Summary
Bir kompresyon testi kullanarak bir oküler lensin etkili elastik modülünü karakterize etmek için otomatik bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Oküler lensin biyomekanik özellikleri, değişken güçlü bir optik eleman olarak işlevi için gereklidir. Bu özellikler insan merceğinde yaşla birlikte önemli ölçüde değişir ve presbiyopi adı verilen yakın görme kaybına neden olur. Bununla birlikte, bu değişikliklerin mekanizmaları bilinmemektedir. Lens sıkıştırma, lensin biyomekanik sertliğini kalitatif anlamda değerlendirmek için nispeten basit bir yöntem sunar ve uygun analitik tekniklerle birleştirildiğinde biyomekanik özelliklerin ölçülmesine yardımcı olabilir. Bugüne kadar hem manuel hem de otomatik dahil olmak üzere çeşitli lens sıkıştırma testleri gerçekleştirilmiştir, ancak bu yöntemler ön koşullandırma, yükleme hızları ve ölçümler arasındaki süre gibi biyomekanik testlerin temel yönlerini tutarsız bir şekilde uygulamaktadır. Bu belgede, önceden programlanmış bir yükleme protokolü boyunca lensin kuvvetini, yer değiştirmesini ve şeklini yakalamak için motorlu bir tablanın bir kamera ile senkronize edildiği tam otomatik bir lens sıkıştırma testi açıklanmaktadır. Daha sonra bu verilerden karakteristik bir elastik modül hesaplanabilir. Burada domuz lensleri kullanılarak gösterilmiş olsa da, yaklaşım herhangi bir türün lenslerinin sıkıştırılması için uygundur.
Introduction
Lens, gözün içinde bulunan ve kırma gücünü değiştirerek farklı mesafelere odaklanmasını sağlayan saydam ve esnek bir organdır. Bu yetenek konaklama olarak bilinir. Siliyer kasın kasılıp gevşemesi nedeniyle kırma gücü değişir. Siliyer kas kasıldığında, lens kalınlaşır ve ileri doğru hareket ederek kırma gücünüarttırır 1,2. Kırılma gücündeki artış, lensin yakındaki nesnelere odaklanmasını sağlar. İnsanlar yaşlandıkça, lens sertleşir ve bu uyum yeteneği yavaş yavaş kaybolur; Bu durum presbiyopi olarak bilinir. Sertleşme mekanizması, en azından kısmen, lensin biyomekanik karakterizasyonu ile ilgili zorluklar nedeniyle bilinmemektedir.
Lens sertliğini ve biyomekanik özelliklerini tahmin etmek için çeşitli yöntemler kullanılmıştır. Bunlar arasında lens eğirme 3,4,5, akustik yöntemler6,7,8, Brillouin mikroskobu9, girinti10,11 ve sıkıştırma12,13 gibi optik yöntemler bulunur. Sıkıştırma, basit enstrümantasyon (örneğin, cam lameller14,15) veya tek bir motorlu aşama ile gerçekleştirilebildiği için en erişilebilir deneysel tekniktir. Lensin biyomekanik özelliklerinin bir kompresyon testinden nasıl kesin olarak tahmin edilebileceğinidaha önce göstermiştik 16. Bu süreç teknik olarak zordur ve bağıl sertlik ölçümleriyle ilgilenen lens araştırmacılarının kolayca erişemeyeceği özel yazılımlar gerektirir. Bu nedenle, bu çalışmada, lens boyutunu hesaba katarken lensin elastik modülünü tahmin etmek için erişilebilir yöntemlere odaklanıyoruz. Elastik modül, deforme olabilirliği ile ilgili içsel bir malzeme özelliğidir: yüksek bir elastik modül, daha sert bir malzemeye karşılık gelir.
Testin kendisi bir paralel plaka sıkıştırma testidir ve bu nedenle uygun ticari mekanik test sistemlerinde gerçekleştirilebilir. Burada bir motor, doğrusal kademe, hareket kontrolörü, yük hücresi ve amplifikatörden oluşan özel bir enstrüman inşa edildi. Bunlar, düzenli aralıklarla zaman, konum ve yükü de kaydeden özel bir yazılım kullanılarak kontrol edildi. Pig lensler uyum sağlamaz, ancak kolay erişilebilir ve ucuzdur17. Aşağıdaki yöntem, göz merceğini artımlı olarak sıkıştırmak ve elastik modülünü ölçmek için geliştirilmiştir. Bu yöntem kolayca çoğaltılabilir ve lens sertliğinin incelenmesinde faydalı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Domuz gözleri yerel bir mezbahadan elde edildi. Etik kurul onayı gerekmemiştir.
1. Lens diseksiyonu (Şekil 1)
- Çevredeki tüm dokuyu domuz gözlerinden ve fazla eti skleradan çıkarın, sadece optik sinir kalana kadar. Bu işlemi tamamlamak için kavisli forseps ve küçük diseksiyon makası kullanın. Diseksiyon sırasında gözü tutmak için siniri çapa olarak kullanın.
- Bir neşter kullanarak, limbusta kısa bir çevresel kesim yapın, ardından ekvatorda bir tane daha yapın.
NOT: Bu adım, lense ve kapsüle zarar vermemek için bu sırayla gerçekleştirilir. - Limbustaki kesiğe mikromakas sokun ve korneanın çevresini keserken korneayı ince künt uçlu forseps ile kaldırarak korneayı çıkarın.
- Künt uçlu forseps kullanarak kaldırarak irisi çıkarın ve mikro makasla kesin.
- Diseksiyon makasını ekvator kesimine sokun, ardından sklera ikiye bölünene kadar tüm ekvatorun etrafında çevresel olarak kesin.
- Kesim tamamlandıktan sonra, skleranın arka kısmını çıkarın. Lense zarar vermemek için vitreusu forseps ile nazikçe çıkarın ve minimum kalıntı bırakın. Gerekirse, posteriorun lensten ve ön segmentten uzaklaşmasına izin vermek için vitreus mizahını koronal olarak kesin.
- Mikromakas kullanarak sklerayı önden arkaya doğru meridyonel bir kesim yapın.
- Skleradan kesilen yeni meridyenden başlayarak, zonülleri lensten kesmek için mikro makas kullanın. Merceğin ağırlığını veya diseksiyon çanağının kenarını kullanarak, lensi ve sklerayı hafifçe ayırırken zonülleri hafifçe gerin, mikromakasın lens ile siliyer gövde arasında, zonüllerden ve lensin çevresini kesmesine izin verin. Bu, doğru yapılırsa lens kapsülüne zarar vermeden lensi izole edecektir.
- İstenirse, kapsülü ekvatorunda delmek için forseps kullanarak kapsülü çıkarın, ardından iki forseps kullanarak kapsülü soyun.
- Lensi fosfat tamponlu salin (PBS) içine yerleştirin. Mekanik testten önce lenste herhangi bir hasar olup olmadığını görsel olarak inceleyin.
2. Lens kapsülü olan/olmayan lens sıkıştırması (Şekil 2)
NOT: 2.1 ve 2.4 adımları dışındaki tüm adımlar bilgisayar kontrollüdür.
- 1 μm mertebesinde yer değiştirmeyi ölçme yeteneğine sahip 50 gram kuvvet kapasiteli bir yük hücresine sahip paralel bir plaka sıkıştırma aparatı elde edin veya inşa edin.
- Motorlu aşamayı programlayın ve aşağıda açıklanan yükleme rejimini gerçekleştirmek için hücreyi yükleyin (örneğin, Ek Dosya 1).
- 1 5/8 inç x 1 5/8 inçlik kare bir kutuyu PBS ile neredeyse doldurun ve sıkıştırma platformuna yerleştirin.
- Alt hareket sınırını ve mutlak boşluk yüksekliğini belirlemek için üst plakayı alt plaka ile temas edecek şekilde indirin.
- Üst plakayı ~15 mm kaldırın.
- Ekvator düzleminin yatay olmasına dikkat ederek lensi kutuda ortalayın.
- Üst plakayı lensin üst yüzeyine yakın, ancak temas etmeyecek şekilde indirin.
- 3 mN temas eşiği ile kuvvet geri bildirimi kullanarak üst plakayı lensle temas ettirmek için hareketi başlatın.
- Temas, kayıt süresi, üst plakanın alt plakaya göre konumu ve 500 Hz'de kuvvet belirlendikten sonra veri kaydına başlayın.
- Lensin başlangıç yüksekliğinin %2,5'i kadar üç kez, ardından üç kez %5'i, ardından %7,5'i üç kez %1/sn hızında sıkıştırıldığı bir ön koşullandırma yüklemesi uygulayın.
- Ön koşullandırmadan sonra üst plakanın konumunu 1 dakika sabit tutun.
- %1/sn hızında %15'lik bir sıkıştırma uygulayın ve ardından aynı oranda boşaltın.
- Lensin üst plakadan ayrıldığından emin olmak için üst plaka, yüksüz lens kalınlığının %2'si kadar ek bir mesafe alt plakadan uzaklaşana kadar boşaltma hareketine devam edin.
3. Lens modülünün tahmini
- Cihazın temas noktasındaki boşluğuna bağlı olarak merceğin kalınlığını tahmin edin. Alternatif olarak, testten önce çekilen bir fotoğrafın kalınlığını ölçmek için görüntü analizini kullanın.
- Paralel plakalar arasında bir kürenin sıkıştırılması için Hertz modelini kullanarak elastik modül E'yi hesaplayın (denklem [1]; Ek Dosya 2).
(1)
R, temas noktasındaki eğrilik yarıçapıdır (lens kalınlığının yarısına eşit olduğu varsayılır); F, yük hücresi tarafından bildirilen sıkıştırma kuvvetidir;
Poisson oranıdır (sıkıştırılamaz bir malzemeye karşılık gelen 0.5'e eşit olduğu varsayılır); ve u, üst aşamanın temas noktasından aşağı doğru yaklaşımıdır. Elastik modülün ve Poisson oranının, sırasıyla merceğin içsel sertliğini ve merceğin bağıl sıkıştırılabilirliğini gösteren malzeme özellikleri olduğuna dikkat edin.
NOT: Bu yöntem, lens kapsülünün herhangi bir rolünü ihmal eder, ancak lenslerin boyutunu yaklaşık olarak hesaba katarak türler arasında karşılaştırmaya izin verir.
(1)
Poisson oranıdır (sıkıştırılamaz bir malzemeye karşılık gelen 0.5'e eşit olduğu varsayılır); ve u, üst aşamanın temas noktasından aşağı doğru yaklaşımıdır. Elastik modülün ve Poisson oranının, sırasıyla merceğin içsel sertliğini ve merceğin bağıl sıkıştırılabilirliğini gösteren malzeme özellikleri olduğuna dikkat edin.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Altı domuz merceği, önce kapsül bozulmadan, daha sonra kapsülün dikkatlice çıkarılmasından sonra sıkıştırıldı. Kalınlık değerleri kapsüllü lensler için 7.65 ± 0.43 mm ve kapsüllü lensler için 6.69 ± 0.29 mm idi (ortalama ± standart sapma). Tipik bir yükleme geçmişi Şekil 3'te gösterilmektedir. Ortaya çıkan kuvvet-yer değiştirme eğrileri, Hertz modeli tarafından iyi bir şekilde yerleştirildi (yani, 1.5'in kuvvetine yükseltilen yer değiştirmeyle orantılı bir kuvvete sahiptiler; Şekil 4). Bu hem kapsüllü hem de kapsüllü lensler için geçerliydi.
Lensler önce boş kalınlıklarının %15'i kadar sağlam bir kapsülle, ardından kapsül çıkarıldıktan sonra sıkıştırıldı. Başlangıç kalınlığının %15'i kadar eksenel sıkıştırmanın lens dikişlerine zarar vermediği daha önce gösterilmiştir18. Dekapsülasyon, etkili elastik modülde anlamlı bir azalma ile sonuçlandı (n = 6; p = 0.0138; Şekil 5).
Şekil 1: Diseksiyon tekniği. (A) Göz dışı dokular çıkarılır. (B) Limbusta çevresel bir kesim yapılır. (C) Ekvatorda çevresel bir kesim yapılır. (D) Kornea çıkarılır. (E) İris çıkarılır. (F) Göz ekvatorda ikiye bölünür, daha sonra (G) vitreus çıkarılır ve (H) lens, siliyer cisim ve zonülleri içeren halka şeklinde bir halka kalır. (I) (J) zonüllere erişim sağlamak için sklera yoluyla meridyonel bir kesim yapılır, (K) bunlar kesilir (L) kapsüllenmiş lensi bırakır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Basma test aparatı. (A) Lens sıkıştırma aparatının şeması ve (B) fotoğrafı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kapsüllenmiş bir domuz merceği için uygulanan yükleme geçmişi. Üst: Yer değiştirme geçmişi. Alt: Kuvvet geçmişi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Hertz modeliyle donatılmış tipik kuvvet-yer değiştirme verileri. Solda: Kapsüllenmiş domuz merceği verileri. Sağ: Dekapsülasyondan sonra aynı lens için sıkıştırma verileri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Kapsüllenmiş ve kapsülü alınmış domuz lensi etkili elastik modülünün kutu ve bıyık grafiği. Kapsüllenmiş lenslerin etkili modülü, kapsüllü lenslerinkinden önemli ölçüde daha yüksekti (p = 0.013), bu da kapsülün varlığının lensin etkili sertliğini önemli ölçüde değiştirebileceğini gösteriyor. Veriler altı lens içindir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Lens sıkıştırma aparatını kontrol etmek için MATLAB uygulaması. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 2: Kuvvet sıkıştırma verilerinden elastik modülü tahmin etmek için MATLAB işlevi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lens sıkıştırma, lens sertliğini tahmin etmek için çok yönlü bir yöntemdir. Yukarıda açıklanan prosedürler, farklı türlerdeki ve farklı boyutlardaki lensler arasında karşılaştırmaya izin verir. Tüm deformasyonlar lens boyutuna göre normalleştirilir ve elastik modülün hesaplanması yaklaşık olarak lens boyutunu hesaba katar. Etkili modül, domuz merceği 4,7,11,19 için daha önce bildirilen modülden önemli ölçüde daha yüksektir, en azından kısmen eğrilik yarıçapından ziyade kalınlığın kullanılması nedeniyle: domuz merceğinin kutupsal eğrilik yarıçapı, kalınlığın yarısından önemli ölçüde daha büyüktür20.
Burada sunulan basit analizin (yani Hertz modelinin kullanımı) birkaç temel sınırlaması vardır. İlk olarak, lens kapsülünün varlığını hesaba katmaz. Kapsülün varlığının lensin16,21 biyomekanik özelliklerini önemli ölçüde değiştirebileceği gösterilmiştir. Bu nedenle, bu yöntem en iyi şekilde dekapsüle lenslere uygulanır. Bu, kapsülün önemli ölçüde farklı kalınlıklara veya biyomekanik özelliklere sahip olabileceği durumlarda türleri karşılaştırırken özellikle önemlidir. Bu yöntem aynı zamanda merceğin mekanik olarak homojen olduğunu varsayar; Biz ve diğerleri daha önce bunun genellikle domuz veya insan lensleriiçin geçerli olmadığını gösterdik 4,5,6,10,11,22. Bu nedenle, muhtemelen lens içindeki uzamsal olarak değişen modülün hacimsel ortalaması ile ilişkili olan etkili bir modül olarak hesaplanan elastik modül değerini dikkate almak en iyisidir. Hertz modeli, merceğin doğrusal olarak elastik olduğunu varsayar, oysa viskoelastik olduğu bilinmektedir; Bu nedenle, burada önerilen basit analiz, lens viskoelastisitesi hakkında bilgi sağlamaktan acizdir. Önceki çalışmalar, testten önce lens saklama yönteminin ve süresinin lens özelliklerini değiştirebileceğini de göstermiştir4; Bu nedenle tüm domuz lensleri, laboratuvara varışta diseksiyondan hemen sonra test edildi.
Kuvvet-yer değiştirme ölçümlerindeki fark, yük hücresi amplifikatöründen gelen gürültüden kaynaklanmaktadır: kapsülün çıkarılması, kuvvet ölçümlerini önemli ölçüde düşürür ve bu nedenle sinyal-gürültü oranı daha düşüktür. Hertz modelinin türetilmesinde kullanılan varsayımlar, kürenin homojen bir malzeme olduğunu; Bu nedenle, etkili elastik modül, kapsül mevcut olduğunda lensin ve kapsülünün deforme olabilirliğinin ortalamasını bir şekilde almaktadır. Bu, türler arası ve yaşlar arası karşılaştırmaları özellikle zorlaştırır, çünkü bir domuz merceği ~60 μm kalınlığında bir kapsüle sahipken, bir fare veya insan merceği 5-15 μm kalınlığında bir kapsüle sahiptir. Kapsülün elastik modülü, türlere ve yaşa göre de değişebilir, ancak bu bağımlılıklar bilinmemektedir. Bu nedenle, kapsül ile daha az gürültülü bir uyum elde etmek mümkün olsa da, karşılaştırma doğal olarak kapsülün varlığı ile karıştırılır - bu nedenle testi kapsül olmadan yapmanızı öneririz.
Son olarak, eğrilik yarıçapının merceğin kalınlığının yarısı olduğu varsayılarak etkili modül hesaplandı. Bu yalnızca küresel bir mercek için geçerlidir; Domuz merceği önemli ölçüde asferiktir ve bu nedenle etkili modül değerleri, bunun yerine eğrilik yarıçapı kullanıldığında olacağından önemli ölçüde daha yüksektir. Bu son varsayım, eğrilik yarıçapı ölçülerek aşılabilir, ancak bu, alt plaka ile temas nedeniyle her zaman düz olan alt yüzey için karmaşık olabilir. Murin lensler gibi daha küresel lensler için de daha az önemlidir. Daha da iyisi, merceğin16 mekanik özelliklerini belirlemek için ters sonlu elemanlar analizinin kullanılmasıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi R01 EY035278 (MR) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Medium Point General Purpose Forceps | Fisherbrand | 16-100-110 | |
| Galil COM Libraries | Galil Motion Control | ||
| High Precision Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-164 | |
| Linear Stage | McMaster-Carr | 6734K4 0.125" | |
| Load Cell | FUTEK | LSB200-FSH03869 | |
| Load Cell Amplifier | FUTEK | IAA300-FSH03931 | |
| MATLAB | The Mathworks, Inc. | ||
| Microprobe | Surgical Design | 22-079-740 | |
| Miniature Self Opening Precision Scissors | Excelta | 63042-004 | |
| Motion Controller | Galil Motion Control | DMC-31012 | |
| Motor | Galil Motion Control | BLM-N23-50-1000-B | |
| Straight Hemastats | Fine Science | NC9247203 | stainless steel, 14cm |
References
- Gullstrand, A. Helmholtz's treatise on physiological optics. translated edn. The Optical Society of America. , Rochester, N.Y. (1924).
- Helmholtz, H. Uber die akkommodation des auges. Arch Ophthalmol. 1, 1-74 (1855).
- Burd, H. J., Wilde, G. S., Judge, S. J. An improved spinning lens test to determine the stiffness of the human lens. Exp Eye Res. 92 (1), 28-39 (2011).
- Reilly, M. A., Martius, P., Kumar, S., Burd, H. J., Stachs, O. The mechanical response of the porcine lens to a spinning test. Z Med Phys. 26 (2), 127-135 (2016).
- Fisher, R. F. The elastic constants of the human lens. J Physiol. 212 (1), 147-180 (1971).
- Erpelding, T. N., Hollman, K. W., O'Donnell, M. Spatially mapping the elastic properties of the lens using bubble-based acoustic radiation force. IEEE Ultrasonics Symp. 1, 613-616 (2005).
- Erpelding, T. N., Hollman, K. W., O'Donnell, M. Mapping age-related elasticity changes in porcine lenses using bubble-based acoustic radiation force. Exp Eye Res. 84 (2), 332-341 (2007).
- Yoon, S., Aglyamov, S., Karpiouk, A., Emelianov, S. A high pulse repetition frequency ultrasound system for the ex vivo measurement of mechanical properties of crystalline lenses with laser-induced microbubbles interrogated by acoustic radiation force. Phys Med Biol. 57 (15), 4871-4884 (2012).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy. Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
- Weeber, H. A., Gabriele, E., Wolfgang, P.
- Reilly, M. A., Ravi, N. Microindentation of the young porcine ocular lens. J Biomech Eng. 131 (4), 044502 (2009).
- Gu, S., et al. Connexin 50 and AQP0 are essential in maintaining organization and integrity of lens fibers. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (12), 4021-4032 (2019).
- Sharma, P. K., Busscher, H. J., Terwee, T., Koopmans, S. A., van Kooten, T. G. A comparative study on the viscoelastic properties of human and animal lenses. Exp Eye Res. 93 (5), 681-688 (2011).
- Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses. J Vis Exp. (111), e53986 (2016).
- Baradia, H., Negin, N., Adrian, G.
- Reilly, M. A., Cleaver, A. Inverse elastographic method for analyzing the ocular lens compression test. J Innov Opt Health Sci. 10 (06), 1742009 (2017).
- Hahn, J., et al. Measurement of ex vivo porcine lens shape during simulated accommodation, before and after fs-laser treatment. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (9), 5332-5343 (2015).
- Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure. Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).
- Yoon, S., Aglyamov, S., Karpiouk, A., Emelianov, S. The mechanical properties of ex vivo bovine and porcine crystalline lenses: age-related changes and location-dependent variations. Ultrasound Med Biol. 39 (6), 1120-1127 (2013).
- Reilly, M. A., Hamilton, P., Gavin, P., Nathan, R. Comparison of the behavior of natural and refilled porcine lenses in a robotic lens stretcher. Exp Eye Res. 88 (3), 483-494 (2009).
- Mekonnen, T., et al. The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086 (2023).
- Wilde, G. S., Burd, H. J., Judge, S. J. Shear modulus data for the human lens determined from a spinning lens test. Exp Eye Res. 97 (1), 36-48 (2012).
