Summary
Этот протокол описывает индивидуальную флуоресцентную мечение на основе антител и инъекцию в ранние эмбрионы дрозофилы , чтобы обеспечить живую визуализацию белков с низкой распространенностью или посттрансляционных модификаций, которые трудно обнаружить с помощью традиционных подходов GFP/mCherry-tag.
Abstract
Визуализация белков в живых клетках с помощью GFP (Green Fluorescent Protein) и других флуоресцентных меток значительно улучшила понимание локализации, динамики и функции белков. По сравнению с иммунофлуоресценцией, визуализация в реальном времени более точно отражает локализацию белка без потенциальных артефактов, возникающих в результате фиксации тканей. Важно отметить, что визуализация в реальном времени позволяет количественно и во времени охарактеризовать уровни и локализацию белков, что имеет решающее значение для понимания динамических биологических процессов, таких как движение или деление клеток. Тем не менее, основным ограничением флуоресцентных подходов к мечению является необходимость достаточно высоких уровней экспрессии белка для достижения успешной визуализации. Следовательно, многие эндогенно меченные флуоресцентные белки с относительно низким уровнем экспрессии не могут быть обнаружены. С другой стороны, эктопическая экспрессия с использованием вирусных промоторов иногда может привести к неправильной локализации белка или функциональным изменениям в физиологическом контексте. Для устранения этих ограничений представлен подход, который использует высокочувствительное антитело-опосредованное обнаружение белка у живых эмбрионов, по сути, выполняя иммунофлуоресценцию без необходимости фиксации тканей. В качестве доказательства принципа, эндогенный рецептор Notch, помеченный GFP, который едва обнаруживается в живых эмбрионах, может быть успешно визуализирован после инъекции антител. Кроме того, этот подход был адаптирован для визуализации посттрансляционных модификаций (ПТМ) у живых эмбрионов, что позволило обнаружить временные изменения в паттернах фосфорилирования тирозина во время раннего эмбриогенеза и выявить новую субпопуляцию фосфотирозина (p-Tyr) под апикальными мембранами. Этот подход может быть модифицирован для размещения других белково-специфических, меткоспецифических или PTM-специфических антител и должен быть совместим с другими поддающимися инъекциям модельными организмами или клеточными линиями. Этот протокол открывает новые возможности для визуализации в реальном времени белков с низкой распространенностью или PTM, которые ранее было сложно обнаружить с помощью традиционных методов флуоресцентного мечения.
Introduction
Иммунофлуоресценция является краеугольным камнем современной клеточной биологии, первоначально разработанным Альбертом Кунсом, который позволяет обнаруживать молекулы в их собственных клеточных компартментах и характеризовать молекулярный состав субклеточных органелл илимеханизмов. В сочетании с генетическими манипуляциями иммунофлуоресценция помогает установить общепринятую концепцию о том, что локализация белка имеет важное значение дляего функционирования. Помимо специфических первичных антител и ярких флуоресцентных красителей, успех этого метода основан на предварительном процессе, называемом фиксацией и пермеабилизацией, который сохраняет клеточную морфологию, иммобилизует антигены и увеличивает доступ антител во внутриклеточные компартменты. Процесс фиксации и пермеабилизации неизбежно убьет клетки и завершит все биологическиепроцессы. Таким образом, иммунофлуоресценция дает только моментальные снимки жизненного пути белков. Однако многие биологические процессы, такие как миграция и деление клеток, являются динамическими по своей природе, что требует исследования поведения белков в пространственно-временном разрешении.
Для изучения динамики белков в живых организмах были разработаны методы визуализации в реальном времени, основанные на генетически кодируемых флуоресцентных белках, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP)6 и высокоскоростные конфокальные микроскопы. Вкратце, интересующий нас белок может быть генетически модифицирован для слияния с GFP7, а затем эктопически экспрессирован из вирусных или дрожжевых промоторов, таких как цитомегаловирус (ЦМВ)8 или восходящая последовательность активации (UAS)9. Поскольку GFP является автофлуоресцентным по своей природе, для выявления локализации белков-мишеней не требуется никаких флуорофорных антител, что позволяет избежать необходимости предварительных процессов фиксации или пермеабилизации. За последние два десятилетия были разработаны флуоресцентные метки, охватывающие весь спектр длинволн10, что позволяет получать многоцветную живую визуализацию нескольких белков-мишеней одновременно. Однако, по сравнению с химически модифицированными флуоресцентными красителями, такими как AlexaFluor или ATTO, автофлуоресценция этих генетически кодируемых флуоресцентных белков относительно слаба и нестабильна при экспрессии от эндогенных промоторов, особенно во время визуализации в реальном времени в более длительныхвременных масштабах. Хотя этот недостаток может быть смягчен чрезмерной экспрессией флуоресцентно меченных белков-мишеней, многие из них с ферментативной активностью, такой как киназы и фосфатазы, серьезно нарушают нормальные биологические процессы, если не экспрессируются на физиологическом уровне.
Этот протокол представляет собой метод, который позволяет подсвечивать мишень на основе фотостабильных антител в режиме реального времени, по сути, обеспечивая иммунофлуоресценцию без процесса фиксации или пермеабилизации (рис. 1). С помощью простой первичной аминовой реакции11 на основе NHS можно конъюгировать флуоресцентные красители, такие как AlexaFluor 488 или 594, практически с любым первичным антителом или GFP/HA/Myc nanobody12. Используя особенность развития, заключающуюся в том, что все эмбриональные клетки дрозофилы имеют общую цитоплазму во время13-й стадии синцития, можно добиться связывания антигена и освещения целых эмбрионов после инъекции антител, конъюгированных с красителем. С расширением библиотек эндогенно меченых белков, доступных в дрозофиле и других модельных системах14, этот метод потенциально может расширить применение этих библиотек, выявляя динамику флуоресцентно меченных белков с низким содержанием и других нефлуоресцентно меченных белков (HA/Myc-меченых) в живых тканях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями и одобрением Школы наук о жизни Университета SUSTech. Используемый микроорганизм - Drosophila melanogaster, а генотипы - Notch-Knockin-GFP (хромосома X) и Sqh-sqh-GFP (хромосома II), любезно предоставленные лабораториями доктора Франсуа Швайсгута (Институт Пастера) и доктора Дженнифер Заллен (Институт Слоуна-Кеттеринга) соответственно. Несмотря на то, что этот протокол в основном сосредоточен на аспектах мечения антител и визуализации в реальном времени, более подробное описание сбора и инъекции эмбрионов дрозофилы см. в опубликованных отчетах 15,16.
1. Флуоресцентное мечение антител
- Предпочтительно использовать моноклональные антитела или нанотела для интересующего белка. Приготовьте исходную концентрацию антител на уровне 1 мг/мл или выше.
ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании в качестве примера используется GFP nanobody (см. Таблицу материалов). Коммерчески доступный GFP nanobody упакован в концентрацию 1,0 мг/мл и объем 250 мкл. Кроме того, используется коммерчески доступный набор для маркировки антител (см. Таблицу материалов), который конъюгирует Alexa Fluor 594 с первичными аминами белков посредством реакции11 сукцинимидилового эфира. Важно отметить, что этот процесс мечения существенно не влияет на концентрацию антител. - Приготовьте 1 М раствор бикарбоната натрия, повторно суспендировав компонент B (входит в комплект для маркировки антител) в 1 мл деионизированной воды.
- Отрегулируйте концентрацию антител до 1,0 мг/мл, затем добавьте 1/10объема ( 10 мкл для 100 мкл нанотела GFP) 1 М раствора бикарбоната натрия.
- Добавьте 110 мкл смеси антител (с шага 1.3) непосредственно в пробирку, содержащую краситель Alexa Fluor 594. Перемешать (не перемешивать) и выдержать на ротаторе в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Соберите очистительную колонку из комплекта сопряжения (см. Таблицу материалов). Приготовьте слой смолы объемом 1,5 мл (входит в комплект для маркировки антител) и центрифугируйте колонку при 1100 x g в течение 3 минут при комнатной температуре (RT), чтобы удалить лишнюю жидкость из смолы.
- Добавьте реакционную смесь (из шага 1.4) по каплям в верхнюю часть столбика смолы и центрифугируйте при 1100 x g в течение 5 минут при 4 °C, чтобы собрать меченое антитело. Собранное антитело должно иметь розовый цвет, а объем должен быть чуть меньше 100 мкл. Хранить в тюбиках, завернутых в фольгу или темного цвета, при температуре 4 °C.
2. Подготовка эмбрионов дрозофилы
- Поместите 200 только что вылупившихся взрослых дрозофил в пластиковую клетку цилиндрической формы (диаметр = 5 см, высота = 8 см) с соотношением самцов и самок 1:10. Загерметизируйте одну сторону пористой металлической сеткой для вентиляции, а другую — тарелкой из фруктового сока/дрожжевой пасты.
- Меняйте пластинку каждые 12 ч в течение трех дней до забора эмбрионов. Это позволяет синхронизировать яйцекладку дрозофилы и повышает эффективность сбора.
- В день инъекции смените клетку на тарелку с фруктовым соком с минимальным количеством дрожжевой пасты и собирайте эмбрионы при 25 °C в течение 1 ч. Если первый этап сбора не дает достаточного количества эмбрионов (<50 эмбрионов), выбросьте первую пластину и повторяйте этот шаг для второго раунда сбора до тех пор, пока в течение 1 часа не будет отложено более 100 эмбрионов.
- Выньте пластину из клетки, чтобы остановить яйцекладку, и инкубируйте при 25 °C еще 2 ч для получения эмбрионов возрастом 2-3 ч. Правильная стадия эмбрионов имеет решающее значение для успеха инъекции антител.
- Чтобы удалить яичную скорлупу эмбрионов, добавьте 2 мл 50% отбеливателя в пластину с фруктовым соком и осторожно вытесните эмбрионы из чашки с помощью кисти (Рисунок 2A-4). Часто эмбрионы будут откладываться прямо поверх дрожжевой пасты. В этом случае допустимо смазать дрожжевую пасту в раствор хлорной извести, чтобы собрать все эмбрионы.
- Инкубируйте плавающие эмбрионы в 50% отбеливателе в течение 2 минут и перемешивайте тарелку с фруктовым соком каждые 30 с, чтобы повысить эффективность удаления яичной скорлупы.
- Перенесите смесь эмбрионов и отбеливателя, вылив ее в ситечко из нейлоновых ячеек размером 70 мкм (Рисунок 2A-7). Тщательно промойте эмбрионы с помощью бутылки с водой, чтобы удалить остатки отбеливателя и дрожжевой пасты. Полностью высушите ситечко бумажными полотенцами, убедившись, что лишняя вода вокруг эмбрионов удалена.
3. Выравнивание и высыхание эмбрионов
- Приготовьте 4% агарозный гель размером 5 см х 5 см х 0,5 см (ширина, длина, высота) (рис. 2А-9) и дайте гелю остыть до комнатной температуры. Отрежьте агарозный блок размером 1 см x 3 см x 0,5 см (ширина, длина, высота) чистым лезвием бритвы и поместите блок на предметное стекло (рис. 2A-2). Осмотрите гелевый блок под эндоскопом, чтобы убедиться, что края срезаны прямо, а поверхность ровная и сухая.
- Перенесите эмбрионы из ситечка на гелевый блок с помощью кисти. Равномерно распределите эмбрионы по средней линии блока, аккуратно расчесывая их. В идеале кластеры эмбрионов разделяют на одиночные или дублеты, не соприкасаясь друг с другом.
- Подготовьте пинцет с двумя ножками, плотно приклеенными друг к другу, чтобы получился один тонкий кончик (Рисунок 2A-5). Под препарирующим эндоскопом возьмите пинцетом отдельные эмбрионы и поместите их вдоль длинного края гелевого блока. Выровняйте 20-30 эмбрионов, убедившись, что их передняя задняя ось параллельна краю (рис. 2C).
- Нанесите на пипетку 10 мкл гептанового клея (см. таблицу материалов) в центр покровного стекла размером 24 мм x 50 мм (Рисунок 2A-1) и распределите клей по прямоугольному участку размером 0,5 см x 3 см с помощью наконечника пипетки. Перед использованием дождитесь полного высыхания клея.
- Поместите предметное стекло с гелевым блоком на край стола эмбрионами наружу. Приподнимите покровное стекло с клеем с помощью пинцета с плоским кончиком (Рисунок 2A-6) и держите его неподвижно поверх эмбрионов так, чтобы клеевая сторона была обращена к эмбрионам под углом около 45 градусов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно прижмите покровное стекло к гелевому блоку, чтобы эмбрионы соприкасались с клеем, а затем быстро ослабьте давление и поднимите покровное стекло. Величина приложенного натяжения имеет решающее значение для того, чтобы эмбрионы могли быть стабильно прикреплены к клею, не прижимаясь слишком сильно и не разрываясь. - Налейте пипетку 10 мкл воды в центр нового предметного стекла и поместите покровное стекло с эмбрионами поверх него стороной эмбриона вверх (Рисунок 2B). Убедитесь, что вы используете воду вместо лака для ногтей или другого клея для крепления покровного стекла к предметному стеклу, так как эта сторона покровного стекла будет размещена непосредственно поверх конфокальной линзы для получения изображения в реальном времени.
- Высушите эмбрионы в сушильной камере (Рисунок 2А-3) (см. Таблицу материалов) в течение 10-15 мин до тех пор, пока вителлиновая мембрана не сморщится (Рисунок 2Е). Требуемое время может варьироваться в зависимости от влажности помещения и должно быть экспериментально проверено для каждого лабораторного условия.
- Пипетка 40 мкл галогеноуглеродного масла (смесь типа 27 и типа 700 в соотношении 1:1 по объему, см. таблицу материалов) на один конец полоски эмбриона. Наклоняйте предметное стекло до тех пор, пока галогеноуглеродное масло не покроет всю поверхность эмбрионов.
4. Инъекция антител и визуализация
- Подготовьте несколько стеклянных игл для инъекций с помощью съемника микропипетки (настройки параметров см. в таблице материалов ) и загрузите в каждую иглу 5 мкл раствора антител, меченного AlexaFluor (начиная с шага 1.6).
- Поместите защитное стекло размером 25 мм x 25 мм на предметное стекло. Наберите пипетку 40 мкл галогеноуглеродного масла и распределите ее по краю покровного стекла.
- Под эндоскопом для инъекций совместите кончик иглы с краем покровного стекла под маслом. Отрегулируйте давление воздуха для впрыска пиконасоса (см. Таблицу материалов) таким образом, чтобы один насос генерировал один пузырь, наполненный антителами. Диаметр пузырька должен быть ограничен 20-50 мкм (рис. 2F).
- Замените пустое предметное стекло на предметное скоб, содержащее эмбрионы под маслом. Выровняйте кончик инъекционной иглы перпендикулярно передне-задней оси эмбрионов (рис. 2D, G).
- Проверьте стадию эмбрионов, чтобы убедиться, что большинство из них инициировали целлюляризацию, но еще не начали гаструляцию (стадии 4 и 5), оставаясь в виде синцития (рис. 2F, G).
ПРИМЕЧАНИЕ: Отличительной чертой этой стадии является отсутствие каких-либо бороздок или складок и наличие желточного мешка овальной формы темного цвета, видимого в центре эмбриона. Морфологическая характеристика стадии эмбриона под действием масла основана на главе книги Фолькера Хартенштейна «Стадии эмбриогенеза дрозофилы»17. - Используйте манипулятор стадии X-Y, чтобы перемещать эмбрионы к игле до тех пор, пока кончик не достигнет центра желтка. Накачайте два-три раза, чтобы ввести антитела в желток. Об успешном впрыске свидетельствует быстрое исчезновение складки вителлиновой мембраны по мере того, как эмбрионы набирают объем из раствора антител (рис. 2G).
- Используйте манипулятор стадии X-Y, чтобы отодвинуть эмбрионы от иглы после инъекции и переместить их вниз к следующему эмбриону. Повторяйте шаг 6 до тех пор, пока не будут введены все эмбрионы на предметном стекле.
- Перенесите предметное стекло с введенными эмбрионами во влажную камеру (рис. 2A-8). Инкубируйте при температуре 25 °C до тех пор, пока не будет достигнута желаемая стадия развития эмбриона.
- Снимите покровное стекло размером 24 мм x 50 мм со предметного стекла и поместите его непосредственно в держатель предметного стекла микроскопа. Перед задачами будет стоять сторона, у которой нет эмбрионов. Определите местонахождение эмбрионов с помощью линзы с малым увеличением при ярком освещении и переключитесь на линзу с 40-кратным или 63-кратным увеличением для получения флуоресцентной визуализации в реальном времени с высоким разрешением.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы продемонстрировать преимущества метода введения антител по сравнению с флуоресцентной визуализацией или иммунофлуоресценцией на основе флуоресцентных меток, представлены два тематических исследования, характеризующих динамическую локализацию трансмембранного рецептора с низкой распространенностью, Notch, и тип посттрансляционной модификации, называемой тирозиновым фосфорилированием, у живых эмбрионов.
Сигнальная активность Notch играет важную роль в определении судьбы клеток в процессе эмбриогенеза и гомеостаза взрослого органа18,19. При активации его лигандами Delta/Jagged20 внутриклеточный домен трансмембранного рецептора Notch расщепляется и высвобождается в ядро21, инициируя последующие транскрипционные программы, управляющие изменениями судьбы клетки22. Статическая локализация Notch-рецептора хорошо характеризуется иммунофлуоресценцией в тканях, зафиксированных формальдегидом. Тем не менее, динамическая локализация Notch во время связывания лиганда или внутриклеточного процесса расщепления остается в значительной степенинеизвестной23 из-за отсутствия метода быстрой визуализации этого белка с относительно низкой численностью в реальном времени. В данном случае мы вводили конъюгированный GFP нано AlexaFluor эмбрионам, экспрессирующим GFP-меченый Notch из эндогенного локуса20. Без инъекции Notch-GFP едва обнаруживается в стандартных условиях визуализации в реальном времени, а флуоресцентный сигнал быстро обесцвечивается во время интервальной съемки. После инъекции соотношение сигнал/шум Notch-рецептора значительно улучшается, сравнимое с качеством сигнала иммунофлуоресценции (рис. 3А). Кроме того, инъекция антител позволяет определить временную характеристику локализации Notch с интервалом в 45 с без видимой потери интенсивности сигнала в течение 5-минутного окна визуализации (рис. 3B).
Фосфорилирование тирозина является основным типом посттрансляционной модификации белка, которая опосредует передачу сигнала во многих биологических путях24. Высокоспецифичные моноклональные антитела (такие как PY20 и 4G10) против фосфотирозина (p-Tyr) были разработаны для характеристики локализации и уровней общего фосфорилирования тирозина с использованием иммунофлуоресценции и вестерн-блоттинга25. Несмотря на то, что никакие флуоресцентные метки не могут отслеживать изменения фосфорилирования, ткани или клетки должны быть зафиксированы и окрашены или лизированы и промоканы в разные моменты времени, чтобы получить моментальные снимки статуса фосфорилирования с течением времени, чтобы изучить кинетику фосфорилирования тирозина при активации сигнала26 (например, лечение фактором роста). Временной интервал этого подхода составляет не менее нескольких минут и по своей сути неточен из-за переменного времени, необходимого для таких процедур, как фиксация или лизис клеток.
Представлены доказательства того, что метод введения антител позволяет непосредственно визуализировать статус фосфорилирования у живых эмбрионов, отслеживая локализацию и изменения интенсивности фосфорилирования тирозина через регулярные интервалы времени на уровне секунд. Конъюгированное AlexaFluor антитело PY20 вводили эмбрионам, экспрессирующим легкую цепь миозина, меченую GFP, и выполняли двухцветную визуализацию в реальном времени с интервалом 45 с. Как было показано ранее, фосфорилирование тирозина сильно обогащено в трехклеточных соединениях27, что также повторяется иммунофлуоресценцией (рис. 4А). Интересно, что визуализация в реальном времени также выявила новую, вторую популяцию сигнала p-Tyr под центром апикальной мембраны, которая не наблюдается при использовании иммунофлуоресценции (рис. 4B). С помощью двухцветной визуализации было обнаружено, что эта популяция сигнала p-Tyr находится в непосредственной близости от медиального миозина (рис. 4B, крупные планы), субпопуляции миозина28 , которая также выражена только в условиях живой визуализации, но едва обнаруживается с помощью иммунофлуоресценции. Кроме того, медиальная популяция p-Tyr демонстрирует аналогичные паттерны пульсирующей коалесценции и диссипации (рис. 4C), как ранее было показано для медиального миозина28. Идентичность и функции медиальной субпопуляции p-Tyr до сих пор неизвестны. Вместе эти результаты показывают, что метод введения антител может в значительной степени дополнить традиционные подходы к характеристике поведения белков с низкой распространенностью и выявить новые паттерны локализации, которые могли быть нарушены в процессе иммунофлуоресценции.
Рисунок 1: Рабочий процесс инъекции антител. Схематический рабочий процесс, иллюстрирующий этапы метода инъекции антител. Весь процесс, от забора эмбрионов до инъекции антител, обычно занимает около 4-5 часов. После инъекции антител эмбрионы могут быть инкубированы во влажной камере до желаемой стадии развития, прежде чем получить живую визуализацию. AEL, после яйцекладки; RT, комнатная температура; АТ, антитела. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Выравнивание эмбриона и инъекция. (A) Обзор предметов, необходимых перед инъекцией, включая покровное стекло, предметное стекло, коробку для сушки, кисть, пинцет, клеточный фильтр, камеру влажности и агарозный гель. (B) Выровненные эмбрионы, прикрепленные к гептановому клею в центре покровного стекла и помещенные поверх шариков для сушки. (C) Выравнивание передне-задней оси эмбрионов параллельно краю агарозного геля. (D) Общие сведения о настройке впрыска. (E) Сравнение морфологии эмбрионов до и после процесса десикации с акцентом на морщины вителлиновой мембраны после высыхания. (F) Размер пузырька впрыска после однократного нажатия пиконасоса. (G) Сравнение морфологии эмбрионов до и после инъекции антител, подчеркивающее исчезновение морщин на мембране после инъекции. (E-G) были сняты под объективом с 10-кратным увеличением с помощью светлопольной микроскопии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Живая визуализация Notch-рецептора у ранних эмбрионов. (A) Локализация эндогенного рецептора Notch, помеченного GFP, посредством иммунофлуоресценции (слева), прямая визуализация в реальном времени на основе автофлуоресценции GFP (в центре) и конъюгированная инъекция GFP nanobody с AlexaFluor 594 (справа). (B) Динамическая локализация Notch-GFP с интервалом в 45 с после введения антител. Все изображения были получены с передней частью эмбрионов влево и вентральной стороной вниз. Масштабные линейки = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Визуализация эмбриональных фосфотирозиновых паттернов в реальном времени. (A) Локализация фосфорилированного тирозина (p-Tyr) в фиксированных эмбрионах с помощью иммунофлуоресценции. (B) Локализация p-Tyr (пурпурного) в живых эмбрионах, экспрессирующих GFP-меченую миозиновую легкую цепь (зеленый). Белая пунктирная рамка показывает крупным планом медиальную популяцию фосфотирозина и миозина под апикальной мембраной. Масштабные линейки = 10 мкм. (C) Локализация p-Tyr и GFP-миозина, визуализированная каждые 45 с у живых эмбрионов. Белыми стрелками обозначена медиальная популяция p-Tyr и миозина. Все изображения были сделаны так, чтобы передняя часть эмбрионов была обращена влево, а брюшная сторона была обращена вниз. Масштабные линейки = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Данная методика представляет собой специализированный метод флуоресцентного мечения с помощью специальных антител и последующей инъекции эмбрионам дрозофилы на ранних стадиях. Этот метод облегчает визуализацию в режиме реального времени белков или посттрансляционных модификаций, которые существуют в небольших количествах и, как правило, трудно наблюдаются с помощью обычных методов мечения GFP/mCherry.
Следует проявлять осторожность при расширении этого метода для проведения количественных сравнений между эмбрионами дикого типа и эмбрионами-мутантами. В то время как концентрация первичных и вторичных антител может быть одинаковой в контрольной и экспериментальной группах при иммунофлуоресценции, количество введенных антител и эффективность мечения могут варьироваться в зависимости от эмбриона. Поэтому количественный анализ должен быть ограничен отслеживанием изменений интенсивности флуоресценции во времени или проведением корреляционного анализа с сигналами других каналов в том же эмбрионе при выполнении многоцветной визуализации в реальном времени. Например, анализ колокализации и корреляции может быть выполнен с использованием интенсивностей p-Tyr и миозина27, в то время как интенсивность p-Tyr не может быть напрямую сравнена между эмбрионами дикого типа и эмбрионами с нокдауном гена X, использующими метод инъекции антител.
Подобно другим подходам к изучению динамики белков на основе флуоресцентных меток, связывание антител потенциально может изменить активность, транспорт или локализацию белков-мишеней. Поэтому моноклональные антитела или нанотела предпочтительнее поликлональных антител для инъекций. Поскольку эпитопы моноклональных антител или нанотел хорошо определены, вопрос о том, изменяет ли блокирование этих эпитопов антителами активность белка, может быть смоделирован на основе альфа-складчатых структур12,25. С другой стороны, эпитопы поликлональных антител точно не разграничены, и их связывание потенциально может изменить локализацию или активность белка, если каталитические карманы или сигнальные пептиды белков-мишеней блокируются. Во-вторых, антитела могут распознавать неспецифические эпитопы, отличные от белков-мишеней, особенно с учетом того, что здесь, как в иммунофлуоресценции, нет этапов «вымывания», чтобы удалить низкоаффинные неспецифические связывания. Поэтому важно иметь контрольные группы, такие как инъекции антител в клетки, лишенные эпитопа, чтобы проверить, действительно ли наблюдаемый сигнал отражает белки-мишени или другие неспецифические эпитопы.
Инъекция антител ничем не отличается от инъекции миРНК или CRISPR гРНК с точки зрения экспериментальной установки. Поэтому большинство клеточных систем, которые поддаются инъекциям, должны быть совместимы с методом введения антител. У эмбрионов дрозофилы флуор-конъюгированные антитела Alexa стабильны во время развития, а флуоресцентные сигналы остаются обнаруживаемыми через несколько часов эмбриогенеза. Для других систем, таких как эмбрионы Xenopus или рыбок данио, концентрация и объем инъекций антител должны быть эмпирически проверены с помощью последовательных разведений для достижения идеальной эффективности мечения. Кроме того, альтернативные флуоресцентные красители, такие как ATTO10 , потенциально могут обеспечить лучшее соотношение сигнал/шум и растворимость в воде.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Дженнифер А. Заллен (Jennifer A. Zallen) за предоставление линии Sqh-GFP Drosophila и поддержку в первоначальной разработке этой методики, а также д-ра Франсуа Швайсгута (Francois Schweisguth) за предоставление линии Notch-GFP Drosophila . Эта работа была поддержана финансированием со стороны Национального фонда естественных наук Китая (32270809) Х.Х.Ю, щедрой финансовой и кадровой поддержкой со стороны Школы наук о жизни SUSTech и финансированием Y. Yan со стороны Шэньчжэньской комиссии по научно-техническим инновациям/JCYJ20200109140201722.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sangon Biotech | A620014 | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20185 | Purification column from step 1.6 is included in this kit |
| Biological Microscope | SOPTOP | EX20 | Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25 |
| Bleach | Clorox® | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5245 | |
| Cell Strainer | FALCON | 352350 | |
| Desiccation chamber | LOCK&LOCK | HSM8200 | 320ml |
| Dissecting Microscope | Mshot | MZ62 | Eyepiece lens: WF10X/22mm. |
| Double-sided Tape | Scotch | 665 | |
| Fine Super Tweezer | VETUS | ST-14 | |
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545F | |
| Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Forcep | VETUS | 33A-SA | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | H2198-1L | Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane |
| Dehydration reagent | TOKAI | 1-7315-01 | Fill to 90% volume of the dessication chamber |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV 830 | Eject: 20 psi; Range: 100ms; Duration: timed |
| PY20 | Santa Cruz | SC-508 | |
| Square petri dishes | Biosharp | BS-100-SD | |
| GFP nanobody | Chromotek | gt |
References
- Coons, A. H.
- Arthur, G., et al.
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H.
- Ragkousi, K., Gibson, M. C. Epithelial integrity and cell division: Concerted cell cycle control. Cell Cycle. 17 (4), 399-400 (2018).
- Herszterg, S., Leibfried, A., Bosveld, F., Martin, C., Bellaiche, Y. Interplay between the dividing cell and its neighbors regulates adherens junction formation during cytokinesis in epithelial tissue. Developmental Cell. 24 (3), 256-270 (2013).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, aequorea. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Boshart, M., et al. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell. 41 (2), 521-530 (1985).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2016).
- Berg, E. A., Fishman, J. B. Labeling antibodies using N -Hydroxysuccinimide (NHS)-fluorescein. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (3), (2019).
- Saerens, D., et al. Identification of a universal VHH framework to graft non-canonical antigen-binding loops of camel single-domain antibodies. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 597-607 (2005).
- Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Lye, C. M., Naylor, H. W., Sanson, B. Subcellular localisations of the CPTI collection of YFP-tagged proteins in Drosophila embryos. Development. 141 (20), 4006-4017 (2014).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 50, e2477 (2011).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 49, e2503 (2011).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 9-102 (1997).
- Ho, D. M., Artavanis-Tsakonas, S.
- Kopan, R., Ilagan,, Ma, X. G. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
- Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
- Struhl, G., Greenwald, I. Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila. Nature. 398 (6727), 522-525 (1999).
- Henrique, D., Schweisguth, F. Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space. Development. 146 (3), dev172148 (2019).
- Trylinski, M., Mazouni, K., Schweisguth, F. Intra-lineage fate decisions involve of notch receptors basal to the midbody in drosophila sensory organ precursor cells. Current Biology. 27 (15), 2239.e3-2247.e3 (2017).
- Hunter, T. Protein kinases and phosphatases: The Yin and Yang of protein phosphorylation and signaling. Cell. 80 (2), 225-236 (1995).
- Glenney, J. R., Zokas, L., Kamps, M. P.
- Hunter, T., Cooper, J. A. Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells. Cell. 24 (3), 741-752 (1981).
- Yu, H. H., Zallen, J. A. Abl and Canoe/Afadin mediate mechanotransduction at tricellular junctions. Science. 370 (6520), eaba5528 (2020).
- Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin–myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
