Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En termoplasmonisk tilnærming for å undersøke plasmamembranreparasjon i levende celler og modellmembraner

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/65776
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1The Niels Bohr Institute, University of Copenhagen, 2Department of Plant and Environmental Sciences, University of Copenhagen

Summary

Den termoplasmoniske punkteringsmetoden integrerer konfokalmikroskopi, optisk pinsett og gullnanopartikler for å studere proteinresponser under reparasjon av plasmamembraner i celler og gigantiske unilamellære vesikler. Teknikken muliggjør rask og lokalisert membranpunktering, noe som gjør det mulig å identifisere nøkkelproteiner og deres funksjonelle roller i det intrikate plasmamembranreparasjonsmaskineriet.

Abstract

Cellemembranen er avgjørende for celleoverlevelse, og det er viktig å sikre integriteten ettersom cellen opplever skader gjennom hele livssyklusen. For å forhindre skade på membranen har cellene utviklet effektive plasmamembranreparasjonsmekanismer. Disse reparasjonsmekanismene kan studeres ved å kombinere konfokalmikroskopi og nanoskala termoplasmonikk for å identifisere og undersøke rollen til nøkkelproteiner, som anneksiner, involvert i overflatereparasjon i levende celler og membranmodellsystemer.

Punkteringsmetoden benytter en laser for å indusere svært lokalisert oppvarming ved nanopartikkelbestråling. Bruken av nær-infrarødt lys minimerer fototoksisitet i den biologiske prøven, mens størstedelen av absorpsjonen foregår i den nær-infrarøde resonansplasmoniske nanopartikkelen. Denne termoplasmoniske metoden har blitt utnyttet for potensiell fototermisk og biofysisk forskning for å forbedre forståelsen av intracellulære mekanismer og cellulære responser gjennom vesikkel- og cellefusjonsstudier. Tilnærmingen har vist seg å være komplementær til eksisterende metoder for membranforstyrrelser, for eksempel mekaniske, kjemiske eller optisk induserte skader, og gir et høyt nivå av kontroll ved å forårsake ekstremt lokaliserte skader. Omfanget av skaden er begrenset til nærheten av den sfæriske nanopartikkelen, og det oppstår ingen skadelig skade langs strålebanen i motsetning til pulserende lasere som bruker forskjellige bølgelengder. Til tross for visse begrensninger, for eksempel dannelsen av nanobobler, tilbyr den termoplasmoniske metoden et unikt verktøy for å undersøke cellulære responser i plasmamembranreparasjon i et nesten innfødt miljø uten å kompromittere cellens levedyktighet.

Når den integreres med konfokalmikroskopi, kan punkteringsmetoden gi en mekanistisk forståelse av membrandynamikk i modellmembransystemer, samt kvantitativ informasjon om proteinresponser på membranskader, inkludert proteinrekruttering og deres biofysiske funksjon. Samlet sett kan anvendelsen av denne metoden på reduserte modellsystemer øke vår forståelse av det intrikate plasmamembranreparasjonsmaskineriet i levende celler.

Introduction

Cellemembranen, som fungerer både som en fysisk barriere og en signalplattform, er avgjørende for celleoverlevelse1. Gjennom hele cellesyklusen blir plasmamembranen (PM) utsatt for skader, for eksempel mekaniske 2,3,4,5 og kjemiske6 stressinduserte skader. For å opprettholde membranintegritet og sikre celleoverlevelse har cellen utviklet robuste mekanismer for reparasjon av plasmamembraner (PMR). Disse mekanismene avhenger av ulike strategier, for eksempel cytoskjelettomorganisering, membranfusjon og membranutskiftingsstrategier 7,8,9,10,11, som alle er avhengige av rekruttering av spesifikke proteiner. Spesielt har medlemmer av anneksinproteinfamilien blitt identifisert som nøkkelproteiner assosiert med prosessene til PMR 1,9,12,13,14,15,16. Etter PM-skade opplever cellen en tilstrømning av kalsiumioner (Ca2+), noe som utgjør en umiddelbar trussel mot cellens overlevelse17. Som svar på Ca2+ tilstrømning binder anneksinproteiner, som hovedsakelig er lokalisert i cytosolen, seg til den indre brosjyren til den skadede plasmamembranen som en del av PMR-strategiene18. Vedlegg A2 (ANXA2) var et av de første medlemmene av anneksinfamilien som ble assosiert med PMR ved dysferlinmangelfull muskeldystrofi og ble foreslått å formidle reparasjon ved å smelte intracellulære vesikler til PM nær skadestedet 5,19,20,21. I ettertid har flere funksjoner blitt tilskrevet vedlegg22, og deres rolle i PMR har fått økt oppmerksomhet de siste 20 årene. Den eksakte rollen til anneksiner i PMR er imidlertid ikke fullt ut forstått 15,18,21,22.

Denne artikkelen foreslår en metode for å undersøke proteinmembraninteraksjon og membrandynamikk på en kontrollert og svært lokalisert måte, ved hjelp av en kombinasjon av konfokalmikroskopi, optisk pinsett og gullnanopartikler (AuNPs). Denne metoden muliggjør kvantitativ studie av protein-, lipid- og småmolekylære interaksjoner som respons på membranskader og Ca2+ tilstrømning. Til tross for kompleksiteten og mangfoldet av komponenter som er involvert i prosessen med membranreparasjon, har forenklede membransystemer som etterligner plasmamembranen blitt brukt for å få en dypere mekanistisk forståelse av membrandynamikk og anneksinproteiners respons på membranforstyrrelser16. Giant unilamellar lipidvesikler (GUVer) ble valgt som modellmembransystem med en spesifisert lipidsammensetning. GUVene ble generert ved hjelp av gelassistert hydreringsmetode, spesielt polyvinylalkoholgelhydrering, som beskrevet av Weinberger et al.23, som tillot effektiv innkapsling av vedlegg i GUVer.

Utnyttelsen av nær-infrarød (NIR) laserbestråling på metalliske nanopartikler (NP) induserer betydelig oppvarming av NP, noe som gjør det til en effektiv metode for å etablere en lokal varmekilde utnyttet i biomedisinske applikasjoner24. Metoden ble opprinnelig brukt til å direkte måle temperaturen rundt en enkelt AuNP i både 2D og 3D biomimetiske analyser. I disse analysene 25,26 ble de plasmoniske nanopartiklene bestrålt på et støttet lipid-dobbeltlag eller optisk fanget nær GUVer som gjennomgikk en lokal termisk faseovergang ved lokal oppvarming, noe som muliggjorde kvantifisering og kontroll av den nøyaktige temperaturprofilen rundt partikkelen. Denne referansetemperaturprofilen har blitt brukt ved undersøkelse eller manipulering av biologiske prøver. Ytterligere fremskritt i metoden har gjort det lettere å induksjonere nanoskopiske porer i membraner27, noe som muliggjør vesikkel og cellefusjon 28,29. Andre studier har undersøkt oppførselen til perifere membranproteiner i GUVer29 og transmembranproteiner30 ved å skape nye hybridvesikler, mens cellespesifikk legemiddellevering også har blitt utforsket for å kontrollere og studere cellulære responser eller genuttrykk 28,29,31,32,33. Nylig har metoden blitt brukt til å undersøke proteinresponser på membranskader 32,34,35.

Det finnes flere metoder for å forstyrre plasmamembranen for å utforske cellulære responser og membranreparasjon. Disse inkluderer mikronålpunkteringer, mikroperleristing og celleskraping, som alle kan forstyrre cellemembranen mekanisk 14,36,37. Kjemisk indusert skade kan oppnås ved å tilsette vaskemidler 5,38 eller bakterielle toksiner39,40 som destabiliserer lipid-dobbeltlaget og genererer membranporer over plasmamembranen. Videre har optisk induserte skader ved kontinuerlige bølge- og pulserende lasere blitt brukt til å studere PMR-komponenter, slik som anneksinproteiner 5,14,21,41, i kombinasjon med plasmoniske nanopartikler 42,43,44,45 . Til tross for effektiviteten til pulserende lasere med høy effekt, kan de forårsake betydelige skader og skade på cellens indre langs strålebanen. Videre gjenstår de detaljerte endringene som skjer i det biologiske materialet ved pulserende laserbestråling og om det skaper en veldefinert pore, å bli undersøkt nærmere. En alternativ metode presenteres i denne artikkelen, ved bruk av termoplasmonikk for å indusere nanoskopiske hull i PM på en kontrollert måte34,35 uten å forårsake betydelig skade på de indre strukturer. Dette oppnås ved å utsette plasmoniske NP for en svært fokusert NIR-laser, noe som resulterer i en ekstremt lokalisert temperaturøkning som lett kan nå temperaturer over 200 ° C, noe som kan føre til små nanoskopiske eksplosjoner 25,46,47. Denne prosessen kan styres ved å justere laserintensiteten samt størrelsen, formen og sammensetningen av NPs48. Ved å bruke denne teknikken kan forskere utforske rollen som proteiner i PM-reparasjon i levende celler, noe som kan bidra til å løse noen av de ubesvarte spørsmålene om involvering av anneksinproteiner i membranreparasjon uten å kompromittere cellens levedyktighet.

Den optiske fangsten av plasmoniske nanopartikler har blitt godt etablert av tidligere studier 25,49,50,51,52; Imidlertid kan ytterligere innsikt om de termoplasmoniske egenskapene til nanopartiklene 53,54,55 fås i tilleggsmaterialene (tilleggsfil 1). Den termoplasmoniske metoden kan brukes til å lage nanoskopiske hull i PM med det formål å studere cellulær respons og reparasjonsmekanismer. Nærmere bestemt kan punkteringen oppnås ved optisk oppvarming av AuNP i nærheten av membranen, som vist i figur 1A og B. Denne lokaliserte punkteringen tillater Ca2+ tilstrømning, som ble verifisert av en kalsiumsensor, og dermed aktiverte PMR-maskineriet. For levende celleforsøk ble AuNP med en diameter på 200 nm immobilisert på overflaten under cellen for å overvåke ANXA2s rolle i PMR via konfokal mikroskopi. NIR-laseren (figur 1A,B), med en bølgelengde på 1064 nm, bestråler AuNP, utnytter dens plasmoniske egenskaper (figur 1C), noe som resulterer i betydelig lokal oppvarming (figur 1D) i det biologiske gjennomsiktighetsvinduet49 samtidig som den forårsaker minimal skade på selve cellen. Høytemperaturområdet rundt AuNP reduseres raskt med 30-40% i en avstand som tilsvarer NPs radius, som vist i figur 1E, noe som muliggjør en ekstremt begrenset skade i alle tre dimensjoner.

Tilleggsfil 1. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk oversikt over eksperimentell metode. (A) ANXA-transfekterte celler ligger på toppen av immobiliserte gullnanopartikler (AuNPs) på overflaten, eller (B) gigantiske unilamellære vesikler (GUVer) med innkapslet ANXA er suspendert i et medium som inneholder AuNPs. (C) En enkelt AuNP bestråles av NIRs optiske felle, hvor vekselvirkningen mellom det innkommende elektromagnetiske feltet og ledningselektronene fører til den kollektive svingningen av elektroner i NP. (D) Denne prosessen resulterer i en svært begrenset, men likevel betydelig temperaturøkning. For å estimere temperaturen på NP-overflaten brukes Mie-teorien, og en (E) temperaturprofil beregnes for en AuNP med en diameter på 200 nm og laserintensitet I = 6,36 x 108 W/cm2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For å minimere den termiske effekten på cellemembranen, blir AuNPene bare bestrålt i ~ 1 sekund. Dette fører til en forbigående og lokal utbrudd av oppvarming, noe som reduserer skaden på proteiner som vanligvis krever mer tid til å utfolde seg. Ved membranpunktering rekrutteres anneksinproteiner på brøkdelen av et sekund, og i løpet av få sekunder dannes et anneksinringlignende stillas rundt skadestedet (figur 2). Denne tilnærmingen har også blitt brukt til å utforske involvering av ANXA5 i både levende celler og modellmembraner16 i et forsøk på å kaste lys over hele skjemaet for reparasjonsprosessene. Mens hovedfokuset har vært på korrelerende rekruttering av ulike anneksinproteiner, har de biofysiske aspektene av reparasjonsmekanismen ennå ikke blitt belyst.

For å fullt ut implementere den foreslåtte metoden kreves tre nøkkelkomponenter: konfokalmikroskopi, optisk pinsett og metall nanopartikler. Optisk pinsett brukes til å fange AuNPs, og deres konstruksjon kan oppnås ved å følge prosedyren skissert av Neuman et al.49. Men hvis det viser seg å være for utfordrende å bygge en optisk pinsett, kan en tett fokusert NIR-laser brukes til å bestråle AuNPs immobilisert under cellene. Mens sfæriske AuNPer ble valgt for denne protokollen, kunne en rekke plasmoniske partikler med justerbare absorpsjonsspektra også benyttes for å oppnå en svært lokalisert temperaturgradient innenfor NIR-regionen48.

Fluorescensavbildning er nødvendig for å observere rollen til de fluorescerende merkede proteinene, og derfor kan total intern refleksjonsmikroskopi (TIRF)56 betraktes som et alternativ til konfokal avbildning. Denne teknikken tillater imidlertid bare overflateavbildning og vil ikke være kompatibel med modellmembranvesikelforsøkene. Følgelig er både den optiske pinsetten og konfokalmikroskopet avgjørende for den nøyaktige lokaliseringen av nanopartikkelen og detaljert undersøkelse av lokalområdet rundt celleskaden. For effektivt å bestråle nanopartikkelen med et diffraksjonsbegrenset laserfokus, er det nødvendig å visualisere nanopartikkelen. Dette kan oppnås optimalt ved refleksjonsmikroskopi, som er en standard avbildningsfunksjon i Leicas konfokale mikroskoper. Imidlertid, hvis refleksjon eller spredningsavbildning ikke er tilgjengelig, kan alternative metoder, for eksempel den mindre effektive fluorescerende AuNP-merkingen, vurderes.

Oppsummert har den svært kontrollerbare og lokaliserte termoplasmoniske metoden som presenteres i denne studien, potensial til å tjene som en utmerket plattform for å undersøke molekylære komponenter involvert i cellulære responser og PM-reparasjonsmekanismer i levende celler. I tillegg til å studere proteinresponsen ved PM-skade, kan denne tilnærmingen også brukes til lokalt punktering av vesikler, og dermed muliggjøre en undersøkelse av proteinresponsen i både protein-protein og proteinmembrandynamikk. Videre tillater denne metoden en kvantitativ analyse av samspillet mellom proteiner, lipider og små molekyler når membraner forstyrres. Samlet har disse fremskrittene potensial til å kaste lys over noen av de uløste spørsmålene angående det intrikate og komplekse plasmamembranreparasjonsmaskineriet.

Protocol

1. Forberedelse av punktering av cellemembran

  1. Cellesåing (dag 1)
    1. Dyrkning av humane embryonale nyreceller (HEK293T) i dyrkningsmedium ved 37 °C i en 5 % CO2 fukterinkubator til de når 70 % konfluens.
    2. Løsne cellene fra overflaten ved hjelp av 500 μL trypsin, telle 200 000 HEK293T celler, og frø dem i en kulturfat med et totalt volum på 3 ml kulturmedium. Inkuber cellene ved 37 °C i en 5% CO2 luftfukter inkubator i 24 timer.
      MERK: For å forhindre celleklynging i midten av fatet, spre cellene jevnt og unngå å virvle parabolen, da dette kan redusere transfeksjonseffektiviteten.
  2. Celletransfeksjon (dag 2)
    MERK: De transfekterte cellene kan brukes opptil 48 timer etter transfeksjon.
    1. Pipet plasmidet av interesse og transfeksjonsreagenset i 5 s før bruk.
    2. I et sterilt 2 ml rør blandes følgende i den spesifikke rekkefølgen: 500 μL redusert serummedium, 5 μL transfeksjonsreagens (4 ganger mer enn plasmidet) og 1,25 μL plasmid (1 μg / μL).
      MERK: For å undersøke kalsiuminnstrømning ved membranbrudd, følg samme prosedyre, men bruk den membranbundne kalsiumsensorsonden GCaMP6-CAAX (1 μg / μL).
    3. Piper transfeksjonsblandingen forsiktig, men grundig og inkuber den ved romtemperatur (RT) i 30 minutter før den tilsettes dråpevis til cellene.
    4. Før du tilsetter transfeksjonsblandingen, fjern mediet fra kulturfatet, vask forsiktig cellene med 2 ml fosfatbufret saltvann og tilsett 2000 μL redusert serummedium til parabolen.
    5. Inkuber cellene sammen med transfeksjonsblandingen ved 37 °C i en 5% CO2 luftfukter inkubator i 2 timer og 45 minutter før du skifter medium til 3 ml kulturmedium.
  3. Fremstilling av gull nanopartikkel (AuNP) løsning (dag 2)
    1. Vortex 200 nm AuNP stamløsning for 10 s på nivå 10 (se materialfortegnelse for ytterligere spesifikasjon av apparat), sonikat i 5 min (maks amplitude) og vortex igjen i 10 s.
    2. Bland 150 μL AuNP med 850 μL destillert vann til et totalt volum på 1 ml.
      MERK: Den fortynnede AuNP-oppløsningen kan oppbevares i kjøleskapet og gjenbrukes i opptil 1 måned.
  4. Tilberedning av forsøksretten (dag 2)
    1. Belegg mikrobrønnfatet med 150 μL 0,01% -0,1% cellefesteløsning og inkuber i 15 minutter ved RT.
    2. Vask glassoverflaten to ganger med 500 μL destillert vann og la det lufttørke i ~ 10 min.
    3. Tilsett 80 μL AuNP-oppløsning dråpevis til den tørre overflaten.
      MERK: Vortex (10 s), sonicate (5 min) og vortex (10 s) den fortynnede AuNP-løsningen før du legger den til den belagte glassoverflaten for å minimere AuNP-aggregater.
    4. Vent i ~10 min før du introduserer 1,5 ml kulturmedium. La retten ruge ved 37 °C over natten.
  5. Klargjøring av forsøkskammeret (dag 3)
    MERK: Eksperimentkammeret kan tilberedes på enten dag 3 eller 4; Sørg imidlertid for at følgende forberedelser gjøres samme dag som eksperimentet.
    1. Fjern mediet fra cellene i kulturskålen og vask cellene med 2 ml fosfatbufret saltvann.
      MERK: Dette trinnet er viktig for å fjerne gjenværende medium og rusk som kan forstyrre de påfølgende trinnene.
    2. Tilsett 500 μL enzymbasert celledetachmentløsning til brønnen og inkuber i 1-3 minutter til cellene har løsnet fra dyrkningsskålen.
    3. Tilsett 1,5 ml friskt kulturmedium og pipetter celleløsningen for å få en homogen celleløsning for å minimere sannsynligheten for celleklynger.
    4. Fjern forsiktig mediet fra AuNPene i den eksperimentelle mikrobrønnen.
    5. Tilsett celleløsningen (2 ml) i mikrobrønnen og la den ruge i minst 5 timer før forsøket utføres.
      MERK: For optimale eksperimentelle forhold, unngå å virvle kammeret, da dette kan føre til at celler klynger seg i midten av kammeret.

2. Cellemembran punktering eksperiment

  1. Optiske innstillinger for eksperimentet
    1. Utfør eksperimentene ved hjelp av et konfokal skanningsmikroskop kombinert med en 1064 nm fangstlaser57.
    2. Utfør den optiske fangsten på fokalplanet ved hjelp av et 63x vann-nedsenkingsmål med en numerisk blenderåpning (NA) på 1,2.
    3. Anta at fokuset er på størrelse med en luftig skive og at brennstrålebredden til bestrålingslaseren er ~ 540 nm i radius.
    4. Konverter lasereffekten (P) til tilsvarende laserintensitet (I) ved å beregne lasereffekten per område (W/cm2).
    5. Bruk en akusto optisk strålesplitter (AOBS) for å visualisere flere fluorescerende signaler oppdaget ved hjelp av fotomultiplikatorrør og samtidig deteksjon av metalliske NP via deres spredningssignal.
      MERK: Ikke alle konfokalsystemer er utstyrt med AOBS, som tillater refleksjonsavbildning av metalliske NPer. Her må andre former for deteksjon implementeres, eller en sekvensiell skanning av NIR-laseren i området under cellen kan forsøkes.
    6. Under eksperimentelle økter, monter et glassbunn åpent kammer som inneholder celler, molekylære fluorescerende prober og gull nanopartikler på mikroskopet.
    7. Flytt fellen i forhold til cellene ved å oversette prøven montert på et piezoelektrisk stadium, slik at nanometer-presise sidebevegelser16.
      MERK: Den optiske fellen holdes i ro.
  2. Eksperimentelle innstillinger for cellemembranpunkturen
    1. Plasser HEK293T celler, transfeksjonert med anneksinplasmider kombinert med et fluorescerende protein, på toppen av isolerte AuNPer som er immobilisert på glassoverflaten (figur 1A).
    2. Bruk en Argon 488 nm laser for å visualisere GFP-fluorescenssignalet og en HeNe 633 nm laser for å observere AuNP-refleksjon i skanningskonfokalmikroskopet.
    3. Bruk den optiske pinsetten, som opererer med en 1064 nm NIR-laser, for å bestråle en enkelt AuNP i ~ 1 s, noe som induserer en betydelig lokal temperaturøkning som forstyrrer plasmamembranen.
    4. Påfør bestråling mellom 200-295 mW på den fokuserte partikkelen, noe som resulterer i en betydelig temperaturøkning.
      MERK: Det er et betydelig tap av strøm i optikken, med laserkraften ved fokuspunktet som når rundt 20% av den angitte milliwatt, avhengig av det spesifikke oppsettet. Den spesifikke intensiteten (målt i W/cm2) avhenger av den nøyaktige justeringen av systemet, spesielt brennvidden. I tillegg er varmeledningen av glass høyere enn for celle og vann, og følgelig reduseres mengden varme som frigjøres til plasmamembranen litt48,58.
    5. Oppnå effektiv og lokalisert PM-skade og påfølgende proteinreparasjonsrespons ved riktig kalibrering av lokaliseringen av NIR-laserfokuspunktet. Dette oppnås ved å fange opp en enkelt AuNP suspendert i samme bildemedium og sikre at den valgte AuNP er i fokus før bestråling.
      MERK: Nanopartikkelen anses å være i fokus når spredningssignalet vises skarpest, dvs. viser klare kanter og fravær av en halo rundt partikkelen, når man observerer den i konfokalmikroskopi (figur 2C (ii)).
  3. Celle- og AuNP-tetthetsforhold
    1. Velg enkeltceller i stedet for celleklynger for å forhindre overlapping av plasmamembraner.
      MERK: Cellene skal festes til overflaten, med en flattrykt morfologi (tilleggsfigur 1), som tillater punktering av celleperiferien samtidig som det forhindrer skade på kjernemembranen (tilleggsfigur 2).
    2. Inkuber cellene i henhold til protokollen eller til de har slått seg ned og flatet ut for å forhindre AuNP-celleopptak. Unngå overdreven inkubasjonstid og reduser sannsynligheten for AuNP-endocytose ved bruk av PEGylerte AuNPs.
    3. Sørg for at de immobiliserte AuNP-ene er tilstede som enkeltpartikler, tilstrekkelig fordelt fra hverandre for å forhindre aggregater. Aggregater kan føre til en betydelig økning i termisk gradient, noe som resulterer i forhøyede temperaturer som kan forstyrre en betydelig del av cellen.
    4. Bytt ut prøven hver 1-2 time for å opprettholde cellehelsen.
      MERK: Langvarig eksponering kan føre til en forverring i cellehelsen, og kompromittere deres evne til å reagere nøyaktig på skade når det gjelder membranreparasjon. Denne nedgangen i cellehelsen observeres vanligvis ved en endring i celleform, da cellene virker mer sfæriske og stive, og til slutt kulminerer i celledød.

Utfyllende informasjon. Klikk her for å laste ned denne filen.

3. Giant unilamellar vesikkel (GUV) forberedelse

  1. Fremstilling av lipidblandingen
    1. Lag GUV-lipidsammensetningen ved å kombinere 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC) og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfo-L-serin (DOPS) lipider i et molforhold på 4: 1 (se tabell 1). Aliquot lipidlageret i 1,5 ml hetteglass i henhold til eksperimentelle behov og oppbevar dem ved -20 °C.
      MERK: For langvarig lipidkonservering og for å forhindre oksidasjon av umettede lipider, erstatt luften med argon i de alisiterte hetteglassene.
    2. Før du blander lipidene, rengjør en 50 μL og en 500 μL glass- eller metallsprøyte grundig med kloroform fem ganger for å sikre at de er fri for forurensninger for kloroformoppløste lipider.
      FORSIKTIG: Håndter kloroform i en avtrekkshette på grunn av dets toksisitet.
      1. Overfør det beregnede volumet av kloroform til et rent hetteglass av gult glass, etterfulgt av den spesifiserte mengden av hvert lipid (se tabell 1).
        MERK: For å unngå krysskontaminering mellom lipidlagre, sørg for at sprøytene rengjøres med kloroform.
      2. Til slutt, tilsett membranfargestoffet og bland lipidene grundig ved pipettering. Oppbevar den tilberedte lipidblandingen ved -20 °C for videre bruk; Blandingen forblir levedyktig i 2-3 uker uten betydelig lipidskade.
        MERK: Blandingen skal gjøres med en metall- eller glasssprøyte. Oppbevar alltid lipidene på is når de er ute av fryseren.
  2. Fremstilling av polyvinylalkohol (PVA) gel
    1. Forbered GUVene ved hjelp av gelassistert hydreringsmetode beskrevet av Weinberger et al.23med mindre modifikasjoner.
      1. Klargjør PVA-gelen ved å løse opp 5 g PVA i 100 ml av en buffer inneholdende 50 mM sukrose, 25 mM NaCl og 25 mM Tris (pH 7,4).
      2. Varm opp PVA-oppløsningen til 85 °C og rør til den blir gjennomsiktig. La det avkjøles til RT og oppbevar det i kjøleskap for videre bruk.
        MERK: PVA er ikke riktig oppløst i bufferen, og det er derfor nødvendig å varme opp til 85 °C.
  3. Forberedelse av glassglass
    1. Rengjør glassglass med etanol og la dem lufttørke. Deretter behandler du lysbildene med en luftplasmarenser for å fjerne eventuell gjenværende forurensning fra glassoverflaten.
    2. Fremstilling av PVA-belagte glassglass
      1. Varm PVA-gelen (5 %) opp til 60 °C i 30 minutter for å øke fluiditeten. Påfør 90 μL av den varme PVA på glassglasset, fordel jevnt og la det tørke i et varmeskap ved 50 °C i 50 minutter.
      2. Når PVA-glassglasset er klart, tilsett 30 μL av den tilberedte lipidblandingen ved hjelp av en glass- eller metallsprøyte og spred den i en tynn film ved hjelp av kanten av nålen.
      3. Tørk lipidblandingen ved å fordampe kloroforminnholdet under forsiktig nitrogentrykk. Tørk deretter glassglidene under et vakuum i 1,5-2 timer.
  4. Voksende GUVer i et kammer
    1. Monter det interne kammeret, tilsvarende i design til en tidligere publisert rapport59, ved hjelp av det forberedte glassglasset.
    2. I et separat 2 ml rør fortynnes det rekombinante proteinet av interesse (i dette tilfellet ANXA5 eller ANXA4) til en endelig konsentrasjon på 500 nM med en voksende buffer (GB) bestående av 80 mM sukrose, 70 mM NaCl og 25 mM Tris-HCl (pH 7,4).
    3. Tilsett 400 μL av den fortynnede rekombinante proteinoppløsningen til kammeret. Inkuber kammeret ved RT i 1 time for å la GUVer vokse fra det avsatte lipidbelegget. Bruk samme buffer, unntatt proteinet, som en negativ kontroll.
      MERK: Pakk kammeret inn i polyolefinfilm for å forhindre bufferfordampning.
    4. Samle GUVene ved å overføre 400 μL av kammerinnholdet til et 2 ml rør.
    5. Fjern ikke-innkapslede proteiner utenfor GUVene ved å tilsette 1 ml observasjonsbuffer (OB) inneholdende 55 mM glukose, 70 mM NaCl og 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) til den oppsamlede løsningen. Deretter sentrifugerer du oppløsningen ved 600 x g i 10 minutter ved 13 °C.
    6. Etter sentrifugering, erstatt 1 ml av supernatanten med et likt volum observasjonsbuffer. Spre GUVene gjennom forsiktig pipettering og oppbevar dem i kjøleskapet til de brukes i GUV-eksperimenter.

4. GUV-punkteringseksperiment

  1. Kammer forberedelse
    1. Bruk en 35 mm glassbunnsfat til eksperimentet. For å forhindre at GUV-er fester seg til overflaten og sprekker, belegg overflaten med β-kasein (5 mg / ml) i 15-30 minutter.
      1. For β-kaseinoppløsningen, oppløs 0,1 g av proteinet i en 20 ml buffer på 20 mM Tris (PH 7,5) og 100 mM NaCl. Filtrer proteinoppløsningen, alikot den i små hetteglass og frys den til videre bruk.
    2. Vask kammeret to ganger med observasjonsbuffer for å fjerne overflødig fri β-kasein fra overflaten og la tørke ved RT.
    3. I et separat 2 ml rør, bland de oppsamlede GUVene med OB. TilsettCaCl2 til blandingen for ønsket sluttkonsentrasjon (i dette tilfellet 200 μM).
    4. Introduser 150 nm gull nanoshells (AuNS) til blandingen i et forhold på 1:100. Den endelige blandingen består av 250 μL GUVer, 225 μL OB, 20 μLCaCl2 (5 mM) og 5 μL av de spesifiserte AuNSene.
  2. Eksperimentelt oppsett
    1. Overfør blandingen til kammeret og monter den på mikroskoptrinnet. Avhengig av kammerets størrelse, tilsett enten hele blandingen eller en del av blandingen.
      MERK: Timing er kritisk siden kalsiumioner kan passere gjennom membranen og formidle bindingen av vedleggene til membranens indre brosjyre.
    2. Bruk det samme optiske oppsettet som brukes til cellepunkteringseksperimentene.
    3. Bruk den optiske pinsetten til å fange en individuell AuNS i nærheten av eller på overflaten av en GUV ved å bruke en lasereffekt på ~ 125 mW.
    4. Deretter øker lasereffekten til ~ 300 mW. Dette gir en svært lokal temperaturøkning, som forstyrrer og punkterer membranen på målstedet.
      MERK: AuNS foretrekkes for GUV-eksperimentene på grunn av deres evne til å generere en høyere forbigående temperaturøkning samtidig som de opprettholder en mindre størrelse sammenlignet med faste AuNPer.

Table 1
Tabell 1: Tabell for bestemmelse av GUV-sammensetningen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

5. Målinger og dataanalyse av ANXA-respons i cellepunksjonseksperimenter

  1. Bruk MATLAB til å analysere bildene og til å beregne og plotte AuNP-temperaturprofilen (figur 1D, E) basert på Mies ligninger60,61.
  2. I tillegg behandler du alle konfokale bilder ved hjelp av FIJI ImageJ-distribusjonen62,63.
  3. Beregning av ANXA-ringradiusen
    1. Beskjær interesseområdet som inneholder det punkterte området fra rådataene før membranskadeanalyse.
    2. Bruk den interne MATLAB-arbeidsflyten til å behandle hvert bilde ved å manuelt merke midten av ANXA-ringen og dens ytre omkrets.
      1. Bruk disse markeringene til å angi behandlingsgrensene for interesseområdet.
        MERK: Området behandles deretter radialt innenfor de angitte grensene, og fluorescensintensiteten i en bestemt avstand til sentrum er gjennomsnittet over hele sirkelen med samme senteravstand. Dette nummeret lagres for hvert radiustrinn.
      2. Bruk arbeidsflyten til å tilpasse den gjennomsnittlige intensiteten over hele skanneområdet til en endimensjonal gaussisk kurve for å identifisere maksimum (Rp) og full bredde ved halv maksimum (FWHM) som tilsvarer henholdsvis Rext og Rint, som vist i figur 3A.
    3. Til slutt bestemmer du radiusen til ANXA-ringen etter avstanden fra ringens senter til Rext gitt av plottet generert av MATLAB-arbeidsflyten.
  4. Beregning av tredimensjonal ANXA-ringradius
    1. Spor endringen i ANXA-ringradius i z-retningen ved hjelp av den samme arbeidsflyten for MATLAB-analyse som i trinn 5.1. Påfør arbeidsflyten på flere konfokale z-seksjoner over membransåret, som illustrert i figur 3C, E.
    2. Beregn helningen for hvert sår basert på endringen i radier over z-seksjonene, som vist i figur 3F.
  5. Tidsutvikling av ANXA-ringradiusen
    1. På samme måte sporer du ANXA-ringens utvikling av ANXA-ringen etter termoplasmonisk membranpunktering ved hjelp av MATLAB-analysearbeidsflyten fra trinn 5.1. Analyser påfølgende tidspunkter for å overvåke endringer over tid, som vist i figur 3D, G, H.

Representative Results

I denne studien brukes den termoplasmoniske metoden til å undersøke anneksinproteinresponsen på plasmamembranforstyrrelser; Imidlertid kan ethvert protein som kan rekrutteres ved membranskade undersøkes ved hjelp av denne analysen, gitt at det respektive proteinet er fluorescerende merket. Proteinrekruttering og -funksjon overvåkes ved konfokal avbildning i både humane embryonale nyreceller (HEK293T) og gigantiske unilamellære vesikler (GUVer). For å utdype, illustrerer figur 2 de eksperimentelle forholdene der en fokusert NIR-laserstråle ved 1064 nm brukes til å bestråle en enkelt AuNP (figur 2A), noe som resulterer i membranskade og en tilstrømning av Ca2+ inn i cellen, og aktiverer PMR-maskineriet. Deretter rekrutteres anneksiner raskt til skadestedet, hvor de binder seg til de negativt ladede fosfolipidene ved såromkretsen og danner en ringlignende struktur i løpet av sekunder (figur 2B, i-iv). Modellmembraneksperimentene, ved hjelp av GUVer, viste at membranpunkteringer raskt ble forseglet i fravær av ANXA, som vist i figur 2C. I nærvær av ANXA ble det imidlertid observert en rask akkumulering av ANXA på skadestedet etter membranpunksjon (figur 2D). Spesielt fortsatte ANXA å rulle de eksponerte kantene, noe som til slutt førte til sprengning av GUV. Denne rullemekanismen antas å oppstå fra ANXAs evne til å indusere krumning og bøye lipidmembraner20.

Figure 2
Figur 2: Anneksiner (ANXAs) respons på termoplasmonisk indusert membranforstyrrelse. I utgangspunktet virker (A) plasmamembranen som en barriere mellom det ekstracellulære miljøet som inneholder høye nivåer av Ca2 + -ioner og det intracellulære miljøet med innkapslede ANXAer. Ved bestråling med en nær-infrarød (NIR) laser genererer AuNP betydelig varme, noe som får membranen til å sprekke og resulterer i en tilstrømning av Ca2 + -ioner. Følgelig aktiveres plasmamembranreparasjonsmaskineriet (PMR), noe som innebærer rekruttering av ANXAer til skadestedet, hvor de binder seg til negativt ladede fosfolipider. (VG Nett) Konfokalmikroskopibilder av en celle som inneholder ANXA2 og en GUV som inneholder ANXA4 demonstrerer denne prosessen. (i) Før bestråling viser bildene en intakt celle, eller GUV, med bestrålingsstedene betegnet med de hvite pilene. (ii) Ved nanopartikkelbestråling rekrutteres (B) ANXAer raskt til skadestedet, og danner en ringlignende struktur rundt membransåret (B [ii-iv]). Panel (C) viser en membranfarget GUV uten ANXA, som ved punktering forsegles raskt uten observerbar membranremodellering. På den annen side viser panel (D) en GUV som inneholder rekombinant ANXA4, som allerede er bundet til membranen før (i) bestråling på grunn av Ca2+ lekkasje over membranen. (ii) Ved punktering binder ANXA4 seg til de frie kantene, noe som får GUV-en til å kollapse når membranen ruller bort fra kanten. Skalastolpene måler 10 μm for figur (B), 2 μm for B (i), 10 μm for (C) og 15 μm for (D). Denne figuren er gjengitt fra Moreno-Pescador et. al 16 med tillatelse fra Royal Society of Chemistry. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Analysen av komplette ANXA-ringlignende strukturer (figur 2B og tilleggsfigur 1) gir nyttig innsikt i sårstørrelse og morfologi. Radiusen til ANXA-ringstrukturen kan bestemmes over tid og rom, som beskrevet i avsnitt 5. Moreno et al.16 analyserte over 135 membranskader i levende celler, hvor analysen av ANXA5-ringstrukturer er avbildet i figur 3. Radiusen ble bestemt ved å måle avstanden fra midten av ringen til kurvens ytre radius basert på halvmaksimum i full bredde av den kollapsede intensitetsprofilen (figur 3A). Funnene illustrerte en heterogen fordeling av ANXA5-ringstørrelser (figur 3B), som holdt seg konstant over tid (figur 3D,G,H) og rom (figur 3C,E,F). Disse resultatene antyder en akkumulering av ANXA5 rundt skadestedene, noe som indikerer en alternativ ANXA5-mediert PMR-strategi i levende celler til den hypotetiske traktlignende innoverspiringen av den skadede membranen5.

Figure 3
Figur 3: Analyse av ANXA5-ringstrukturer rundt et skadested i levende celler. (A) Den skjematiske fremstillingen illustrerer den analytiske tilnærmingen, som er basert på halvmaksimumet i full bredde av ANXAs intensitetslinjeprofil. (B) Histogrammet illustrerer 135 målte ANXA5-ringradier. (C) Fluorescensintensitetslinjeprofiler over en ANXA5-GFP-ring for hvert z-snitt av z-stakken. (D) De konfokale bildene illustrerer tidsutviklingen av et sår, hvor ANXA5-GFP akkumuleres ved såromkretsen umiddelbart etter skade, etterfulgt av sårstabilisering. Tidsrammene merket 1-6 ble fanget med 0,66 s intervaller per ramme. Skalastangen er 2 μm. (E) Sårenes radier ble bestemt som en funksjon av sårdybde basert på metoden presentert i panel A. (F) Sårets helning ble analysert som ANXA5-ringradier som en funksjon av z-høyde basert på dataene ekstrahert fra panel E. (G) Fluorescensintensitetslinjeprofilene ble målt over ANXA5-GFP-ringen fra panel D, hvor hvert tidsintervall 1-6 betegnes som skive 1-6. Til slutt, (H) er tidsutviklingen til ANXA5-GFP-ringradiene presentert som en funksjon av tid beregnet fra dataene i panel G. Denne figuren er gjengitt fra Moreno-Pescador et. al 16 med tillatelse fra Royal Society of Chemistry. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Sammenlignet med de ringlignende strukturene som dannes ved å forstyrre svevestøvet alene (tilleggsfigur 1), kan skader i umiddelbar nærhet av kjernen (tilleggsfigur 2A) påvirke sårets utvikling og geometri. Av og til var bare en brøkdel av ANXA-ringene tydelige (tilleggsfigur 2B,C), som også kan analyseres ved hjelp av den interne arbeidsflyten for MATLAB-analyse (se avsnitt 5), selv om ytterligere data kan gå tapt. Vanligvis er ANXA-ringformasjoner observert i ikke-adherente celler (tilleggsfigur 2C) lokalisert nær både kjernen og cellens periferi. Som en konsekvens kan en mer langstrakt ringstruktur observeres, noe som er suboptimalt for dataanalysen som presenteres. I tillegg syntes ikke-adherente celler å være mer utsatt for celledød etter PM-skade. Videre, når man vurderer skader som følge av bestråling av AuNP-aggregater, er det viktig å merke seg at disse skadene kan være mer alvorlige og mindre kontrollerbare. Dette skyldes den betydelige økningen i plasmonisk oppvarming, noe som kan skade en stor del av cellen. Som et resultat har slike skader ikke blitt innlemmet i ANXA5-ringanalysen.

Videre indikerer de foreløpige funnene at forstyrrelsen av plasmamembranen ved bruk av termoplasmonikk resulterer i forhøyede intracellulære Ca2+ nivåer. Dette ble observert selv ved lavintensiv bestråling av enkle AuNPer, noe som tyder på PM-permeabilisering35, som vist i figur 4. Ca2+ -tilstrømningen ble observert i celler som uttrykker en membranbundet kalsiumsonde, GCaMP6s-CAAX, som gjennomgår en konformasjonsendring ved Ca2+ tilstrømning, og dermed kan en økning i intensiteten observeres64. Kalsiumintensiteten ble kvantifisert for hele cellens fotavtrykk over tid. For å eliminere bakgrunnsstøy ble bakgrunnen Ca2+ -nivået trukket fra før membranforstyrrelser og reparasjon etter membran. Maksimal intensitet ble bestemt ved å normalisere gjennomsnittlig Ca2+ intensitet i cellen, noe som resulterte i en intensitetskurve som viste en rask innledende Ca2+ intensitetsøkning etterfulgt av en langsommere reduksjon, som vist i figur 4B.

Cellen nådde en maksimal kalsiumintensitet på ~ 6,6 s, noe som stemmer overens med funnene til Klenow et al.64, som foreslo at tidspunktet for kalsiumintensitetstoppen (t = tc) tilsvarer tiden som kreves for sårlukking. Likevel, mens ytterligere undersøkelser er nødvendig for å etablere den underliggende mekanismen for membranreparasjon og sårheling, viste de foreløpige funnene at denne Ca2+ -prosessen ble observert utelukkende i den skadede cellen og ikke i den uskadde cellen som ble brukt som en positiv kontroll. Dette bekrefter at cellen opplevde Ca2+ tilstrømning ved termoplasmonisk membranforstyrrelse, hvor overflødig intracellulært kalsium pumpes aktivt ut etter vellykket PMR da det intracellulære kalsiumnivået ikke lenger er i konkurranse med Ca2+ tilstrømningen, og til slutt oppnår cellehomeostatis64.

Figure 4
Figur 4 Kalsiumtilførsel oppstår ved at plasmamembranen til en HEK293T celle brytes av termoplasmonikk. En serie konfokale bilder viser to celler (cellen av interesse og en uskadd celle brukt som en positiv kontroll) som uttrykker den membranbundne kalsiumsonden, GCaMP6s-CAAX. Skalastangen måler 10 μm. (A) Før bestråling, klokken 00:00, visualiseres fotavtrykket til de to cellene av den grå stiplede linjen, og bestrålingsstedet er betegnet med den gule sirkelen. Ved laserbestråling observeres en rask tilstrømning av Ca2+ og når maksimal intensitet ved ~ 6,6 s, betegnet med den oransje stiplede linjen, et tidspunkt som antas å tilsvare tidspunktet for sårlukking64. (B) Kalsiumintensitetsprofilen oppnådd fra GCaMP6s-CAAX-sonden i den skadde cellen (blå linje) ble sammenlignet med Ca2+-intensiteten i en nærliggende uskadd celle (grå stiplet linje), og viste en klar Ca2+ tilstrømning utelukkende ved PM-forstyrrelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Studien fremhever den termoplasmoniske tilnærmingen som en lovende teknikk for å utforske proteinresponser i levende celler og modellmembraner etter membranforstyrrelser. Denne metoden gir ikke bare omfattende informasjon om proteinrekruttering, men også om den biofysiske funksjonen til proteiner involvert i proteinmembrandynamikk. Følgelig letter det identifiseringen av molekylære komponenter som er ansvarlige for overflatereparasjon og fremmer forståelsen av det komplekse, men vitale maskineriet for reparasjon av plasmamembran. Selv om det finnes ulike metoder for å indusere membranforstyrrelser, for eksempel mekaniske, kjemiske og optiske teknikker, lider disse metodene av begrensninger, for eksempel å være ikke-spesifikke for celler, generere flere skader på cellemembranen, eller forårsake betydelig skade på membranen og ablatere internt cellulært materiale langs laserbanen ved bruk av høyeffekts pulserende lasere. Mens integrasjonen av konfokalmikroskopi og optisk pinsett gir den mest omfattende informasjonen, kan alternative bildebehandlingsmodaliteter også brukes. For eksempel, da avbildning av den plasmoniske nanopartikkelen oppnås ved hjelp av refleksjonsmikroskopi, en innebygd bildebehandlingsmodus i Leica konfokale mikroskoper, kan ytterligere bildebehandlingsteknikker, som mørkefeltsmikroskopi65,66, andre spredningsmetoder som iSCAT67,68 eller fluorescerende merking av nanopartikkelen, brukes til AuNP-visualisering, selv om dette kan begrense anvendeligheten av metoden.

Den presenterte metoden er i tillegg i stand til å indusere nanoskopiske hull i modellmembraner, noe som muliggjør undersøkelse av synergieffektene mellom forskjellige anneksiner. Dette oppnås ved å innkapsle forskjellig merkede rekombinante anneksiner, henholdsvis RFP og GFP, etterfulgt av termoplasmonisk punktering. Dette modellsystemet gir innsikt i hvordan anneksiner vekselvirker med membraner i nærheten av frie kanter, som vist i figur 2D. Imidlertid, i motsetning til i celler, fortsetter hullene påført GUVer å ekspandere, etterfulgt av destabilisering av vesiklet. Avbildning av hullutviklingen ved hjelp av konfokalmikroskopi kan være utfordrende på grunn av den raske utvidelsen av hulldiameteren, men kan oppnås ved å fange flere z-stabler over tid. En alternativ metode ville være å bruke en spinnende disk confocal for raskere avbildning. Videre gir den termoplasmoniske tilnærmingen vanligvis et begrenset antall optimale resultater per time når den brukes på enkeltceller eller GUV-eksperimenter, vanligvis to til tre, ved prøvetemperaturer mellom 20 ° C og 30 ° C. For å oppnå den mest nøyaktige observasjonen av proteinmembrandynamikk, anbefales det å holde cellene i en HEPES-holdig buffer og erstatte prøven hver time. Alternativt kan eksperimentvinduet utvides ved å utføre eksperimentene i et celleinkubasjonskammer, dvs. ved en konstant temperatur på 37 °C med 5% CO2. Videre kan kombinere denne tilnærmingen med andre bildebehandlingsteknikker, for eksempel stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (STORM), gi en dypere forståelse av den biofysiske funksjonen og samspillet mellom nøkkelproteiner involvert i membranreparasjon på enkeltmolekylnivå. Dette kan gi detaljert informasjon om skadestedet, inkludert sårgeometri og plassering av annexinproteiner, samt identifisere andre viktige aktører involvert i reparasjon av membranoverflaten.

For å oppnå maksimal effektivitet og presisjon ved indusering av membranskade, er det viktig å verifisere plasseringen av laserfokuset før hvert eksperiment og sikre at den aksiale posisjonen til laserfokuset sammenfaller med konfokalfokuset. Denne justeringen optimaliserer intensiteten under AuNP-avbildning, noe som fører til maksimal lokal temperaturøkning og påfølgende membranskade ved lavere lasereffekt. Denne prosessen utføres manuelt og er derfor utsatt for variabilitet i membranbruddeffektivitet ettersom fokuset manuelt oversettes til en posisjon som sammenfaller med partikkelens plassering. I mikroskoper som mangler refleksjonsmodus, som i noen kommersielle systemer, kan samlokalisering av laserfokus og partikkel være utfordrende. I slike tilfeller kan alternative avbildningsmodi (f.eks. lysfelt) benyttes, og en langsom rasterskanning kan utføres rundt den forventede partikkelposisjonen. Det skal bemerkes at lav lasereffekt sannsynligvis bare vil indusere membranpermeabilisering, mens høy lasereffekt kan generere temperaturer rundt NP som overskrider kokepunktet for vann, selv om glassoverflaten har en avkjølende effekt. Det er anslått at dannelsen av nanobobler som omgir NPene skjer mellom 200 ° C og 300 ° C 25,48, hvor eksplosiv varme kan resultere i enten partikkelforskyvning fra laserfokus eller partikkelfragmentering. I tillegg utgjør dannelsen av nano eller mikrobobler under oppvarming en utfordring for denne metoden. Siden luftgrensesnitt dewet membraner og kan forårsake protein destabilisering, noe som er uønsket, er det viktig å begrense oppvarmingen når man undersøker membranreparasjon. Spesielt toler gull nanoshells ikke høye temperaturer og vil nedbrytes under disse forholdene, som demonstrert ved høyoppløselig mikroskopi58.

Denne artikkelen gir en detaljert protokoll for bruk av termoplasmonikk for å utføre svært lokaliserte punkteringer i membraner, som gjelder for både celler og modellmembraner. For ytterligere å redusere omfanget av oppvarming, kan mindre nanopartikler resonans med NIR-lys utnyttes, noe som muliggjør intracellulære punkteringer i endosomer, endoplasmatisk retikulum og nukleær konvolutt. Slike nanopartikler, inkludert stenger og nanomatryoshkas48, kan brukes til å undersøke kjernefysisk konvoluttreparasjon ved å målrette endocytoserte gullnanopartikler som lett tas opp på celleoverflaten og trafikkeres mot kjernen69. Samlet sett muliggjør denne teknikken identifisering og undersøkelse av viktige molekylære komponenter involvert i PMR, som belyser deres biofysiske funksjon og rolle samtidig som cellens levedyktighet opprettholdes.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Jesper Nylandsted for å gi oss rekombinante anneksinproteiner og plasmider som koder for anneksiner. Dette arbeidet ble støttet økonomisk av Rådet for Selvstendig Forskning, Naturvitenskap (DFF-4181-00196), av Novo Nordisk Foundation Interdisciplinary Synergy Program 2018 (NNF18OC0034936), Vitenskapskomiteen Danish Cancer Society (R90-A5847-14-S2), Lundbeck Foundation (R218-2016-534), og av Lundbeck Foundation Center of Excellence (Biomembranes in Nanomedicine).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1064 nm trapping laser Spectra Physics N/A Spectra Physics J201-BL-106C, Nd: YVO4 NIR laser
160 nm Gold Nanoshells NanoComposix NCXGSIR150
200 nm Gold Nanoparticles BBI Solutions EM.GC200/7
35 mm glass surface MatTex microwell MATTEK P35G-1.5-14-C
Amber-glass vials Supelco Sigma Aldrich 243438
Annexin A2 plasmids N/A N/A Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Annexin A4 recombinant-protein  N/A N/A N-terminal GFP tagged ANXA4 received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Annexin A5 recombinant-protein  N/A N/A N-terminal GFP tagged ANXA5 received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
beta-casein Sigma Life Science C6905-1G
CaCl2 Suprlco (sigma Aldrich) 10035-04-8
Centrifuge 5702 Eppendorf 5702
Chloroform VWR Chemicals 67-66-3
Culture dish (Nunclon Delta Surface) Thermo scientific 150460
DID cell-labelling Solution Invitrogen  7757
Distilled water Gibco 15230-089
DOPC Avanti Polar Lipids 850375C Dissolved in chloroform 
DOPS Avanti Polar Lipids 840035C Dissolved in chloroform
Dulbecco's Modified Eage's Medium Thermo Fisher Scientific 11995065
FIJI ImageJ distribution ImageJ2 N/A
GCaMP6s-CAAX N/A Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Gibco Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 11573397 10% of the culture medium
Glucose PROLABO 24 374.297
Hamilton syringes Hamilton Company N/A 50 and 500 microliters
Harrick Plasma Cleaner PDG-002 Harrick Plasma N/A
HEK293T cells N/A Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Leica Acousto-Optical Beam Splitter (AOBS) Leica N/A
Leica PL APO 63x water immersion objective, NA = 1.2 Leica N/A
Leica SP5 confocal scanning microscope Leica N/A
Lipofectamine Fisher Scientific 15338030
MatLab The Mathworks, Inc., Natick, Massachusetts, United States N/A
NaCl VWR Chemicals 7647-14-5
Opti-MEM Reduced-Serum Medium Thermo Fisher Scientific 11058021
Parafilm Bemis PM-992
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 1% of the culture medium
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
Piezoelectric stage (PI 731.20)  Physik Instrumente (Germany) N/A
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P8920-100ML 0.01-0.1% for coating
Polyvinyl alcohol Sigma-Aldrich 363065-25G
round glass slide 25 mm Ø VWR 631-1584
Sonicator Brandson 2800 Brandson N/A
sucrose Sigma Life Science 57-50-1
T25 tissue culture flask Falcon 353108 Blue Vented cap
Tris-HCl Invitrogen  15567-027
TrypLE Thermo Fisher Scientific A1285901
Trypsin-EDTA Fisher Scientific 11590626
 VWR Mixer mini vortex 230V EU VWR  12620-84  ECN: 444-2790, SN: 150713022

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bendix, P. M., et al. Interdisciplinary synergy to reveal mechanisms of annexin-mediated plasma membrane shaping and repair. Cells. 9 (4), 1029 (2020).
  2. Gajic, O., Lee, J., Doerr, C. H., Berrios, J. C., Myers, J. L., Hubmayr, R. D. Ventilator-induced Cell Wounding and Repair in the Intact Lung. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 1057-1063 (2003).
  3. McNeil, P. L., Khakee, R. Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage. The American Journal of Pathology. 140 (5), 1097-1109 (1992).
  4. Yu, Q. C., McNeil, P. L. Transient disruptions of aortic endothelial cell plasma membranes. The American Journal of Pathology. 141 (6), 1349-1360 (1992).
  5. Boye, T. L., et al. Annexin A4 and A6 induce membrane curvature and constriction during cell membrane repair. Nature Communications. 8, 1623 (2017).
  6. Bischofberger, M., Gonzalez, M. R., van der Goot, F. G. Membrane injury by pore-forming proteins. Current Opinion in Cell Biology. 21, 589-595 (2009).
  7. Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. Self-repairing cells. Science (New York, N.Y.). 356, 1022-1025 (2017).
  8. Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. Single cell wound repair: Dealing with life's little traumas. Bioarchitecture. 1, 114-121 (2011).
  9. Sønder, S. L., et al. Annexin A7 is required for ESCRT III-mediated plasma membrane repair. Scientific Reports. 9, 6726 (2019).
  10. Andrews, N. W., Almeida, P. E., Corrotte, M. Damage control: cellular mechanisms of plasma membrane repair. Trends in Cell Biology. 24 (12), 734-742 (2014).
  11. Idone, V., Tam, C., Goss, J. W., Toomre, D., Pypaert, M., Andrews, N. W. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. The Journal of Cell Biology. 180 (5), 905-914 (2008).
  12. Lauritzen, S. P., Boye, T. L., Nylandsted, J. Annexins are instrumental for efficient plasma membrane repair in cancer cells. Seminars in Cell & Developmental Biology. 45, 32-38 (2015).
  13. Häger, S. C., Nylandsted, J. Annexins: players of single cell wound healing and regeneration. Communicative & Integrative Biology. 12 (1), 162-165 (2019).
  14. Jaiswal, J. K., et al. S100A11 is required for efficient plasma membrane repair and survival of invasive cancer cells. Nature Communications. 5, 3795 (2014).
  15. Draeger, A., Monastyrskaya, K., Babiychuk, E. B. Plasma membrane repair and cellular damage control: The annexin survival kit. Biochemical Pharmacology. 81 (6), 703-712 (2011).
  16. Moreno-Pescador, G. S., et al. Thermoplasmonic nano-rupture of cells reveals annexin V function in plasma membrane repair. Nanoscale. 14 (21), 7778-7787 (2022).
  17. Zhivotovsky, B., Orrenius, S. Calcium and cell death mechanisms: A perspective from the cell death community. Cell Calcium. 50 (3), 211-221 (2011).
  18. Gerke, V., Moss, S. E. Annexins: From structure to function. Physiological Reviews. 82 (2), 331-371 (2002).
  19. Idone, V., Tam, C., Andrews, N. W. Two-way traffic on the road to plasma membrane repair. Trends in Cell Biology. 18 (11), 552-559 (2008).
  20. Boye, T. L., et al. Annexins induce curvature on free-edge membranes displaying distinct morphologies. Scientific Reports. 8, 10309 (2018).
  21. Bouter, A., et al. Annexin-A5 assembled into two-dimensional arrays promotes cell membrane repair. Nature Communications. 2, 270 (2011).
  22. Boye, T. L., Nylandsted, J. Annexins in plasma membrane repair. Biological Chemistry. 397 (10), 961-969 (2016).
  23. Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105 (1), 154-164 (2013).
  24. Numata, T., Tatsuta, H., Morita, Y., Otani, Y., Umeda, N. Localized thermal processing with a laser-trapped and heated metal nanoparticle. IEEJ Transactions on Electrical and Electronic Engineering. 2, 398-401 (2007).
  25. Bendix, P. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B. Direct measurements of heating by electromagnetically trapped gold nanoparticles on supported lipid bilayers. ACS Nano. 4 (4), 2256-2262 (2010).
  26. Kyrsting, A., Bendix, P. M., Stamou, D. G., Oddershede, L. B. Heat profiling of three-dimensionally optically trapped gold nanoparticles using vesicle cargo release. Nano Letters. 11 (2), 888-892 (2011).
  27. Andersen, T., Kyrsting, A., Bendix, P. M. Local and transient permeation events are associated with local melting of giant liposomes. Soft Matter. 10 (24), 4268-4274 (2014).
  28. Bahadori, A., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Hot-nanoparticle-mediated fusion of selected cells. Nano Research. 10, 2034-2045 (2017).
  29. Rørvig-Lund, A., Bahadori, A., Semsey, S., Bendix, P. M., Oddershede, L. B. Vesicle fusion triggered by optically heated gold nanoparticles. Nano Letters. 15 (6), 4183-4188 (2015).
  30. Moreno-Pescador, G., Arastoo, M. R., Ruhoff, V. T., Chiantia, S., Daniels, R., Bendix, P. M. Thermoplasmonic vesicle fusion reveals membrane phase segregation of influenza spike proteins. Nano Letters. 23 (8), 3377-3384 (2023).
  31. Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters. SPIE Proceedings. SPIE 9922, Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 992211, (2016).
  32. Bahadori, A., Moreno-Pescador, G., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Remotely controlled fusion of selected vesicles and living cells: a key issue review. Reports on Progress in Physics. 81 (3), 32602 (2018).
  33. Moreno-Pescador, G., Arastoo, M. R., Chiantia, S., Daniels, R., Bendix, P. M. Thermoplasmonic induced vesicle fusion for investigating membrane protein phase affinity. bioRxiv. , (2022).
  34. Pescador, G. S. M., et al. Investigating plasma-membrane repair employing thermoplasmonics. Biophysical Journal. 120 (3), 45A (2021).
  35. Moreno-Pescador, G. S., Qoqaj, I., Thusgaard Ruhoff, V., Iversen, J., Nylandsted, J., Bendix, P. M. Effect of local thermoplasmonic heating on biological membranes. SPIE 11083, Optical Trapping and Optical Micromanipulation XVI. 110830M, (2019).
  36. Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current Biology. 9 (11), 579-587 (1999).
  37. Weisleder, N., et al. Recombinant MG53 protein modulates therapeutic cell membrane repair in treatment of muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 4 (139), 139ra85 (2012).
  38. Sudji, I. R., Subburaj, Y., Frenkel, N., García-Sáez, A. J., Wink, M. Membrane disintegration caused by the steroid saponin digitonin is related to the presence of cholesterol. Molecules. 20 (11), 20146-20160 (2015).
  39. Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. Intracellular Ca2+ operates a switch between repair and lysis of streptolysin O-perforated cells. Cell Death & Differentiation. 16, 1126-1134 (2009).
  40. Nygård Skalman, L., Holst, M. R., Larsson, E., Lundmark, R. Plasma membrane damage caused by listeriolysin O is not repaired through endocytosis of the membrane pore. Biology Open. 7 (10), bio035287 (2018).
  41. Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6004-6009 (2014).
  42. Yeheskely-Hayon, D., Minai, L., Golan, L., Dann, E. J., Yelin, D. Optically induced cell fusion using bispecific nanoparticles. Small. 9 (22), 3771-3777 (2013).
  43. Minai, L., Yeheskely-Hayon, D., Golan, L., Bisker, G., Dann, E. J., Yelin, D. Optical nanomanipulations of malignant cells: Controlled cell damage and fusion. Small. 8 (11), 1732-1739 (2012).
  44. Lukianova-Hleb, E., et al. Plasmonic nanobubbles as transient vapor nanobubbles generated around plasmonic nanoparticles. ACS Nano. 4 (4), 2109-2123 (2010).
  45. Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Applied Physics B. 81, 1015-1047 (2005).
  46. Baffou, G., Polleux, J., Rigneault, H., Monneret, S. Super-heating and micro-bubble generation around plasmonic nanoparticles under cw illumination. Journal of Physical Chemistry C. 118 (9), 4890-4898 (2014).
  47. Sasikumar, K., Liang, Z., Cahill, D. G., Keblinski, P. Curvature induced phase stability of an intensely heated liquid. Journal of Chemical Physics. 140 (23), 234506 (2014).
  48. Jauffred, L., Samadi, A., Klingberg, H., Bendix, P. M., Oddershede, L. B. Plasmonic heating of nanostructures. Chemical Reviews. 119 (13), 8087-8130 (2019).
  49. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  50. Bendix, P. M., Jauffred, L., Norregaard, K., Oddershede, L. B. Optical trapping of nanoparticles and quantum dots. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 20, 15-26 (2014).
  51. Samadi, A., Bendix, P. M., Oddershede, L. B. Optical manipulation of individual strongly absorbing platinum nanoparticles. Nanoscale. 46, 18449-18455 (2017).
  52. Jørgensen, J. T., Norregaard, K., Tian, P., Bendix, P. M., Kjaer, A., Oddershede, L. B. Single particle and PET-based platform for identifying optimal plasmonic nano-heaters for photothermal cancer therapy. Scientific Reports. 6, 30076 (2016).
  53. Goldenberg, H., Tranter, C. J. Heat flow in an infinite medium heated by a sphere. British Journal of Applied Physics. 3 (9), 296-298 (1952).
  54. Eustis, S., El-Sayed, M. A. Why gold nanoparticles are more precious than pretty gold: Noble metal surface plasmon resonance and its enhancement of the radiative and nonradiative properties of nanocrystals of different shapes. Chemical Society Reviews. 35, 209-217 (2006).
  55. Landau, L. D., Lifshitz, E. M. Fluid Mechanics: Landau and Lifshitz: Course of Theoretical Physics. 6, Elsevier. (2013).
  56. Niederauer, C., Seynen, M., Zomerdijk, J., Kamp, M., Ganzinger, K. A. The K2: Open-source simultaneous triple-color TIRF microscope for live-cell and single-molecule imaging. HardwareX. 13, e00404 (2023).
  57. Richardson, A. C., Reihani, N., Oddershede, L. B. Combining confocal microscopy with precise force-scope optical tweezers. SPIE Proceedings:SPIE 6326, Optical Trapping and Optical Micromanipulation III. 632628, (2006).
  58. Samadi, A., Klingberg, H., Jauffred, L., Kjær, A., Bendix, P. M., Oddershede, L. B. Platinum nanoparticles: a non-toxic, effective and thermally stable alternative plasmonic material for cancer therapy and bioengineering. Nanoscale. 10 (19), 9097-9107 (2018).
  59. ThermoFisher Scientific Attofluor Cell Chamber for microscopy. , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A7816 (2023).
  60. Kreibig, U., Vollmer, M. Theoretical considerations. In: Optical Properties of Metal Clusters. 25, Springer, Berlin, Heidelberg. (1995).
  61. Mie, G. Beiträge zur Optik trüber Medien, speziell kolloidaler Metallösungen. Annalen der Physik. 330 (3), 377-445 (1908).
  62. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  63. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  64. Klenow, M. B., Heitmann, A. S. B., Nylandsted, J., Simonsen, A. C. Timescale of hole closure during plasma membrane repair estimated by calcium imaging and numerical modeling. Scientific Reports. 11, 4226 (2021).
  65. Li, T., Wu, X., Liu, F., Li, N. Analytical methods based on the light-scattering of plasmonic nanoparticles at the single particle level with dark-field microscopy imaging. Analyst. 142 (2), 248-256 (2017).
  66. Gibbs-Flournoy, E. A., Bromberg, P. A., Hofer, T. P. J., Samet, J. M., Zucker, R. M. Darkfield-Confocal Microscopy detection of nanoscale particle internalization by human lung cells. Particle and Fibre Toxicology. 8 (1), 2 (2011).
  67. Taylor, R. W., Sandoghdar, V. Interferometric scattering microscopy: Seeing single nanoparticles and molecules via Rayleigh scattering. Nano Letters. 19 (8), 4827-4835 (2019).
  68. Wu, Y., Ali, M. R. K., Chen, K., Fang, N., El-Sayed, M. A. Gold nanoparticles in biological optical imaging. Nano Today. 24, 120-140 (2019).
  69. Klingberg, H., Oddershede, L. B., Loeschner, K., Larsen, E. H., Loft, S., Møller, P. Uptake of gold nanoparticles in primary human endothelial cells. Toxicology Research. 4 (3), 566-666 (2015).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 203 biofysikk plasmamembran reparasjon optisk pinsett vedlegg gigantiske unilamellære vesikler termoplasmonikk membranlekkasje
En termoplasmonisk tilnærming for å undersøke plasmamembranreparasjon i levende celler og modellmembraner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Danielsen, H. M. D., Arastoo, M. R., … More

Danielsen, H. M. D., Arastoo, M. R., Moreno-Pescador, G., Bendix, P. M. A Thermoplasmonic Approach for Investigating Plasma Membrane Repair in Living Cells and Model Membranes. J. Vis. Exp. (203), e65776, doi:10.3791/65776 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter