 달성했습니다. 공간적으로 국소화된 광 노광 시스템의 구현은 이 프로토콜의 범위를 벗어나지만, bOpto-BMP/Nodal을 사용한 공간 활성화 실험은 디지털 마이크로미러 장치 또는 마스킹 접근 방식과 같은 특수 장비를 사용하여 이론적으로 가능합니다. 독자는 빛 노출 전략을 사용하기 전에 광유전학 실험을 위한 DIY 라이트 박스에 대한 광범위한 문헌을 탐색하는 것이 좋습니다(예: Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar 및 Khammash 53 및 https://www.optobase.org/materials/ 참조).
분자 광유전학 전략은 종종 돌연변이, 이소성 유전자 발현, 재조합 단백질 및 약물과 같은 역사적 접근 방식에 비해 생물학적 과정에 대한 더 높은 수준의 시공간 제어를 제공합니다. 광유전학적 접근법의 이점에 관심이 있는 독자는 제브라피시 및 기타 유기체에서 사용할 수 있는 다른 출판된 도구를 탐색할 수 있습니다. 여기에는 추가적인 신호전달 경로(32,65,67,68)를 조작하고, 유전자 발현(61,64,66,69,70,71)을 조절하고, 단백질 국소화(31,72)를 변경하고, 세포사멸(apoptosis)62을 활성화하는 도구들이 포함된다 . 이러한 도구들과 다른 많은 도구들은 분자 광유전학 접근법28을 위한 선별된 웹 리소스인 OptoBase에 편리하게 분류되어 있다. 새로운 광유전학 도구를 만들고자 하는 사람들을 위해 이 리소스에는 녹색, 적색 및 근적외선 파장에 반응하는 빛에 반응하는 단백질을 포함하여 광범위한 전략에 사용된 빛에 반응하는 단백질에 대한 유용한 설명도 포함되어 있습니다. 우리는 과학계가 분자 광유전학적 접근법의 완전한 잠재력을 깨닫게 되어 기쁩니다.
Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 프로토콜에 대한 자금은 NICHD 교내 프로그램에서 KWR(ZIA HD009002-01)에 제공했습니다. 제프 파렐(Jeff Farrell)과 그의 연구실의 유용한 피드백, 윌 앤더슨(Will Anderson)의 탁월한 기술 지원, 프로토콜의 스트레스 테스트 및 방사 조도 측정에 대한 리앤 이아누치(Leanne Iannucci), 제브라피시를 건강하게 유지하기 위해 노력한 NIH 공유 제브라피시 시설에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Building a light box & Light exposure protocol | |||
| #8 x 1" Hex Self-drilling Screw | McMaster-Carr | 99663A222 | 1.4.5 |
| Digital Optical Power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | 1.7 4 |
| Incubator (142 liters) | Boekel Scientific | 139400 | 1.3.1 |
| Incubator Panel Mount (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Incubator_panel | 1.4.4 |
| Large HSS Spiral Groove Step Drill Bit | CO-Z | SDB0001TA | 1.3.2 |
| LED lens gasket, Incubator gasket; 1/32" thick black silicone | McMaster-Carr | 5812T12 | 1.4.3 1.4.4 |
| LED microplate illuminator | Prizmatix | NA | 1.1 1.4.3 |
| M3 10mm Cube Standoff | Newark Eletronics | 005.60.533 | 1.4.1 |
| M3 x 10mm 316SS Flat Head Screw | McMaster-Carr | 91801A156 | 1.4.1 |
| M6 x 10mm 316SS Flat Head Screw | McMaster-Carr | 91801A305 | 1.4.3 |
| Memory card thermometer | Fisherbrand | 15-081-111 | 1.9 3.2.1 |
| Microscope Slide Power Meter Sensor Head (150 mW) | ThorLabs | S170C | 1.7 4 |
| Red gel filter paper #E106 | Rosco / B&H Foto & Electronics | 110084014805-E106 | 4.2.1 |
| Side Brackets (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Side_bracket | 1.4.2 |
| Vertical Bracket (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Vertical_bracket | 1.4.1 |
| Weather stripping: Light duty EPDM foam, 1/2" wd 1/4" tk | McMaster-Carr | 8694K12 | 1.8 |
| Generating mRNA | |||
| EZNA MicroElute Cycle Pure Kit | Omega | D6293-02 | 2.4 |
| GeneJET Miniprep Kit (250 rxns) | Thermo Scientific | K0503 | 2.2 |
| Microsample incubator (Hybex) | SciGene | 1057-30-0 | 2 |
| Microsample incubator 1.5 ml tube block (Hybex) | SciGene | 1057-34-0 | 2 |
| Nanodrop One Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W | 2.4 |
| NotI-HF restriction enzyme | New England Biolabs (NEB) | R3189L | 2.1 |
| pCS2-Opto-Alk3 | Addgene | 207614 | 2 |
| pCS2-Opto-Alk8 | Addgene | 207615 | 2 |
| pCS2-Opto-BMPR2a | Addgene | 207616 | 2 |
| RNeasy Mini Kit (250 rxns) | Qiagen | 74106 | 2.3 |
| Injecting mRNA | |||
| Agarose (UltraPure) | Invitrogen / Thermo Fisher | 16500500 | 3.1.1 |
| 250 ml glass beakers | Fisherbrand | FB100250 | 3.3.2 |
| 6-well dishes (case of 50) | Falcon | 08 772 1B | 3.1.6 |
| B-8A ball joint | Narishige | B-8A | 3.3 |
| Back pressure unit (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | BPU | 3.3 |
| Foot switch (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | FWS | 3.3 |
| GJ-1 magnetic stand | Narishige | GJ-1 | 3.3 |
| Glass capillaries (4 in, OD 1 mm, filament) | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 3.1.11 |
| Glass petri dish bottoms (for dechorionating) | Pyrex | 08-748A | 3.3.2 |
| Glass pipettes (5 3/4" with wide tip) | Kimble-Chase | 63A53WT | 3.1.9 |
| Injection dish molds | Adaptive Science Tools | tu1 | 3.1.3 |
| IP iron plate | Narishige | IP | 3.3 |
| M-152 micromanipulator | Narishige | M-152 | 3.3 |
| Micro pipette holder kit (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MIMPH-MPIP-Kit | 3.3 |
| Micrometers | Meiji Techno America | MA285 | 3.3 |
| MPPI-2 pressure injector (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MPPI-3 | 3.3 |
| Needle puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | 3.1.11 |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm, case of 500) | Falcon | 08-757-100D | 3.1.2 |
| Pipettor (10 ml, green) | Bel-Art | F37898-0000 | 3.3 |
| Pronase | Roche | 11459643001 | 3.3.2 |
| Squeeze bottles (500 ml) | Nalgene / Thermo Scientific | 2402-0500 | 3.3 |
References
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