Summary
Burada, korneayı innerve eden duyu liflerine zarar vermek için üç farklı yöntem öneriyoruz. Bu yöntemler, farelerde akson rejenerasyonunun incelenmesini kolaylaştırır. Diğer hayvan modellerine uyarlanabilen bu üç yöntem, kornea innervasyon fizyolojisi ve rejenerasyonunun incelenmesi için idealdir.
Abstract
Kornea, gözü kaplayan şeffaf bir dokudur ve net görüş için çok önemlidir. Vücutta en çok innerve edilen dokudur. Bu innervasyon, göze duyu ve trofik fonksiyon sağlar ve kornea bütünlüğünün korunmasına katkıda bulunur. Bu innervasyonun patolojik bozulması nörotrofik keratit olarak adlandırılır. Bu, göz yaralanması, ameliyat veya hastalık ile tetiklenebilir. Bu çalışmada, klinikte genel olarak karşılaşılan üç tip vakayı özetleyecek şekilde innervasyona hasar vermek için üç farklı protokol öneriyoruz.
İlk yöntem, oftalmik bir çapak ile epitelin aşındırılmasından ibarettir. Bu, epitel tabakasının, serbest sinir uçlarının ve subbazal pleksusun klinikte yapılan fotorefraktif keratektomi ameliyatına benzer bir şekilde çıkarılmasını içerir. İkinci yöntem, epitelin bütünlüğünü koruyarak, biyopsi zımbası ile periferde kesitlere ayırarak innervasyonu hedefler. Bu yöntem, lameller keratoplastinin ilk adımlarına benzer ve innervasyonun dejenerasyonuna ve ardından merkezi korneadaki aksonların yeniden büyümesine yol açar. Son yöntem, floresan sinir liflerinin koterizasyon bölgesini spesifik olarak lokalize eden bir multifoton mikroskobu kullanarak transgenik bir fare modelinin innervasyonuna zarar verir. Bu yöntem, UV ışığına aşırı maruz kalma olan fotokeratit ile aynı hasarı verir.
Bu çalışmada kornea innervasyonunun fizyopatolojisini, özellikle aksonların dejenerasyonu ve rejenerasyonunu araştırmak için farklı seçenekler tanımlanmıştır. Rejenerasyonu teşvik etmek, epitel kusurları ve hatta korneanın delinmesi gibi komplikasyonlardan kaçınmak için çok önemlidir. Önerilen modeller, sinir rejenerasyonunu artıran ve hastalığın ilerlemesini sınırlayan yeni farmakolojik moleküllerin veya gen terapisinin test edilmesine yardımcı olabilir.
Introduction
Gözün saydam yüzeyi olan kornea, epitel, stroma ve endotel olmak üzere üç ayrı katmandan oluşur. Bu organ vücuttaki en yüksek innervasyon yoğunluğuna sahiptir ve esas olarak trigeminal ganglionun oftalmik dalından kaynaklanan duyusal liflerden (Aδ ve C tipleri) oluşur. Duyusal lifler, stromanın ortasında korneanın çevresine, yüzeyi kaplamak için dallanan büyük demetler şeklinde nüfuz eder. Daha sonra Bowmann'ın zarını delmek için çatallanırlar ve korneanın merkezinde bir girdap oluşumuyla kolayca tanınabilen subbazal pleksusu oluştururlar. Bu lifler epitelin dış yüzeyinde serbest sinir uçları olarak sonlanır. Termal, mekanik ve kimyasal uyaranları iletebilir ve epitel homeostazıiçin gerekli olan trofik faktörleri serbest bırakabilirler 1,2. Nörotrofik keratit (NK), kornea duyu innervasyonunu etkileyen dejeneratif bir hastalıktır. Bu nadir hastalık, korneanın daha düşük gözyaşı üretimi ve zayıf iyileşme özellikleri ile sonuçlanan kornea duyarlılığının azalması veya kaybından kaynaklanır3. NK, hastaların epitel kusurlarından muzdarip olduğu evre 1'den, stromal erime ve/veya kornea perforasyonunun meydana geldiği evre 3'ekadar iyi tanımlanmış üç aşamadan geçer 4.
Klinik olarak, bu hastalığın kökenleri çeşitli olabilir. Hastalar gözün fiziksel yaralanması, ameliyat veya diyabetgibi kronik hastalıklar nedeniyle kornea innervasyonunu kaybedebilir 5,6. Bugüne kadar, NK patogenez süreci tam olarak anlaşılamamıştır ve bu görmeyi tehdit eden durum için terapötik seçenekler çok sınırlıdır. Bu nedenle, bu liflerin rejenerasyonunun arkasındaki mekanizmaları daha iyi anlamak ve potansiyel olarak onları teşvik etmek için epitel kusurlarının özelliklerinin daha iyi anlaşılması gerekmektedir. Burada, farelerde NK'yi indükleyen birkaç kornea hasarı modeli öneriyoruz.
İlk model, korneanın epitel tabakasının oküler çapak ile aşınmasıdır. Bu model esas olarak kemirgenler ve balıklar gibi farklı hayvanlardaepitelin yenilenmesi bağlamında incelenmiştir 7,8,9 ve kornea iyileşmesini destekleyen molekülleri test etmekiçin 10,11. Fizyolojik olarak epitel hücrelerinin yarayı kapatması 2-3 gün sürer. Bununla birlikte, innervasyonun fizyolojik paterni, aşınmadan kurtulmak için dört haftadan fazla sürer12,13. Ameliyat sırasında oküler çapak, subbazal pleksus ve liflerin serbest sinir uçlarını içeren korneanın epitel tabakasını çıkarır. Bu prosedür, göz kırma kusurlarını düzeltmek için fotorefraktif keratektomi (PRK) olan hastalarla klinik olarak karşılaştırılabilir. Prosedür, kornea epitelinin çıkarılması ve ardından stromanın bir lazerle yeniden şekillendirilmesindenoluşur 14. Hastalar bu tür bir ameliyattan sonra kornea sinir yoğunluğunun 2 yıl boyunca azalması ve ameliyattan sonra 3 aydan bir yıla kadar hassasiyette azalma gibi çeşitli yan etkiler yaşayabilirler15. Ameliyatın kornea mikroçevresinin kırılganlığına neden olduğu göz önüne alındığında, bu model bu yan etkilerin araştırılmasına ve daha hızlı reinnervasyonu teşvik edecek terapötik yaklaşımların geliştirilmesine yardımcı olabilir, böylece söz konusu yan etkileri azaltabilir.
İkinci model, korneanın çevresindeki aksonların bir biyopsi zımbası ile kesilmesinden oluşur ve merkezi innervasyonun Wallerian dejenerasyonunu indükler 16. Klinik olarak, bu yöntem, cerrahın korneanın ön kalınlığının bir kısmını çıkarmak ve onu bir donör nakli ile değiştirmek için korneanın kısmi trefinasyonunu gerçekleştirdiği anterior lameller keratoplasti ile karşılaştırılabilir 17. Lameller keratoplastiyi takiben, hastalar kuru göz, kornea innervasyon kaybı ve greft reddi gibi bir dizi semptomdan muzdarip olabilir18. Kornea sinirleri üzerinde gerçekleştirilen bu aksotomi modeli, bir greftten sonra meydana gelen lif dejenerasyonu mekanizmaları ve ardından aksonların rejenerasyonu hakkında fikir verebilir.
Üçüncü yöntem ise kornea sinirlerine lazerle zarar verir. Anestezi uygulanmış hayvanların korneasında multifoton mikroskobu kullanılarak, reaktif oksijen türleri (ROS) oluşumu sonucunda optik alanda lokalize olan sinirlerin dejenerasyonu indüklenir, bu da DNA hasarına ve hücresel kavitasyonayol açar 19. Bu yöntem, ROS oluşumunu tetikleyen ve DNA hasarına yol açan doğal UV'ye (güneş yanığı) aşırı maruz kalmanın neden olduğu kornea fotohasarını özetler20. Kornea güneş yanığından muzdarip hastalar, epitel hücrelerinin bozulması kornea liflerinin ekstremitelerini tamamen mahrum bıraktığı için büyük acı yaşarlar.
Burada açıklanan üç yöntem, NK patogenez sürecinin ve akson rejenerasyonunun araştırılmasını sağlamak için tasarlanmıştır. Kolayca tekrarlanabilir ve hassastırlar. Ayrıca, hayvanların hızlı bir şekilde iyileşmesini ve kolay izlenmesini sağlarlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler Ulusal Hayvan Deney Kurulu tarafından onaylandı.
1. Hazırlıklar
- Anestezi için anestezik bir ketamin-ksilazin çözeltisi hazırlayın. 200 μL ketamin (100 mg/mL) ve 125 μL ksilazin (20 mg/mL) 2.175 mL steril% 0.9 NaCl içinde seyrelterek 80 mg / kg'da ketamin ve 10 mg / kg'da ksilazin enjekte edin.
- 1.400 mL steril %0.9 NaCl'ye 100 μL 0.3 mg/mL buprenorfin ekleyerek analjezik çözelti olarak 0.02 mg/mL buprenorfin çözeltisi hazırlayın.
- Floresan boyama solüsyonunu hazırlayın.
- 10 mg floresein tuzunu tartmak için ince bir ölçek kullanın ve% 0.1'lik bir floresein çözeltisi elde etmek için 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltin.
- Solüsyonu ışıktan koruyun ve 5 dakika çalkalayın. Çözeltiyi filtrelemek için 10 mL'lik bir şırınga ve 0.2 μm'lik bir şırınga filtresi kullanın.
NOT: Floresan solüsyon ışıktan korunmalıdır ve +4 °C'de 5 gün saklanabilir.
- Farenin hazırlanması
- Fareyi tartın ve anestezik solüsyonun 10 μL/g fare ağırlığının (MW) intraperitoneal enjeksiyonunu gerçekleştirerek anesteziyi indükleyin. Fare hareket etmeyi bıraktığında, ısıtılmış bir plakaya (37 °C) yerleştirin ve ayak parmaklarını sıkıştırarak tamamen uyuşturulduğunu doğrulayın.
- Ameliyat geçiren göze bir damla suni gözyaşı ve karşı göze bir damla oküler jel uygulayın.
- Fare çimdiklemeye yanıt vermediğinde, boyunda deri altına 0.1 mg/kg buprenorfin sağlamak için analjezi (0.02 mg/mL buprenorfin) 5 μL/g MW'ye enjekte edin.
2. Korneanın aşınması
- Floresan boyama solüsyonunu hazırlamak için adım 1.3'ü izleyin.
- Fareyi hazırlamak için adım 1.4'ü izleyin.
- Aşındırmayı yapmadan önce, oküler çapağı %70 EtOH'ye ve ardından temizlemek için PBS'ye batırın.
- Ameliyat olan göze kolayca erişmek için fareyi yan taraftaki ısıtılmış bir plakaya (37 °C) yerleştirin.
- Suni gözyaşını emmek için pamuklu çubuk kullanın ve kirpikleri göze dokunmadan fırçalayın.
- Oküler çapağı açın, farenin göz kapağını iki parmağınızla açın ve aynı anda çapağa sıkışmalarını önlemek için titreşimleri bloke edin.
- Göz bebeğini veya gözün merkezini lokalize edin ve oküler çapağı gözün yüzeyine uygulayın ve dairesel hareketler yapın. Yakından bakılarak çıkarılan epitelin yüzeyi gözlemlenebilir. Aksi takdirde, kornea üzerinde yaklaşık 20 dairesel hareket yapın.
- Fareyi karnına geri koyun ve oküler jelin kontralateral gözde hala mevcut olup olmadığını kontrol edin.
- Aşınmış göze bir damla floresan boyama solüsyonu uygulayın ve 20 saniye bekleyin. Damlayı göze dokunmadan bir mendille emdirin ve bir damla suni gözyaşı ile durulayın. Suni gözyaşı damlasını bir mendille emdirin ve mavi kobalt lamba ile gözü aydınlatın.
NOT: Aşınma dairesel bir şekle sahip olmalıdır. Bunu elde etmek için biraz eğitim gerektirir. - Aşınmış göze bir damla oküler jel uygulayın ve farenin ısıtılmış ped üzerinde uyanmasına izin verin. Fare kendi kendine hareket ederken, kafesine geri koyun.
- Takip eden 2 gün boyunca hayvanın refahını kontrol edin.
- Oküler çapak kullanımından sonra, çapağın başına sıkışmış epitel hücrelerini çıkarmak için yumuşak bir doku kullanın ve% 70 EtOH'ye ve ardından PBS'ye daldırın.
NOT: Epitel hücreleri yumuşak doku ile birlikte çıkarıldıktan sonra, çapak kafasına hiçbir doku parçasının sıkışmadığından emin olun.
3. Kornea sinirlerinin aksotomisi
- Fareyi hazırlamak için adım 1.4'ü izleyin.
- Ameliyat geçiren göze erişmek için fareyi yan taraftaki bir dürbün büyüteç altına yerleştirin. Gözün yatay olması için bir Petri kabının altını farenin başının altına koyun.
NOT: Aşağıdaki adımlar, dürbün büyüteçinden bakılarak gerçekleştirilecektir. - Suni gözyaşını pamuklu çubukla çıkarın ve kirpikleri göze dokunmadan çıkarın.
- Yörüngeden çıkarmak için hayvanın gözünün altına pürüzsüz kavisli pense yerleştirin. Penseyi, basınç uygulandıktan sonra gözün yörüngeye geri dönmemesi için yeterince kapattığınızdan emin olun, ancak optik sinir hasarını önlemek için aşırı değil.
- 2,5 mm'lik biyopsi punch'ını, punchın kornea yüzeyi ile tam temasını sağlamak için göze dikey olarak basınç olmadan uygulayın.
NOT: Zımba korneaya uygulandığında, deneyi yapan kişinin eli görüş alanını etkileyebilir. - Ardından, basınç uygulamaya başlayın ve zımbayı birkaç kez çevirin.
NOT: Basınca bağlı olarak büküm sayısı değişmekle birlikte genel olarak 5 civarındadır. Doğru baskıyı ve hareketi hissetmek için eğitim gerektirir. Çok fazla basınç uygulanırsa göz yırtılır. Bu durumda lezyondan sıvı çıktığı ve gözün yumuşadığı görülebilir. Hayvan kurban edilmelidir. - Biyopsi yumruğunu çıkarın. Biyopsi zımbasının uygulandığı korneada bir daire görünmelidir.
NOT: Sonraki adımlar dürbün büyüteç gerektirmez. - Kontralateral gözde hala oküler jel olup olmadığını kontrol edin ve aksotomlu göze biraz uygulayın.
- Farenin ısıtılmış bir ped (37 °C) üzerinde uyanmasına izin verin ve kendi kendine hareket ederken kafesine geri koyun.
- Takip eden 2 gün boyunca hayvanın refahını kontrol edin.
4. Kornea tam montaj işleme
- Numune toplama ve fiksasyon.
- Fareyi tartın ve anestezik solüsyonun 10 μL/g fare ağırlığının (MW) intraperitoneal enjeksiyonunu gerçekleştirerek anesteziyi indükleyin.
- Fare hareket etmeyi bıraktığında ve ayak parmağını sıkıştırarak refleksleri olmadığında, servikal çıkık yapın.
- İki parmağınızı kullanarak gözü yörüngeden çıkarın ve kavisli makas kullanarak optik siniri keserek gözü enüklee edin.
- Gözü PBS içeren 2 mL'lik plastik bir tüpe yerleştirin.
- PBS'yi %4 paraformaldehit ile değiştirerek ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) bir çalkalayıcı (30 rpm) üzerine yerleştirerek gözü sabitleyin.
- Bir çalkalayıcıda (30 rpm) RT'de PBS ile 10 dakika boyunca 3 kez durulayın.
- Korneanın diseksiyonu
- Bir Petri kabının içindeki bir parça parafilm üzerine bir damla PBS koyun.
- Gözü bu PBS damlasına yerleştirin.
- Petri kabını dürbün büyüteçlerinin altına yerleştirin.
- Mikrodiseksiyon makası ve forseps kullanarak korneayı inceleyin. Limbusu korumak için siliyer cismin üstünü kesin.
- Lensi, siliyer gövdeyi ve irisi ince forseps ile çıkarın.
- Korneayı tekrar 2 mL'lik plastik bir tüpe yerleştirin.
- İmmünofloresan protokolü
- Korneayı 2 mL %2.5 balık derisi jelatin, %5 keçi serumu ve %0.5 deterjan içinde PBS'de RT'de 1 saat boyunca bir çalkalayıcı (30 rpm) üzerinde inkübe edin.
- Korneayı 150 μL'lik bir çözelti içinde %2.5 balık derisi jelatini, %5 keçi serumu ve PBS'de %0.1 deterjan çözeltisi içinde inkübe edin 1/1000'de (anti βIII tübülin antikoru) seyreltilmiş primer antikoru içeren birincil antikoru içeren bir gece boyunca 4 °C'de bir çalkalayıcı (30 rpm).
- Bir çalkalayıcıda (30 rpm) RT'de PBS'de% 0,1 deterjanla 1 saat boyunca 3 kez durulayın.
- Korneayı, bir çalkalayıcı (30 rpm) üzerinde 4 ° C'de gece boyunca 1/500'de seyreltilmiş ikincil antikoru içeren adım 4.3.2'deki ile aynı çözeltide inkübe edin.
- Bir çalkalayıcıda (30 rpm) RT'de PBS ile 1 saat boyunca 3 kez durulayın.
- Korneayı bir çalkalayıcı (30 rpm) üzerinde RT'de 1/5000'de seyreltilmiş 150 μL DNA interkalatörü ile 10 dakika inkübe edin.
- PBS ile 5 dakika boyunca 2 kez durulayın.
- Korneanın montajı
- Korneayı, epitel slayta bakacak şekilde bir slayt üzerine yerleştirin ve merkeze ulaşmadan dört bölüm oluşturmak için bir neşter kullanın.
NOT: Çiçek şekli oluşturmak için bölümleri birbirine zıt yapın. - Kornea endotelini slayta bakacak şekilde yerleştirin ve bir doku kullanarak korneanın etrafındaki PBS'yi çıkarın.
NOT: PBS'yi korneanın altından çıkarmayın; Aksi takdirde hava kabarcıkları görünebilir. Eğer öyleyse, korneaya PBS ekleyin ve hava kabarcığını çıkarın. Ardından 4.3.2 adımından yeniden başlatın. - Dikdörtgen bir lamellerin dört köşesine model yapıştırması ekleyin.
NOT: Model macunu, kornea kalın bir doku olduğu için lamel yükseltir. - Kornea üzerine 50 μL'lik bir montaj ortamı bırakın ve kabarcık oluşumunu önlemek için lameli dikkatlice yukarıya yerleştirin.
- Lameli oje ile kapatın.
- Korneayı, epitel slayta bakacak şekilde bir slayt üzerine yerleştirin ve merkeze ulaşmadan dört bölüm oluşturmak için bir neşter kullanın.
- Görüntüleme
- Slaytı epifloresan mikroskop altına yerleştirin.
- Mozaiğin boyutunu ve görüntünün derinliğini tanımlayın ve alıma başlayın.
- Elde edilen görüntüye bir bulanıklaştırma ve evrişim giderme programı uygulayın.
NOT: Adım 4.6.3, satın alma yazılımında seçilen bir seçenektir (Büyük Hacimli Hesaplamalı Takas [LVCC])
5. Kornea sinirlerinin lokalize lazer ablasyonu
- Dik çoklu foton mikroskobunu ve optik parametrik osilatör ile birleştirilmiş lazeri açın. Mikroskobun ısıtılmış aşamasını (37 °C) etkinleştirin ve lazerleri, fare modeli için gerekli dalga boylarına karşılık gelen 850 nm ve 1100 nm'ye ayarlayın.
- Lazerlerin gücünü aynı anda yaklaşık 20 mW'a ayarlamak için bir güç ölçer kullanın.
- Fareyi hazırlamak ve her iki göze oküler jel uygulamak için adım 1.4'ü izleyin.
NOT: Bu protokol için kullanılan hayvan, kornea sinir liflerinde endojen bir florofor eksprese eden bir transgenik fare hattından (MAGIC-Marker transgenik fare21) olmalıdır. - Hayvanı bir baş tutucuya takın. İlgilenilen gözün tavana bakması için hayvanı 90° çevirin.
- Göz bölgesini temizlemek için hayvanın titreşimini bağlayın. Solunumun neden olduğu baş hareketini azaltmak için hayvanın vücudunu bağlayın.
- Oküler jelin üzerine gözün üzerine dairesel bir lamel yerleştirin. Lamel yatay olmalıdır. Lamelin doğru yerleştirilmesi için hayvanın kafasını hareket ettirmekten çekinmeyin.
- Lamel üzerine bir damla PBS ekleyin. Hayvanı mikroskop tablasına dikkatlice yerleştirin ve objektif taretini doğru mesafeye ayarlayın.
- Gözü lokalize etmek ve göz merceğinden innervasyonu yapmak için sulu 20x objektif ve epifloresan kullanın.
- Lazerleri etkinleştirin ve aydınlatılması gereken derinliği tanımlayın.
- Maksimum tarama hızının %70-85'i kadar bir çekim hızında 1024 x 1024 (piksel) görüntü elde edin.
- Görüntü elde edildikten sonra, hayvanı mikroskoptan çıkarın ve lamel ve kayışları çıkarın. Hayvanı baş tutucusundan çıkarın, gerekirse daha fazla oküler jel ekleyin ve ısıtılmış bir tabakta bir kafeste uyanmasına izin verin.
NOT: Görüntülemeden 1 hafta sonra innervasyonun tahribatı gözlenebilir. Bu protokol, lazerlerin neden olduğu hasarı artırmak için birkaç hafta boyunca haftada bir kez tekrarlanabilir. - Hayvan kendi kendine hareket ederken, kafesi ahıra geri koyun ve sonraki 2 gün boyunca sağlığını kontrol edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışma, farelerde kornea innervasyonuna zarar vermek için çeşitli protokoller önermektedir. Epitel iyileşmesinin fizyopatolojisini araştırmak için benzer protokoller kullanılmış olsa da, kornea innervasyon rejenerasyonunu araştırmak için yeni yöntemler uyarlamayı ve geliştirmeyi seçtik. İnnervasyonu gözlemlemek için iki teknik kullandık. İlk olarak, bir pan-nöronal antikor (BIII tubulin) ve çekirdekleri bir interkalatör kullanarak sinir liflerini boyamak için bir immünofloresan tekniği kullandık. İkincisi, sinir liflerinde floresan proteinleri eksprese eden transgenik bir fare suşundan yararlandık. Kornealar epifloresan mikroskop kullanılarak görüntülendi.
İlk yöntemde kornea epitel tabakasını çıkarmak için 0,5 mm'lik pas halkası sökücülü oftalmik çapak kullanılmıştır (Şekil 1A). Bu çalışma, rejenerasyonunda yer alan hücresel ve moleküler bileşenleri anlamanın bir yolu olarak epitel içinde bulunan innervasyona verilen hasara odaklanmaktadır. Ameliyattan önce bazal epitel sağlamdı. Subbazal pleksustaki sinir lifleri, vorteks adı verilen tipik bir model oluşturdu (Şekil 1B). Bu teknikte kullanılan çapağın ucu, korneanın sadece ilk tabakasını çıkardı, ancak hem büyük lif demetlerinin bulunduğu stroma'yı hem de endotelyumu korudu. Bazal epitel ve subbazal pleksusun belirgin bir yırtılması olduğu için epitelin çapak tarafından çıkarılan kısmı kolayca görülebiliyordu (Şekil 1B). Keratositlerin çekirdekleri, stroma boyunca seyrek olarak düzenlendikleri için kolayca tanımlanabilir. İnnervasyonla ilgili olarak, sınır da açıktı, subbazal pleksusun yırtılması, stroma içindeki büyük lif demetlerinin görülmesine izin verdi. Epitelin iyileşmesi yaklaşık 3 gün sürerken, aşınmadan sonra innervasyonun yenilenmesi 4 haftadan fazla sürer. Şekil 1 , bazal epitelin pürüzsüz olduğu ameliyattan 1 hafta sonra epitelin yenilenmesini göstermektedir. Bununla birlikte, girdap, korneanın merkezinde yoktur, çünkü innervasyon henüz o noktaya geri dönmemiştir.
İkinci yöntem, korneanın çevresindeki sinirlerin çapakla fırçalanmasından ziyade 2,5 mm çapında bir biyopsi punchı ile kesit alınmasından ibarettir (Şekil 2A). Bu yöntem epiteli aşındırma kadar bozmaz. Ameliyat sonrasında, biyopsi punchının uygulandığı noktada, bazal epiteli bozan ince bir periferik halka görülebilir (Şekil 2B). Bununla birlikte, periferdeki sinirler kesildi ve aksonların Wallerian dejenerasyonunu tetikledi. Bu tip dejenerasyon, sinirlerin nöronların terminal ucundan hücre gövdesine ve bu durumda biyopsi zımbasının indüklediği bölüme doğru bozunmasından oluşur. Aksotominin derinliğine bağlı olarak, hasar ciddi olabilir. Burada, korneanın merkezinde epitelyumda tam bir innervasyon kaybına yol açan ağır dejenerasyonun meydana geldiğini görüyoruz (Şekil 2B). Epitel homeostazının sürdürülmesi için innervasyon gerekli olduğundan, epitel tabakasının parçalanması başlatılır ve ülser oluşturulur (Şekil 2B). Ülser oluşumu sadece ağır hasarlı kornealarda meydana geldi.
Son teknik, anestezi uygulanmış transgenik farelerin kornea sinirlerinin multifoton mikroskobu ile lokal olarak in vivo olarak yakılmasından oluşur (Şekil 3A). İlk görüntü, yanığın yapılacağı yerde elde edilir. Bu çalışmada, innervasyonu floresan proteinleri eksprese eden transgenik bir fare kullanılmıştır. Görüntü, vorteksin bulunduğu korneanın merkezinde (Şekil 3B), epitelin tepesinden orta stroma'ya kadar elde edildi. Girdap, ilk görüntü alımından 1 hafta sonra artık görünmez. Bunun yerine, bir grup bağışıklık hücresi, ilk edinimden sonra incelmiş olan stromadaki lif demetini tanımlayabileceğimiz aydınlatma bölgesine göç etmiştir (Şekil 3B).
Şekil 1: Oküler çapak ve abrazyon sonrası kornea innervasyonu örneği. (A) Aşındırmayı yapmak için 0,5 mm'lik pas halkası sökücüye sahip oftalmolojik bir çapak kullanıldı. (B) Diseke ve immün boyalı kornea örnekleri. Aşınma öncesi görüntüler, pürüzsüz bazal epiteli ve merkezdeki girdabı (beyaz ok ucu) göstermektedir. Aşınma sonrası görüntüler, çıkarılan subbazal pleksusun net bir şekilde sınırlandırıldığını gösterir (kırmızı ok uçları). Aşınmadan 1 hafta sonra (1WPAbr) elde edilen görüntüler, liflerin nerede yenilendiğini gösterir (turuncu ok ucu). İnnervasyon, anti-BIII tübülin antikoru (yeşil) ile boyanır. Çekirdekler bir DNA interkalatörü (mor) ile boyanır. Görüntüler epifloresan mikroskop ile elde edildi. Ölçek çubukları = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Biyopsi punch ve aksotomi sonrası kornea innervasyonu örneği. (A) Aksotomi indüklemek için göze 2,5 mm çapında steril bir biyopsi punch uygulanır. (B) Diseke ve immün boyalı kornea örnekleri. Aksotomi öncesi görüntüler, korneanın merkezinde (beyaz ok ucu) girdabın varlığını gösterir. Aksotomi sonrası görüntüler, epiteldeki yumruğun oluşturduğu halkayı (kırmızı ok uçları) gösterir. Aksotomiden (2WPAx) 2 hafta sonra elde edilen görüntüler ülser oluşumunu göstermektedir (turuncu ok ucu). İnnervasyon BIII tubulin (yeşil) ile boyanır. Çekirdekler bir interkalatör (mor) ile boyanır. Görüntüler epifloresan mikroskop ile elde edildi. Ölçek çubukları = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Lazerlerle kornea siniri koterizasyonu için kurulum ve bir örnek (A) Anestezi uygulanmış MAGIC-Marker transgenik fare21 , baş tutucu tarafından korunur ve gözü bifotonun 20x hedefine bakar. Farenin gövdesi, edinme sırasında nefes alma hareketini önlemek için sarılır. (B) Fotohasardan önce aynı anda 850 nm ve 1100 nm dalga boylarını kullanarak girdabın ilk ediniminin üç boyutlu (3D) görünümü ve girdabın aynı yerinde fotohasardan 1 hafta sonra (1WPPhDa). Lazerler, girdabın bulunduğu yerde bağışıklık hücrelerinin (ok ucu) göçünü indükledi. Ölçek çubukları = 80 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Teknik | Etkilenen yapı | Etki derecesi (+/-) | Çalışma türü | İyileşme dönemi |
| Aşınma | Epitel | ++ | Epitel ve innervasyon rejenerasyonu | Epitel <1 hafta İnnervasyon >2 ay |
| Innervasyon | ++ | |||
| Aksotomi (Aksotomi) | Epitel | +/- | İnnervasyon rejenerasyonu Nörotrofik keratit | İnnervasyon >2 ay NK >2 hafta |
| Stroma | +/- | |||
| Innervasyon | ++ | |||
| Sinir koterizasyonu | Epitel | + (yerel) | Lokal innervasyon rejenerasyonu Nörotrofik keratit | Koterizasyon sıklığına bağlı olarak |
| Stroma | ||||
| Innervasyon |
Tablo 1: Önerilen üç stratejinin karşılaştırılması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nörotrofik keratit, 10.000 kişiden 5'ini etkileyen nadir bir hastalık olarak kabul edilir. Bununla birlikte, kimyasal yanıklar gibi fiziksel bir yaralanma veya diyabet veya multipl skleroz gibi sendromlar nedeniyle NK'dan muzdarip kişiler bu istatistiklere dahil edilmemiştir3. Ayrıca, bu durum önemli ölçüde yetersiz teşhis edilmektedir22 ve hastalığın prevalansı hafife alınmaktadır. Hastaların görüşünü korumanın bir yolu olarak akson rejenerasyonunu teşvik edecek yeni tedavilere ve terapiye güçlü bir ihtiyaç vardır. Şu anda, NK'nın erken evrelerinden muzdarip hastalara sunulan tek tedavi, kornea sinir rejenerasyonunu destekleyen farmakolojik göz damlalarının 23,24,25 uygulanmasıdır. Ancak bunlar yalnızca belirli bir noktaya kadar etkilidir. Ülser, amniyotik membran nakli veya keratoplasti gibi korneada daha ciddi değişiklik vakalarında, 3,4 yarayı kapatmak ve enfeksiyonu önlemek için geçici bir çözüm sunar. Bununla birlikte, bu greftler sınırlı bir süre sonra değiştirilmelidir ve her ek prosedürde reddedilme riski artar.
Bu rapor, klinikte yaygın olarak karşılaşılan farklı NK formlarını özetleyen çeşitli modeller sunmaktadır (Tablo 1). Bunlar, kornea innervasyonu hakkındaki bilgimizi derinleştirmek ve mevcut tedavilere alternatifleri araştırmak için kullanılabilir. Aşınma modeli, aşınmış epitelin iyileşmesinden sonra meydana gelen innervasyonun yavaş büyümesini özetlediği için PRK cerrahisi ile ilişkilendirilebilir. Avantajına göre, bu teknik, oftalmik çapak ile doğru basınç uygulandığında ve düzenli bir aşınmış alan oluşturulduğunda nispeten kolay bir şekilde öğretilebilir ve çoğaltılabilir. Ayrıca, bu teknik her hastanın özel ihtiyaçlarına göre veya aşındırılan alanın büyüklüğü seçilerek kullanıcının ilgisine uyacak şekilde uyarlanabilir.
Aksotomi, geç evre NK26'dan muzdarip hastalar tarafından uygulanan lameller keratoplastiye benzer. Liflerin dejenerasyonunun (Wallerian dejenerasyonu) ve santral korneadaki aksonların rekolonizasyonunun araştırılmasını sağlar. Ameliyatı gerçekleştirmek için gereken malzeme nispeten basit olsa da, uygulayıcı uygun teknik, özellikle doğru basınç uygulaması ve biyopsi zımbası ile doğru dönüş sayısı konusunda eğitilmelidir. Keratoplasti bağlamında, insizyonun derinliği, bir trephine cihazı ve intraoperatif optik koherens tomografi kullanılarak kesin olarak belirlenir, bu teknikler murin modellerine uyarlanamaz17. Keratoplastiden bir diğer fark, sadece korneanın kesisini yaptığımız için burada açıklanan teknikte donör naklinin olmamasıdır. Bu model, innervasyonun tekrar büyümesi gereken sağlıklı bir epitelin varlığı nedeniyle ilgi çekicidir. Bu, epitelin innervasyonla çıkarıldığı aşınma modelinden ayırır.
Çoklu foton mikroskobu kullanan sinir koterizasyon tekniği, güneş yanığının neden olduğu hasarı taklit eder, ancak bunu korneanın lokalize bir bölgesinde yapar, böylece DNA hasarını ve ROS oluşumunu tetikler 19,20. Bu yöntemle, kornea üzerinde farklı bölgelerden gelen liflerin rejenerasyonunu incelemek ve hatta aynı bölgede koterizasyonu birkaç kez tekrarlamak, akson büyümesi ve immün hücre göçü üzerindeki etkinin değerlendirilmesini sağlamak mümkündür.
Bu üç protokol, rejeneratif mekanizmaların yanı sıra korneada bulunan farklı hücre tipleri ile innervasyon arasındaki etkileşimleri araştırarak aksonal yeniden büyümenin temel yönlerini inceleme imkanı sunar. Bu yöntemler ayrıca yeni farmakolojik moleküller24 veya gen terapisi27 uygulayarak akson rejenerasyonunu teşvik etmenin bir yolunu sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, transgenik fare hattı MAGIC-Markers'a erişim için Dr. Karine Loulier'e teşekkür ediyor. Yazarlar ayrıca, Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR-10-INBS-04, "Gelecek için yatırımlar") tarafından desteklenen Fransa-BioImaging ulusal altyapısının bir üyesi olan RAM-Neuro hayvan çekirdek tesisine ve görüntüleme tesisi MRI'ye teşekkür eder. Bu araştırma ATIP-Avenir programı, Inserm, Région Occitanie, Montpellier Üniversitesi, Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR-21-CE17-0061), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM Rejeneratif Tıp, REP202110014140) ve Groupama Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm seringe filter | CLEARLINE | 51733 | |
| 0.5 mm rust ring remover | Alger Equipment Company | BU-5S | |
| 2 mL plastic tubes | Eppendrof | 30120094 | |
| Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody | Abcam | ab18207 | |
| Antigenfix | Diapath | P0016 | |
| Artificial tear | Larmes artificielles Martinet | N/A | |
| Buprecare | Animalcare | N/A | |
| Cotton swab | Any provider | N/A | |
| Dissecting tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Fluorescein | Merck | 103887 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | |
| Goat serum | Merck | S26 | |
| Head Holder | Narishige | SGM 4 | |
| Heated plate | BIOSEB LAB instruments | BIO-HE002 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Imalgene 1000 | BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992 |
| LAS X software | Leica | N/A | Large volume computational clearing (LVCC) process |
| Laser Chameleon Ultra II | Coherent | N/A | |
| Laser power meter | Coherent | N/A | |
| Leica Thunder Imager Tissue microscope | Leica | N/A | |
| Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope | Zeiss | N/A | |
| Ocry-gel | TVM lab | N/A | |
| Parametric oscillator | Coherent | N/A | |
| Penlights with blue cobalt filtercap | Bernell | ALPEN | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 150318 | Axotomy protocol |
| Petridish | Thermo Scientific | 150288 | Cornea whole-mount processing |
| Rompun 2% | Elanco | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980 |
| Sterile biopsy punch 2.5 mm | LCH medical | LCH-PUK-25 | |
| Triton X-100 | VWR | 0694 | |
| Vectashield | EuroBioSciences | H-1000 | Mounting medium |
References
- Marfurt, C. F., Cox, J., Deek, S., Dvorscak, L.
- Al-Aqaba, M. A., Dhillon, V. K., Mohammed, I., Said, D. G., Dua, H. S. Corneal nerves in health and disease. Prog Retin Eye Res. 73, 100762 (2019).
- Dua, H. S., et al.
- Bonini, S., Rama, P., Olzi, D., Lambiase, A.
- Barrientez, B., et al. Corneal Injury: Clinical and molecular aspects. Exp Eye Res. 186, 107709 (2019).
- Willmann, D., Fu, L., Melanson, S. W. Corneal Injury. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2023).
- Kalha, S., et al. Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing. Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).
- Park, J. W., et al. Potential roles of nitrate and nitrite in nitric oxide metabolism in the eye. Sci Rep. 10 (1), 13166 (2020).
- Ikkala, K., Stratoulias, V., Michon, F. Unilateral corneal insult in Zebrafish results in a bilateral cell shape and identity modification, supporting wound closure. bioRxiv. , (2021).
- Yang, L., et al. Substance P promotes diabetic corneal epithelial wound healing through molecular mechanisms mediated via the Neurokinin-1 receptor. Diabetes. 63 (12), 4262-4274 (2014).
- Zhao, W., He, X., Liu, R., Ruan, Q. Accelerating corneal wound healing using exosome-mediated targeting of NF-κB c-Rel. Inflamm Regen. 43 (1), 6 (2023).
- Downie, L. E., et al. Recovery of the sub-basal nerve plexus and superficial nerve terminals after corneal epithelial injury in mice. Exp Eye Res. 171, 92-100 (2018).
- He, J., Pham, T. L., Kakazu, A. H., Bazan, H. E. P. Remodeling of substance P sensory nerves and transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8) cold receptors after corneal experimental surgery. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (7), 2449-2460 (2019).
- Bandeira, F., Yusoff, N. Z., Yam, G. H. -F., Mehta, J. S. Corneal reinnervation following refractive surgery treatments. Neural Regen Res. 14 (4), 557-565 (2019).
- Erie, J. C., McLaren, J. W., Hodge, D. O., Bourne, W. M. Recovery of corneal subbasal nerve density after PRK and LASIK. Am J Ophthalmol. 140 (6), 1059-1064.e1 (2005).
- Coleman, M. P., Freeman, M. R. Wallerian degeneration, WldS, and Nmnat. Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).
- Arenas, E., Esquenazi, S., Anwar, M., Terry, M.
- Niederer, R. L., Perumal, D., Sherwin, T., McGhee, C. N. J. Corneal innervation and cellular changes after corneal transplantation: An in vivo confocal microscopy study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (2), 621-626 (2007).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
- Volatier, T., Schumacher, B., Cursiefen, C., Notara, M. UV protection in the cornea: Failure and rescue. Biology. 11 (2), 278 (2022).
- Loulier, K., et al. Multiplex cell and lineage tracking with combinatorial labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
- Dana, R., et al. Expert consensus on the identification, diagnosis, and treatment of neurotrophic keratopathy. BMC Ophthalmol. 21 (1), 327 (2021).
- Matsumoto, Y., et al. Autologous serum application in the treatment of neurotrophic keratopathy. Ophthalmology. 111 (6), 1115-1120 (2004).
- Bonini, S., et al. Phase II randomized, double-masked, vehicle-controlled trial of recombinant human nerve growth factor for neurotrophic keratitis. Ophthalmology. 125 (9), 1332-1343 (2018).
- Aggarwal, S., Colon, C., Kheirkhah, A., Hamrah, P. Efficacy of autologous serum tears for treatment of neuropathic corneal pain. Ocul Surf. 17 (3), 532-539 (2019).
- Singh, N. P., Said, D. G., Dua, H. S.
- Gautier, B., et al. AAV2/9-mediated gene transfer into murine lacrimal gland leads to a long-term targeted tear film modification. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 1-16 (2022).
