Summary
Questo protocollo delinea l'isolamento di astrociti e microglia purificati dal midollo spinale del topo adulto, facilitando le successive applicazioni come l'analisi dell'RNA e la coltura cellulare. Include metodi e procedure dettagliati di dissociazione cellulare progettati per migliorare sia la qualità che la resa delle cellule isolate.
Abstract
Gli astrociti e le microglia svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo del sistema nervoso centrale, nelle risposte alle lesioni e nelle malattie neurodegenerative. Queste cellule altamente dinamiche mostrano risposte rapide ai cambiamenti ambientali e mostrano una significativa eterogeneità in termini di morfologia, profili trascrizionali e funzioni. Mentre la nostra comprensione delle funzioni delle cellule gliali nella salute e nella malattia è progredita notevolmente, rimane la necessità di analisi in vitro, specifiche per cellule, condotte nel contesto di insulti o lesioni per caratterizzare in modo completo popolazioni cellulari distinte. L'isolamento delle cellule dal topo adulto offre diversi vantaggi rispetto alle linee cellulari o agli animali neonatali, in quanto consente l'analisi delle cellule in condizioni patologiche e in punti temporali specifici. Inoltre, concentrandosi sull'isolamento specifico del midollo spinale, escludendo il coinvolgimento cerebrale, consente la ricerca sulle patologie del midollo spinale, tra cui l'encefalomielite autoimmune sperimentale, la lesione del midollo spinale e la sclerosi laterale amiotrofica. Questo protocollo presenta un metodo efficiente per isolare astrociti e microglia dal midollo spinale del topo adulto, facilitando l'analisi immediata o futura con potenziali applicazioni in studi funzionali, molecolari o proteomici a valle.
Introduction
Gli astrociti e le microglia sono cellule gliali versatili che svolgono ruoli vitali nel sistema nervoso centrale (SNC), comprendendo responsabilità come la regolazione della funzione neuronale, contribuendo allo sviluppo del SNC, mantenendo la barriera emato-encefalica e partecipando ad altri processi critici 1,2,3,4 . Oltre al loro ruolo nel mantenimento dell'omeostasi, queste cellule gliali svolgono anche un ruolo fondamentale nei meccanismi di lesione e riparazione. Le microglia sono ben note per le loro capacità fagocitarie, infiammatorie e migratorie in seguito a insulti o lesioni 5,6,7. Le risposte degli astrociti nella malattia sono ugualmente diverse, comprendendo i contributi all'infiammazione, alla formazione di cicatrici gliali e alla compromissione della barriera emato-encefalica 8,9. Sebbene la nostra comprensione dei ruoli dannosi e riparativi della microglia e degli astrociti nel sistema nervoso centrale sia cresciuta, l'eterogeneità intrinseca sia nella loro struttura che nella loro funzione richiede strumenti robusti per studiarli in vari contesti.
Ottenere ulteriori informazioni sul ruolo della microglia e degli astrociti nella salute e nella malattia richiede un approccio combinato di indagini in vivo e in vitro . Le tecniche in vivo sfruttano l'intricato crosstalk tra cellule gliali e neuroni all'interno del sistema nervoso centrale, mentre le metodologie in vitro si rivelano preziose quando si valutano le funzioni o le risposte di singole cellule sotto stimoli specifici. Ogni metodo offre vantaggi unici; Gli studi in vitro sono essenziali per comprendere i ruoli specifici di questi tipi di cellule senza input diretto o indiretto da parte delle cellule vicine. Inoltre, i saggi in vitro che utilizzano linee cellulari immortali presentano alcuni vantaggi, tra cui la capacità di proliferare indefinitamente, l'efficienza dei costi e la facilità di manutenzione. Tuttavia, è importante notare che le cellule primarie imitano più da vicino le normali risposte fisiologiche rispetto alle linee cellulari. Questa rilevanza fisiologica è cruciale nei saggi funzionali e nelle analisi trascrittomiche.
Una delle sfide nell'ottenere cellule primarie, in particolare dal midollo spinale del topo adulto, risiede nella quantità e nella vitalità dei campioni. Il midollo spinale adulto, essendo più piccolo del cervello e contenente una quantità significativa di mielina, pone difficoltà uniche. Sebbene esistano diversi protocolli pubblicati che descrivono in dettaglio l'isolamento di cellule gliali pure e vitali da animali neonatali o dal cervello di topo adulto 10,11,12,13, queste metodologie potrebbero non essere adatte per lo studio di malattie e lesioni specifiche del midollo spinale. In questo protocollo, offriamo una procedura completa per isolare in modo efficiente microglia e astrociti puri e vitali dal midollo spinale del topo adulto, facilitando le applicazioni a valle nelle colture cellulari e nelle analisi trascrittomiche. Questo protocollo è stato impiegato con successo per isolare queste cellule da topi adulti di età compresa tra 10 settimane e 5 mesi, dimostrando la sua utilità in vari contesti, tra cui studi che coinvolgono topi knockout condizionali, risposte ai farmaci, ricerca sullo sviluppo e modelli legati all'età.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali e di cura degli animali sono state condotte a seguito dell'approvazione del Comitato per la cura e l'uso degli animali presso la George Washington University School of Medicine and Health Sciences (Washington, D.C., USA; IACUC#2021-004). Lo studio ha utilizzato topi maschi e femmine C57BL/6J wild-type (WT) di età compresa tra 10 settimane e 5 mesi, provenienti da un fornitore commerciale (vedi Tabella dei materiali) e ospitati presso la George Washington University. Nella Figura 1 viene presentata una panoramica del flusso di lavoro del protocollo.
1. Preparazione del midollo spinale
- Anestetizzare gli animali utilizzando Avertin (12,5 mg/mL di 2,2,2-tribromoetanolo e 2,5% di 2-metil-2-butanolo in acqua sterile) (vedi Tabella dei materiali). Confermare l'assenza di una risposta ai pizzicotti delle dita dei piedi e della coda nei topi.
- Eseguire la perfusione cardiaca con 1x soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) per rimuovere le cellule mononucleate del sangue periferico.
- Posizionare l'animale su un vassoio poco profondo e praticare un'incisione laterale per esporre la cavità pleurica. Inserire un ago di perfusione da 23 G collegato a una pompa peristaltica (vedere Tabella dei materiali) nel ventricolo sinistro e attivare la pompa. Una volta che il DPBS freddo scorre attraverso il cuore, crea una piccola incisione nell'atrio destro.
NOTA: In questa fase è preferibile una velocità di perfusione più rapida per migliorare la vitalità cellulare. Il sangue deve essere eliminato in meno di 1 minuto. La pulizia del fegato indica una perfusione riuscita.
- Posizionare l'animale su un vassoio poco profondo e praticare un'incisione laterale per esporre la cavità pleurica. Inserire un ago di perfusione da 23 G collegato a una pompa peristaltica (vedere Tabella dei materiali) nel ventricolo sinistro e attivare la pompa. Una volta che il DPBS freddo scorre attraverso il cuore, crea una piccola incisione nell'atrio destro.
- Decapitare l'animale con delle grosse forbici e rimuovere la colonna vertebrale14. Immergerlo in 1x DPBS freddo con Ca2+/Mg2+/0,2% di glucosio in una capsula di Petri su ghiaccio per il risciacquo dei tessuti.
- A partire da ora, assicurarsi che tutte le fasi siano eseguite in un ambiente sterile. Utilizzare l'estrusione idraulica14 per isolare l'intero midollo spinale. Utilizzare un ago da 18 G e una siringa da 10 mL riempita con 1x DPBS freddo con Ca2+/Mg2+/0,2% di glucosio. Trasferire il midollo spinale in una capsula di Petri posta su impacchi di ghiaccio contenenti una quantità sufficiente di DPBS freddo 1x con Ca2+/Mg2+/0,2% di glucosio per immergere l'intero tessuto.
- Rimuovere con cautela le meningi al microscopio all'interno di una cappa a flusso laminare. Trasferire il midollo spinale in una capsula di Petri vuota su impacchi di ghiaccio e, utilizzando un bisturi chirurgico a lama n. 10, tagliare l'intero midollo spinale in sezioni di 2-3 mm.
2. Dissociazione enzimatica cellulare
- Aggiungere la miscela enzimatica 1 e la miscela enzimatica 2 dal kit per la dissociazione cerebrale per adulti disponibile in commercio seguendo il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali). Agitare più volte gli enzimi nella capsula per garantire un rivestimento uniforme del midollo spinale, quindi incubare a 37 °C per 30 minuti. Ogni 5 minuti, agitare delicatamente il piatto per evitare la formazione di grumi di tessuto e facilitare la distribuzione uniforme dei reagenti.
- Rimuovere la capsula dall'incubatore e aggiungere 350 μL di DNAsi I 0,46 mg/mL in terreno essenziale minimo (MEM) (vedere Tabella dei materiali). Mescolare agitando delicatamente.
- Aggiungere 1 ml di DMEM/0,5% di siero fetale bovino (FBS) freddo e mescolare agitando delicatamente. Trasferire immediatamente l'intero contenuto in una provetta da 5 ml.
3. Dissociazione meccanica delle cellule
- Utilizzando una pipetta P1000, triturare delicatamente il tessuto tre volte, assicurandosi che ogni volta vengano prelevati i pezzi di tessuto per dissociare ulteriormente il tessuto. Quindi, utilizzando una pipetta Pasteur in vetro da 9" tappata, triturare delicatamente altre cinque volte, assicurandosi che non si generino bolle durante il processo.
- Posizionare la provetta da 5 ml in posizione verticale e lasciare che il tessuto si depositi sul fondo per 30 secondi. Una volta che il tessuto si è stabilizzato, prelevare il surnatante utilizzando una pipetta P1000 e farlo passare attraverso un filtro da 30 μm in una provetta conica da 15 mL.
- Alla stessa provetta da 5 mL con il tessuto rimanente, aggiungere 1 mL di DMEM/0,5% FBS freddo. Utilizzando una pipetta Pasteur, triturare delicatamente tre volte.
- Lasciare che il tessuto si depositi sul fondo per 30 secondi, quindi passare il surnatante attraverso un filtro da 30 μm e raccoglierlo nella stessa provetta da 15 mL di prima. Ripetere ancora una volta i passaggi 3.3 e 3.4.
- Centrifugare la sospensione cellulare filtrata a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente (RT). Rimuovere con cautela e scartare il surnatante risultante utilizzando un aspiratore sottovuoto.
4. Rimozione della mielina
- Rimuovere la mielina utilizzando la soluzione per la rimozione dei detriti (DRS) fornita nel kit di dissociazione cerebrale per adulti seguendo il protocollo del produttore. Dopo la rimozione dei detriti, aggiungere 5 mL di DMEM/0,5% FBS freddo al pellet cellulare e capovolgere delicatamente la provetta tre volte. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente (RT).
NOTA: Se le cellule saranno utilizzate per studi in vitro e rimarranno in coltura, è necessario utilizzare DMEM/FBS allo 0,5% preriscaldato. - Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di DPBS/0,5% FBS (a freddo per gli studi sull'RNA e a caldo per i saggi in vitro ). Conta le cellule e valuta la vitalità usando Trypan Blue.
NOTA: Le sospensioni cellulari di più animali possono essere combinate per aumentare la concentrazione cellulare. - Lavare le cellule aggiungendo DPBS/0,5% FBS fino a un volume totale di 5 mL. Centrifugare la sospensione a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante utilizzando una pipetta.
5. Isolamento della microglia e degli astrociti
- Etichettare le cellule con microsfere anti-CD11b o anti-ACSA-2 seguendo il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali).
- Ordinare le celle in base alla selezione positiva utilizzando le colonne MS secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali). Dopo la cernita, centrifugare le cellule selezionate a 300 x g per 10 minuti e scartare il surnatante.
6. Cellule di placcatura per saggi in vitro
NOTA: Se le cellule non verranno placcate e verranno utilizzate immediatamente per l'analisi dell'RNA, procedere al passaggio 8.
- Risospendere le cellule in 1 mL di DMEM/0,5% FBS caldo. Contare le cellule e valutarne la vitalità utilizzando un ematotometro (vedi Tabella dei materiali).
- Regolare la concentrazione cellulare a 75.000 cellule per 50 μL. Aggiungere 50 μL di sospensione cellulare a ciascun vetrino coprioggetto rivestito di poli-L-lisina11 in una piastra a 24 pozzetti.
- Incubare a 37 °C per 2 ore per consentire alle cellule di aderire al vetrino coprioggetti.
- Aggiungere con cautela 450 μL di DMEM/5% FBS/Penicillina-Streptomicina (Pen-Strep, vedere la Tabella dei Materiali) in ciascun pozzetto.
- Dopo 3 giorni, sostituire metà del terreno con 250 μL di DMEM/5% FBS/Pen-Strep caldo. Per la manutenzione, sostituire completamente il terreno con 500 μL di DMEM/5% FBS/Pen-Strep caldo ogni 4-5 giorni.
7. Immunoistochimica
NOTA: È meglio eseguire le analisi immunoistochimiche dopo almeno 3 giorni quando il terreno è stato sostituito almeno una volta. Ciò garantisce che i detriti siano stati rimossi e che le celle abbiano aderito completamente al vetrino coprioggetto.
- Rimuovere il terreno ed etichettare le cellule con anticorpi monoclonali O4 (1:100) (vedere la tabella dei materiali) in DMEM/5% FBS/10% siero di capra normale (NGS) caldo per 15 minuti a temperatura ambiente (RT) o a 37 °C.
NOTA: Saltare questo passaggio e procedere al passaggio 7.3 se le celle non saranno etichettate con O4. - Sciacquare delicatamente i vetrini coprioggetti immergendoli tre volte in DMEM/5% FBS caldo. Aggiungere 594 IgM anti-topo di capra (1: 300) (vedere la tabella dei materiali) in DMEM/5% FBS/10% NGS caldo e incubare a RT per 15 minuti al buio. Risciacquare delicatamente tre volte in DMEM/5% FBS tiepido.
- Fissare le celle con acido acetico/metanolo freddo al 5% per 15 minuti a 4 °C. Lavare tre volte con 1x PBS, quindi etichettare con l'anticorpo appropriato: GFAP anti-coniglio (1:500), GFAP anti-topo (1:500) o Iba1 anti-coniglio (1:500) in Triton-X100/10% NGS in 1x DPBS (vedi Tabella dei materiali). Incubare per 1 ora a RT.
NOTA: Tenere i vetrini coprioggetti al buio se sono già stati macchiati con O4. - Risciacquare delicatamente tre volte con PBS. Etichetta con l'anticorpo secondario appropriato: anti-topo 594 IgG (1:500), anti-coniglio 488 IgG (1:500) (vedi Tabella dei materiali). Incubare per 30 minuti a RT al buio.
- Risciacquare delicatamente tre volte con PBS. Colorante di contrasto con DAPI (1: 1000) per 1 minuto a RT. Risciacquare tre volte con PBS, aggiungere il mezzo di montaggio (vedere la tabella dei materiali) e montare i vetrini coprioggetti sui vetrini.
8. Estrazione dell'RNA
NOTA: Idealmente, dovrebbero esserci almeno 100.000 cellule per estrarre RNA sufficiente per l'analisi. Se necessario, le cellule di 2-3 midollo spinale possono essere combinate.
- Estrarre l'RNA utilizzando un kit di isolamento dell'RNA disponibile in commercio seguendo il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali). Per ogni fase di lavaggio con il tampone di lavaggio RW1 fornito nel kit, lasciare le celle nel tampone di lavaggio per altri 2 minuti.
- Rimuovere il DNA genomico rimanente utilizzando DNasi I secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali). Incubare con DNasi a RT per 15 minuti, quindi lavare con tampone RW1.
- Per aumentare la resa di RNA, prima dell'eluizione, incubare i campioni in acqua priva di RNAsi a RT per 10 minuti. Valutare l'integrità e la quantità dell'RNA utilizzando un bioanalizzatore15 (vedi Tabella dei materiali).
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Representative Results
I metodi delineati in questo protocollo consentono l'isolamento di microglia e astrociti puri e vitali dal midollo spinale del topo adulto, facilitando varie applicazioni a valle, tra cui saggi funzionali o istologici in vitro e analisi dell'RNA.
Un isolamento di successo per gli studi in vitro si tradurrà in una proliferazione cellulare continua per diversi giorni. Le cellule adulte mostrano un tasso di proliferazione più lento rispetto alle cellule isolate da animali neonatali e alcuni detriti possono essere presenti nei primi giorni. Entro 4 giorni in vitro (DIV), le cellule dovrebbero essere in gran parte libere da detriti, con la maggior parte delle cellule che aderiscono al fondo del pallone. Gli astrociti inizieranno a formare processi più lunghi, mentre la microglia assumerà una forma ovale con fusi più corti (Figura 2). Entro 7 DIV, gli astrociti dovrebbero formare uno strato confluente connesso e la microglia dovrebbe mostrare meno processi e più brevi (Figura 3).
La purezza può essere confermata mediante doppia marcatura di cellule selezionate per ACSA2 con GFAP e O4 per valutare la contaminazione da oligodendrociti in colture di astrociti e cellule con ordinamento CD11b con Iba1 e GFAP per valutare la contaminazione da astrociti in colture di microglia (Tabella 1).
Un protocollo di successo produrrà anche RNA di alta qualità con degradazione minima e quantità sufficiente (Figura 4A). Gli elettroferogrammi dell'RNA estratto da cellule isolate dovrebbero mostrare picchi prominenti di 18S e 28S. L'eccessiva dissociazione delle cellule o il tempo prolungato tra la perfusione e la selezione cellulare possono portare alla degradazione dell'RNA (Figura 4B). Un'insufficiente dissociazione enzimatica e/o meccanica o un'inadeguata rimozione della mielina possono comportare una riduzione della resa cellulare e dell'RNA (Figura 4C). Gli astrociti isolati possono essere sequenziati per identificare i marcatori infiammatori. Il confronto tra astrociti sani e astrociti attivati dall'infiammazione (ad esempio, da un animale sperimentale con encefalomielite autoimmune) rivelerà inibizioni relative delle vie infiammatorie negli astrociti sani rispetto a quelli infiammatori (Figura 4D).
Figura 1: Panoramica della preparazione del midollo spinale, della dissociazione tissutale e dello smistamento cellulare. La figura fornisce una panoramica del processo di preparazione del midollo spinale, compresa la dissociazione dei tessuti e lo smistamento cellulare. Dopo la dissezione del midollo spinale, i tessuti subiscono una dissociazione enzimatica e meccanica. La mielina viene rimossa e le cellule vengono marcate con anticorpi anti-ACSA2 o anti-CD11b per colpire astrociti e microglia. Le cellule selezionate possono quindi essere utilizzate per la coltura cellulare e l'analisi dell'RNA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini a contrasto di fase di astrociti e microglia a 4 giorni in vitro (4DIV). (A) Raffigura un esempio rappresentativo di cellule ordinate ACSA2+ con processi estesi. (B) Le cellule CD11b+ mostrano corpi cellulari di forma ovale e processi brevi. Barra graduata = 50 μm. Questa figura è adattata da Ahn, J. J. et al.16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagini fluorescenti di astrociti e microglia a 8 giorni in vitro (8DIV). (A) Le cellule ACSA2+ marcate con GFAP (verde) e O4 (rosso) mostrano una colorazione minima di O4 e formano uno strato confluente connesso di astrociti. (B) Le cellule CD11b+ marcate con Iba1 (verde) e GFAP (rosso) mostrano una presenza minima di GFAP. Barra graduata = 50 μm. Questa figura è adattata da Ahn, J. J. et al.16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Elettroferogrammi rappresentativi di campioni di RNA. (A) Ci si aspetta un RNA ad alta resa e di alta qualità dopo un isolamento cellulare riuscito. (B) In caso di morte cellulare, dissociazione insufficiente o rimozione inadeguata dei detriti ci si può aspettare RNA a bassa resa e di bassa qualità o (C) RNA a bassa resa e di alta qualità. (D) L'analisi del sequenziamento dell'RNA di vie infiammatorie selezionate in astrociti sani rispetto agli astrociti infiammatori rivela l'inibizione relativa dell'infiammazione negli astrociti sani ordinati rispetto agli astrociti infiammatori. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Tipo di cellula | Numero totale di cellule | Celle ordinate | % Ordinato/Totale | % media di redditività |
| ACSA2 | 6,3 x 105 | 1,7 x 105 | 27 | 92 |
| CD11b | 6,3 x 105 | 8,0 x 104 | 12.7 | 93 |
Tabella 1: Resa cellulare, purezza e vitalità dopo l'ordinamento per le cellule ACSA-2 e CD11b. Questa tabella è adattata da Ahn, J. J. et al.16.
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Discussion
L'isolamento di cellule primarie pure e vitali è fondamentale per studiare la struttura e la funzione di specifici tipi di cellule. Nel topo adulto, in particolare nel midollo spinale, questo compito pone sfide significative, poiché i protocolli esistenti spesso non sono adattati al midollo spinale adulto10,17. Questo protocollo presenta un metodo efficiente ed economico applicabile a varie applicazioni a valle, tra cui colture cellulari, citometria a flusso, istologia e studi trascrittomici.
La velocità di preparazione del midollo spinale gioca un ruolo cruciale nel garantire una vitalità e una resa cellulare ottimali. Sebbene sia fondamentale ottenere un'efficace eliminazione dei globuli rossi durante la perfusione cardiaca, il numero di cellule isolate può variare notevolmente in base al tempo trascorso tra la perfusione cardiaca e la dissociazione enzimatica. Abbiamo osservato che l'avvio della dissociazione tissutale più di 10 minuti dopo la perfusione cardiaca ha portato a una diminuzione della vitalità cellulare. Inoltre, la durata della dissociazione enzimatica inferiore a 30 minuti si è rivelata inefficace, lasciando frammenti di tessuto non digeriti e riducendo la resa cellulare.
Sebbene la completa eliminazione della dissociazione meccanica (come la triturazione o il taglio) non abbia influito sulla vitalità cellulare, ha comportato un minor numero di cellule isolate a causa della presenza di frammenti di tessuto non digeriti. Una combinazione di metodi meccanici con dissociazione enzimatica si è dimostrata l'approccio più efficace per l'isolamento cellulare. Tuttavia, vale la pena notare che un certo livello di stress cellulare si verifica inevitabilmente durante la dissociazione dei tessuti, con un potenziale impatto sugli studi trascrittomici18. Questa è una sfida comune con le procedure di dissociazione dei tessuti del SNC19. Tuttavia, è stato dimostrato che i metodi di triturazione delicata riducono al minimo la morte cellulare, l'attivazione del trascritto estraneo e la proteolisi indesiderata16. Inoltre, sebbene le cellule vitali possano essere ottenute eliminando completamente la dissociazione meccanica, ciò potrebbe richiedere l'uso di altri animali. Per motivi di riproducibilità, si raccomanda di integrare la dissociazione enzimatica con un delicato taglio e triturazione per massimizzare la resa cellulare per midollo spinale. Tuttavia, i ricercatori possono scegliere di modificare il protocollo eliminando la triturazione o il taglio se gli obiettivi del loro studio sono altamente sensibili allo stress cellulare e richiedono una dissociazione minima.
In sintesi, l'integrazione di delicate fasi di dissociazione e una rapida preparazione dei tessuti garantisce una resa e una vitalità cellulari ottimali. La flessibilità del protocollo è migliorata dalla possibilità di sostituire i terreni freddi con terreni caldi per mantenere le cellule in coltura. Questa metodologia è stata ottimizzata per l'applicazione in modelli animali che vanno da 10 settimane ad almeno 5 mesi di età, compresi i modelli di malattia.
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Disclosures
Nessuno
Acknowledgments
Ringraziamo Castle Raley del George Washington University Genomics Core per le analisi dell'RNA e Q2 Lab Solutions per le analisi di sequenziamento dell'RNA. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke [sovvenzione numero F31NS117085] e dal Vivian Gill Research Endowment al Dr. Robert H. Miller. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Distilled water | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
References
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