Summary
Questo protocollo descrive una procedura chirurgica minimamente invasiva per il bendaggio aortico ascendente nei suini.
Abstract
I modelli animali di insufficienza cardiaca di grandi dimensioni svolgono un ruolo essenziale nello sviluppo di nuovi interventi terapeutici a causa delle loro dimensioni e somiglianze fisiologiche con gli esseri umani. Gli sforzi sono stati dedicati alla creazione di un modello di insufficienza cardiaca indotta da sovraccarico di pressione e di bande aortiche ascendenti mentre sono ancora sovracoronariche e non una perfetta imitazione della stenosi aortica negli esseri umani, molto simile alla condizione umana.
Lo scopo di questo studio è quello di dimostrare un approccio minimamente invasivo per indurre un sovraccarico di pressione ventricolare sinistra mediante il posizionamento di una fascia aortica, calibrata con precisione con sensori di pressione ad alta fedeltà introdotti per via percutanea. Questo metodo rappresenta un perfezionamento della procedura chirurgica (3R), con conseguente gradiente transstenotico omogeneo e riduzione della variabilità intragruppo. Inoltre, consente un recupero rapido e senza incidenti degli animali, portando a tassi di mortalità minimi. Durante lo studio, gli animali sono stati seguiti fino a 2 mesi dopo l'intervento chirurgico, utilizzando l'ecocardiografia transtoracica e l'analisi del loop pressione-volume. Tuttavia, se lo si desidera, è possibile ottenere periodi di follow-up più lunghi. Questo modello animale di grandi dimensioni si rivela prezioso per testare nuovi farmaci, in particolare quelli che prendono di mira l'ipertrofia e le alterazioni strutturali e funzionali associate al sovraccarico di pressione ventricolare sinistra.
Introduction
L'insufficienza cardiaca (HF) è una malattia potenzialmente letale che colpisce milioni di persone in tutto il mondo, causando importanti impatti sociali ed economici1. Una delle sue eziologie significative è la malattia della valvola aortica o stenosi aortica (AS). La stenosi aortica è più diffusa in età avanzata e si classifica come la seconda lesione valvolare più comune negli Stati Uniti. Anche la mortalità correlata all'AS è aumentata in Europa, in particolare nei paesi che non hanno accesso allerecenti procedure interventistiche. Data la complessità dello scompenso cardiaco e la scarsità di innovazioni terapeutiche, vi è un urgente bisogno di modelli animali affidabili in grado di replicare la condizione umana e facilitare la sperimentazione dinuovi interventi. Mentre i modelli di roditori sono più numerosi dei modelli animali di grandi dimensioni, questi ultimi offrono diversi vantaggi grazie alle loro dimensioni e somiglianze fisiologiche, consentendo di testare le dosi di farmaci e i dispositivi medici destinati all'uso umano.
Lo scopo di questo metodo è quello di stabilire un modello riproducibile di bande aortiche ascendenti (AAB) applicabile alla maggior parte delle specie animali di grandi dimensioni utilizzate nella ricerca biomedica. In questo studio, la procedura è dimostrata nei suini utilizzando un approccio minimamente invasivo, aderendo ai principi delle 3R (sostituzione, riduzione e raffinamento4). Questo approccio garantisce la creazione di un gradiente di pressione accurato, con conseguente elevata riproducibilità (riducendo potenzialmente il numero di animali richiesti). Inoltre, la piccola incisione chirurgica (2-3 cm) riduce al minimo l'insulto chirurgico, migliorando il benessere dell'animale rispetto ad approcci più aggressivi come la sternotomia e le toracotomiepiù grandi 5 (affinamento). Inoltre, fornire una dimostrazione video del metodo, insieme a descrizioni dettagliate in letteratura, potrebbe potenzialmente ridurre la necessità di animali utilizzati esclusivamente per scopi di addestramento (sostituzione), diminuendo ulteriormente l'uso di animali. Questo modello può essere adattato a diversi ceppi/razze suine con tassi di crescita distinti e induce un sovraccarico pressorio prolungato, che porta a una significativa ipertrofia dopo 1 o 2 mesi di follow-up.
I metodi attuali impiegano la stenosi fissa6, ignorando la variabilità delle dimensioni degli animali, o calcolano il gradiente utilizzando letture di pressione riempite di fluido7, che sono meno affidabili dei sensori di pressione ad alta fedeltà e sono suscettibili di smorzamento del segnale8. Un altro approccio utilizza una singola misurazione della pressione distale alla stenosi5. Tuttavia, la calibrazione della stenosi attraverso segnali di pressione prossimali e distali simultanei utilizzando sensori di pressione ad alta fedeltà erogati per via percutanea rappresenta un'ottimizzazione sostanziale del protocollo, con conseguente miglioramento dell'omogeneità del gruppo. Dimostrando visivamente questo metodo, altri ricercatori dovrebbero essere in grado di replicarlo senza ostacoli significativi, aumentando la disponibilità di questo modello e promuovendo l'applicazione dei principi delle 3R.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti presso il laboratorio di Chirurgia Sperimentale dell'Università di Porto, Centro di Ricerca e Sviluppo Cardiovascolare (UnIC, Porto, Portogallo). Il comitato etico istituzionale per gli animali ha approvato lo studio in conformità con l'Autorità nazionale per la salute animale (Direcção-Geral de Alimentação e Veterinária, DGAV, Ref: 2021-07-30 011706 0421/000/000/2021). Gli sperimentatori erano autorizzati (autorizzazione equivalente a Laboratory Animal Sciences della FELASA) o erano chirurghi cardiotoracici o anestesisti. Gli animali utilizzati in questo lavoro erano maschi provenienti da un ambiente Landrace x Pietrain e sono stati acquistati da un allevatore autorizzato dalla DGAV (PTAH03). Il peso iniziale degli animali era di 20-25 kg, il che ha consentito un follow-up massimo di 2 mesi (70-80 kg, Figura 1). I periodi di inseguimento più lunghi sono compromessi a causa della significativa crescita degli animali, che le nostre infrastrutture non sono state in grado di gestire.
1. Anestesia e monitoraggio dei segni vitali
- Digiunare l'animale selezionato per una notte con acqua ad libitum.
- Pesare l'animale cosciente (lasciarlo camminare su una bilancia per animali) o utilizzare una stima basata sul peso di arrivo e sul tasso di crescita previsto.
- Preparare un cocktail di ketamina (15 mg/kg), midazolam (0,5 mg/kg) e azaperone (4 mg/kg) in una siringa Luer lock da 20 ml collegata a una prolunga (100 cm) seguita da un ago da 21 g (vedere Tabella dei materiali). Assicurarsi di avere abbastanza anestetico per tenere conto del volume morto del tubo di iniezione.
- Isolare il maiale in un ambiente calmo e sicuro (di solito una stanza di mantenimento vuota, se possibile) e anestetizzare l'animale attraverso un'iniezione intramuscolare nel muscolo del collo o della zampa posteriore (seguendo il protocollo istituzionale). Assicurati che l'animale si trovi in un luogo tranquillo e buio e assicurati che non possa ferirsi mentre perde decubito, il che dovrebbe richiedere 10-15 minuti.
NOTA: L'uso di una prolunga evita la necessità di trattenere l'animale. - Una volta che l'animale è in decubito, posizionare l'animale anestetizzato su una barella e trasportarlo in sala operatoria (misurare il peso dell'animale a questo punto se la pesatura cosciente non era un'opzione).
- Posizionare l'animale in un decubito laterale destro o sinistro a seconda dell'orecchio da incannulare. Pulisci l'orecchio più volte con clorexidina e alcol con movimenti circolari. Quindi, canulare la vena marginale dell'orecchio utilizzando un catetere endovenoso da 20 G e fissarla con un adesivo in tessuto non tessuto (vedere Tabella dei materiali). Collegare il catetere endovenoso a un collettore del rubinetto a 3 porte prelavato con soluzione fisiologica.
NOTA: In alternativa, rispetto a una linea di infusione endovenosa standard (ala gocciolante), una pompa per infusione consente una regolazione precisa della portata (2 mL/kg/h). - Posizionare un cerotto transdermico a base di fentanil (50 μg/h) (vedere Tabella dei materiali) nell'orecchio controlaterale.
- Posizionare l'animale su un tavolo operatorio radiotrasparente, in decubito dorsale, sopra un materasso riscaldato e fissarlo in posizione (cinghie che fissano le zampe al tavolo operatorio).
- Collegare una linea di perfusione del propofol al collettore del rubinetto a 3 porte. Il mantenimento dell'anestesia sarà fornito da propofol somministrato attraverso una siringa da 50 mL montata su una pompa di perfusione a siringa (vedi Tabella dei materiali) ad una velocità di 10-20 mg/kg/h.
- Somministrare un bolo di propofol (4 mg/kg) e fentanil (10 μg/kg) (vedere Tabella dei materiali) per indurre l'apnea e consentire l'intubazione.
NOTA: Da questo momento l'animale sarà in apnea e deve essere stabilita la ventilazione meccanica. Prima di procedere, assicurarsi che la fonte di ossigeno sia disponibile e che il ventilatore (vedere la tabella dei materiali) sia calibrato e pronto per la ventilazione. - Dopo aver assicurato la perdita di reattività, e con un utente che tiene aperta la bocca del maiale e contemporaneamente tira la lingua verso l'esterno, utilizzare un laringoscopio con una lama Miller numero 4 (vedi Tabella dei materiali) per identificare e mobilizzare delicatamente l'epiglottide, ottenendo una visione delle corde vocali. Introdurre direttamente il tubo endotracheale o far avanzare prima un bougie e il tubo endotracheale su di esso. Alcune pinze intestinali atraumatiche possono aiutare a mobilizzare il palato molle e ottenere l'accesso all'epiglottide.
- Gonfiare la cuffia del tubo endotracheale e collegarla alla macchina per anestesia/ventilatore. Regolare i parametri ventilatori a 8-10 ml/kg di volume corrente, frequenza respiratoria di 15-25 respirazioni al minuto e 5 cm H2O di PEEP (pressione positiva di fine espirazione). Regolare i parametri ventilatori per mantenere la CO2 di fine espirazione tra 35 e 45 mmHg.
- Posizionare il sensore SpO2 sulla lingua o sull'orecchio (dove si ottiene il segnale migliore), posizionare la sonda di temperatura esofagea e collegare gli elettrodi ECG (vedere la tabella dei materiali).
- Applicare un unguento lubrificante oftalmico sterile per prevenire lesioni corneali.
2. Incannulamento arterioso
- Dopo aver assicurato la corretta profondità dell'anestesia grazie all'assenza di riflesso palpebrale e alla frequenza cardiaca e alla pressione sanguigna costanti, pulire e disinfettare accuratamente la zona inguinale con clorexidina e alcol con movimenti circolari. Coprire l'animale con teli sterili fenestrati (vedi Tabella dei Materiali), con il foro posizionato nella zona dell'arteria femorale (preventivamente confermato dalla palpazione o dall'ecografia). Somministrare cefazolina (25 mg/kg) come profilassi antibiotica.
- Se la procedura prevede il recupero dell'animale (bendaggio aortico), utilizzare la tecnica asettica da questo punto in poi.
NOTA: Non è necessaria una tecnica asettica rigorosa se si tratta di una procedura terminale (analisi PV Loop). Tuttavia, lavorare in modo sterile è vantaggioso per evitare infezioni che potrebbero influire sulle misurazioni emodinamiche. - Identificare il sito di puntura e infiltrarsi nell'area con lidocaina sottocutanea all'1%.
- Identificare l'arteria femorale comune utilizzando la sonda vascolare (vedi Tabella dei materiali) e confermare la posizione del marcatore ecografico e la profondità corretta.
NOTA: La puntura dell'arteria femorale può essere eseguita utilizzando un asse corto, un asse lungo o una combinazione di entrambe le tecniche, utilizzando una modalità biplanare in alcuni sistemi. Tuttavia, il nostro team utilizza più frequentemente l'approccio dell'asse corto. - Preparare la guaina dell'introduttore (vedi Tabella dei materiali) lavando l'introduttore e il dilatatore con soluzione fisiologica eparinizzata prima di assemblarlo. Assicurarsi che il rubinetto a 3 vie nella porta laterale dell'introduttore sia in posizione off verso l'animale per evitare perdite di sangue durante la rimozione del dilatatore.
- Far avanzare un ago arterioso (preferibilmente ecogeno, vedere Tabella dei materiali) nell'arteria femorale monitorandone la traiettoria mediante ultrasuoni. Una volta raggiunto il lume arterioso, che può essere confermato dal sangue arterioso pulsante che esce dal mozzo dell'ago, far avanzare un filo guida con punta a J nell'arteria. La corretta introduzione del filo guida può essere confermata con gli ultrasuoni.
- Rimuovere l'ago, mantenere la pressione sul sito di puntura per evitare ulteriori emorragie e far avanzare il gruppo introduttore + dilatatore (misura 6 Fr, lunghezza 10 cm) nell'arteria. Rimuovere il dilatatore e confermare la posizione dell'introduttore aspirando dalla sua porta laterale e lavando in sequenza con soluzione fisiologica sterile.
- Collegare una linea di pressione arteriosa alla porta laterale dell'introduttore dell'arteria femorale per il monitoraggio della pressione sanguigna. Assicurarsi che l'altezza del trasduttore di pressione sia a livello degli atri destri e che la pressione atmosferica sia zero.
- Coprire l'introduttore con un telo sterile fino al cateterismo ventricolare sinistro.
3. Bandaggio aortico ascendente (preparazione)
- Regolare la posizione dell'animale su un leggero decubito laterale destro e sollevare la zampa anteriore sinistra.
- Individuare la posizione dell'aorta ascendente utilizzando il trasduttore a ultrasuoni cardiaco (vedere Tabella dei materiali) e contrassegnare il sito dell'incisione prima di disinfettare accuratamente il torace dell'animale con clorexidina e alcol con movimenti circolari.
- Copri l'animale con teli sterili.
- Somministrare un bolo di fentanil (10 μg/kg) per garantire un'analgesia sufficiente. Per confermare la profondità dell'anestesia e dell'analgesia, osservare la mancanza di riflessi palpebrali e l'assenza di variazioni della frequenza cardiaca o della pressione sanguigna dopo aver effettuato la prima incisione.
- Praticare un'incisione cutanea di 2-3 cm a livello del 3/4 dellospazio intercostale e sezionare gli strati fasciali e muscolari sottostanti fino a raggiungere lo spazio intercostale.
- Entra nel torace usando forbici smussate mentre l'animale è in espirazione forzata senza PEEP per evitare di danneggiare il polmone.
- Aumentare l'incisione per consentire il posizionamento delle lame del divaricatore fino a un massimo di 3 cm.
- Ritrarre le nervature e visualizzare le strutture sottostanti. Se l'incisione viene eseguita nel punto corretto, l'arteria polmonare dovrebbe essere prontamente visibile. L'aorta sarà posteriore ad esso.
- Utilizzando pinze e forbici per cardiochirurgia minimamente invasive, aprire il pericardio e ritrarre gli atri sinistri e qualsiasi tessuto polmonare che copra la vista dell'aorta utilizzando una garza sterile bagnata.
NOTA: Evitare di manipolare troppo gli atri sinistri, poiché ciò porterà alla fibrillazione atriale. Se ciò si verifica e non si risolve spontaneamente, applicare la cardioversione elettrica. - Separare con cautela l'aorta dall'arteria polmonare fino a raggiungere il seno pericardico trasverso. Questo sarà il canale attraverso il quale verrà fatto passare il materiale di fascettatura.
NOTA: Per il bendaggio dell'aorta ascendente, è possibile utilizzare diversi materiali, a seconda delle dimensioni dell'animale e del periodo di follow-up. Per gli animali con crescita limitata e/o un breve periodo di follow-up, è possibile utilizzare una fascetta in nylon (opzione più economica), mentre per gli animali a crescita più rapida e/o un periodo di follow-up più lungo, è possibile utilizzare un innesto di protesi vascolari fissato con clip in titanio (opzione più costosa), evitando l'internalizzazione della fascia (discussa in dettaglio nelle sezioni seguenti) (vedi Tabella dei materiali). - Opzione 1 (fascetta in nylon):
- Tagliare un segmento di ~10 cm di tubo di plastica sterile con un lume abbastanza piccolo da adattarsi perfettamente alla punta del nastro di nylon.
NOTA: Il tubo sterile e la fascetta in nylon vengono preventivamente sterilizzati mediante sterilizzazione con ossido di etilene o immersione in formaldeide per almeno 24 ore. - Utilizzare una pinza curva a 90° per far passare il tubo di plastica (che funge da guida atraumatica per la fascia di nylon) intorno all'aorta, attraverso il percorso precedentemente creato, dallo spazio tra l'aorta e l'arteria polmonare (prossimale) verso lo spazio tra l'aorta e l'atrio destro (distale). La palpazione con il dito può aiutare a guidare il forcipe attraverso il percorso corretto.
- Fare attenzione a non sforzare troppo l'arteria polmonare o gli atri destri, poiché ciò può portare all'instabilità emodinamica. Presta molta attenzione ai segni vitali durante questa fase per evitare periodi prolungati di ipotensione sistemica.
- Una volta che la guida di plastica è visibile sul lato distale, afferrarla con una pinza di tessuto e tirarla con cautela intorno all'aorta, portando con sé la fascia di nylon. Collegare le due estremità del cinturino in nylon senza restringere l'aorta.
- Tagliare un segmento di ~10 cm di tubo di plastica sterile con un lume abbastanza piccolo da adattarsi perfettamente alla punta del nastro di nylon.
- Opzione 2 (innesto in ePTFE)
- Tagliare un innesto sterile in ePTFE di ~10 cm di un innesto lungo 5 mm 40 cm.
- Utilizzare una pinza curva a 90° per maneggiare l'innesto e passarlo intorno all'aorta. Vedere i passaggi 3.11.2 e 3.11.3.
- Posizionare un marcatore radiopaco (vedere Tabella dei materiali) nell'area del bendaggio per facilitare il cateterismo dell'aorta.
- Coprire lo spazio intercostale con garze bagnate e teli sterili.
4. Cateterismo ventricolo sinistro/aorta
- Somministrare eparina (200 U.kg-1).
NOTA: Le procedure endovascolari sono associate al rischio di formazione di coaguli ed embolizzazione distale, mentre la somministrazione di eparina porterebbe a sanguinamento eccessivo durante l'accesso chirurgico all'aorta. Pertanto, il cateterismo ventricolare/aorta viene eseguito dopo l'accesso all'aorta e la messa in atto del bendaggio. - Collegare un adattatore per valvola emostatica doppia o una valvola per emostasi a forma di stella a un catetere guida MP1 da 6 Fr (vedere Tabella dei materiali) e sciacquare con soluzione fisiologica. Precaricare il catetere guida con un filo guida con punta a J da 260 cm da 0,035 pollici. Introdurre questo assemblaggio attraverso la guaina arteriosa femorale.
NOTA: Potrebbe esserci il rischio di sanguinamento quando si fanno avanzare due sensori di pressione ad alta fedeltà (HFPS) attraverso una valvola emostatica a taglio incrociato standard. Un approccio alternativo potrebbe essere l'utilizzo di due cateteri guida separati, ma ciò richiederebbe un secondo sito di accesso arterioso. Per affrontare sia il problema del sanguinamento che la necessità di ulteriori siti di accesso, si può optare per una valvola per emostasi a doppia porta o una valvola per emostasi a forma di stella. Queste alternative risolvono il problema dell'emorragia ed eliminano la necessità di punti di accesso aggiuntivi. Una volta che il catetere guida viene fatto avanzare attraverso la guaina arteriosa, è importante notare che la porta laterale della guaina non consente la misurazione della pressione sanguigna. Per misurare la pressione arteriosa, è invece necessario collegare la linea arteriosa alla porta laterale dell'adattatore della valvola emostatica del catetere guida. - Far avanzare il filo guida e guidare il catetere nell'aorta ascendente sotto guida fluoroscopica. Una volta identificata la valvola aortica, incrociarla con cautela con il filo guida e introdurre il catetere guida nel ventricolo sinistro. Se necessario, utilizzare il contrasto per facilitare il posizionamento anatomico. Controllare le tracce di pressione per confermare il posizionamento BT.
- Rimuovere il filo guida lasciando il catetere guida nel ventricolo sinistro. Lavare il catetere dopo l'aspirazione e assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria nel catetere.
- Far avanzare un HFPS già calibrato, attraverso una delle porte della doppia valvola di emostasi, nel ventricolo sinistro. È possibile posizionare un segno con una penna sterile sul corpo del catetere per sapere quando esce dalla punta del catetere guida. In alternativa, la conferma di un chiaro segnale di pressione ventricolare è un segno di uscita dal catetere guida (si osserva un'interferenza del segnale mentre l'HFPS si trova all'interno del catetere guida).
- Far avanzare un secondo HFPS attraverso l'altra porta della valvola a doppia emostasi e nel ventricolo sinistro.
- Riportare il catetere guida nell'aorta ascendente distalmente al marcatore radiopaco posizionato sul sito di bendaggio lasciando uno degli HFPS nel ventricolo sinistro. Confermare la posizione del catetere utilizzando le tracce di pressione.
NOTA: L'HFPS deve essere collegato al sistema di registrazione e posto in soluzione fisiologica sterile per almeno 30 minuti prima dell'uso per consentire l'equilibrio del sensore di pressione. Prima di introdurre l'HFPS nel catetere guida, assicurarsi di azzerare la pressione posizionando il sensore sulla superficie della soluzione fisiologica sterile. - Coprire il sito di accesso vascolare con un telo sterile e spostarsi sul torace per restringere l'aorta.
5. Bandaggio aortico ascendente (costrizione)
- Tirare leggermente la fascia di nylon (opzione 1) o l'innesto in ePTFE (opzione 2) per assicurarsi che l'HFPS sia posizionato correttamente: la pressione ventricolare sinistra dovrebbe aumentare, mentre la pressione aortica distale rispetto alla fascia (marcatore radiopaco) non dovrebbe aumentare.
- Se il posizionamento del catetere non è corretto, regolare la posizione dell'HFPS per assicurarsi che la pressione prossimale e distale verso il sito di costrizione sia chiaramente registrata.
- Opzione 1: chiudere la fascia di nylon fino a quando non è aderente all'aorta.
- Chiudere il cinturino in nylon un clic alla volta monitorando attentamente le pressioni. Dopo ogni clic, lasciare che le pressioni si stabilizzino.
- Chiudere gradualmente la fascia di nylon fino a raggiungere il gradiente di pressione desiderato. L'obiettivo è un gradiente di circa 100 mmHg, assicurando che le pressioni telediastoliche del ventricolo sinistro non superino i 25 mmHg.
NOTA: Se il gradiente raggiunto è di poco inferiore a 100 mmHg (cioè tra 90-95 mmHg), astenersi dal stringere ulteriormente il cinturino di nylon. È fondamentale non stringere eccessivamente in questa situazione. Tuttavia, se la fascia di nylon viene accidentalmente tesa eccessivamente durante la procedura o dopo la stabilizzazione, è possibile utilizzare delle frese per ossa (vedere la tabella dei materiali) per tagliare la fascia di nylon e quindi ripetere le procedure precedenti (passaggio 3.11 e passaggio 5.3) per regolare nuovamente e ottenere il gradiente di pressione appropriato. - Posizionare un pezzo di tubo di plastica sterile sull'estremità della fascia di nylon per evitare danni accidentali alle strutture circostanti.
- Opzione 2: approssimare le estremità dell'ePTFE e restringere la fascia utilizzando una pinza a 45°, monitorando le pressioni, per stimare la posizione relativa della costrizione.
- Posizionare un'emoclip in titanio sulla posizione della pinza (il bloccaggio delle due estremità dell'innesto in ePTFE lascerà un segno su di essa, che servirà a guidare la posizione dell'emoclip).
- Controllare il gradiente di pressione. Se il gradiente è ottimale, confermare la posizione precedente dell'emoclip posizionando un secondo emoclip immediatamente sopra il precedente (questo non aumenterà la costrizione ma eviterà qualsiasi slittamento distale del clip).
- Se la sfumatura non è sufficiente, posizionare una clip aggiuntiva sotto la clip precedente (restringendo ulteriormente l'aorta). Fallo fino a quando la sfumatura non è ottimale. Se la sfumatura è troppo grande, usa l'applicatore di clip per rimuovere la clip e posizionarne un'altra più distale.
- Tagliare le estremità dell'innesto in ePTFE per evitare di avere troppo materiale di innesto nel torace e suturare l'innesto sul lato prossimale dell'aorta utilizzando una sutura 5.0 (vedere la tabella dei materiali) per evitare il movimento distale dell'innesto.
- Attendere 15 minuti dopo aver posizionato la fascetta per stabilizzare le pressioni e determinare se il gradiente rimane ottimale o se si installeranno lo scompenso e il guasto acuto. Se l'ipotensione si verifica senza risoluzione spontanea, è molto probabile che il ventricolo sinistro sia scompensato ed è necessaria un'attenuazione del bendaggio.
- Chiudere il pericardio con una sutura 3-0 PDS II (vedi Tabella dei materiali).
- Posizionare un drenaggio toracico e collegarlo a un aspiratore chirurgico. Aumentare la PEEP a 10 cmH2O per iniziare a reclutare qualsiasi polmone che ha sofferto di atelettasia.
- Chiudere la parete toracica a strati utilizzando una sutura 3-0 PDS II.
- Chiudere l'ultimo punto muscolare rimuovendo il drenaggio toracico e con la ventilazione interrotta a fine espirazione con alta pressione (regolata manualmente a 20-30 cmH2O).
- Riprendere la normale ventilazione e chiudere la pelle utilizzando una sutura 3-0 PDS II con un pattern intradermico dopo aver lavato la ferita chirurgica con iodio-povidone.
- Rimuovere i Mikro-cath (vedere la tabella dei materiali) e controllare la pressione superficiale per tenere conto della deriva della pressione durante la procedura.
- Rimuovere il catetere guida.
- Rimuovere la guaina introduttrice e applicare la compressione manuale per chiudere l'arteriotomia. Applicare la compressione al sito di accesso per almeno 10 minuti. Valutare il sito per l'emostasi rimuovendo lentamente la pressione e confermando l'assenza di sanguinamento o formazione di ematomi.
- Posizionare un punto sul sito della puntura utilizzando una sutura riassorbibile, se necessario.
NOTA: Se necessario, in questo momento, un rapido ecocardiogramma transtoracico può aiutare a determinare se la funzione cardiaca è buona e consentire la stima del gradiente di pressione aortica. Sebbene non sia necessario (poiché il gradiente di pressione è stato misurato con sensori di pressione ad alta fedeltà), è possibile utilizzare un gradiente derivato dall'eco per confrontare il modello con i dati clinici. Si noti che a causa dell'intervento chirurgico, la qualità dell'immagine sarà compromessa. - Interrompere l'anestesia ed estubare l'animale una volta rilevata la ventilazione spontanea. Scollegare l'animale dal ventilatore e assicurarsi che il corretto flusso d'aria venga percepito attraverso il tubo endotracheale e che l'ossigenazione periferica non sia compromessa.
- Estubare e posizionare un Guedel se necessario.
- Rimuovere il catetere della vena periferica.
- Monitorare l'animale per almeno 15 minuti monitorando l'ECG/frequenza cardiaca e l'ossigenazione periferica.
- Se è stabile, portare l'animale in un recinto di recupero pulito con una temperatura ambiente elevata. Utilizzare un dispositivo portatile per i segni vitali (vedere la tabella dei materiali) per monitorare continuamente la frequenza cardiaca e la saturazione fino a quando l'animale non riprende conoscenza.
- Seguire gli animali per il periodo desiderato ed eseguire l'ecocardiografia transtoracica o l'analisi del loop pressione-volume per determinare la funzione cardiaca.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Durante lo sviluppo iniziale del modello, il tasso di mortalità era di circa il 30%, con animali che morivano per insufficienza cardiaca acuta dopo bendaggi e complicanze chirurgiche. Tuttavia, dopo che il modello è stato stabilito, le complicanze chirurgiche sono diventate meno comuni e il tasso di mortalità è sceso a circa il 15%. I due decessi che si sono verificati sono stati dovuti alla rottura dell'aorta durante la dissezione.
L'uso di sensori di pressione ad alta fedeltà consente di ottenere segnali di pressione di alta qualità (Figura 2), consentendo una calibrazione accurata e in tempo reale della stenosi. Ciò garantisce che tutti gli animali operati sperimentino un grado simile di sovraccarico di pressione ventricolare sinistra, riducendo la variabilità all'interno del gruppo. Inoltre, il catetere stesso ha un'asta da 2,3 F, che ha un impatto minimo sull'ostruzione del flusso rispetto ai cateteri più grandi riempiti di fluido. Dopo un investimento iniziale, i cateteri possono essere riutilizzati più volte e, se è necessaria la sterilizzazione, è possibile utilizzare l'ossido di etilene (di solito disponibile attraverso la collaborazione con i reparti chirurgici dell'ospedale).
Il gradiente transstenotico può essere calcolato in tempo reale dal software, che misura la differenza di pressione tra il ventricolo sinistro (pressione prossimale) e l'aorta distale (pressione distale). Pochi minuti di stabilizzazione tra una fase di costrizione e l'altra assicurano che il ventricolo sinistro abbia il tempo di adattarsi. Dopo aver determinato il grado di costrizione desiderato, è necessario applicare un periodo di stabilizzazione di 15 minuti per garantire che il grado di fasciatura rimanga stabile e che l'animale sia compensato (Figura 2A).
Questo approccio è superiore ad altre metodologie che non misurano il gradiente trans-stenotico in tempo reale e mancano sia dell'omogeneità di avere un gradiente simile tra tutti gli animali (92,3 ± 2,3 mmHg, media e errore standard della media, rispettivamente, per 7 animali operati) sia di uno stretto monitoraggio delle pressioni ventricolari sinistre. Inoltre, questo approccio evita le difficoltà associate all'esecuzione dell'ecocardiografia transtoracica nei suini, in particolare in alcune razze come il maiale panciuto vietnamita, che ha uno sterno più significativamente sporgente.
L'ecocardiografia transtoracica può confermare il bendaggio aortico sia immediatamente dopo l'intervento chirurgico che durante i periodi di follow-up (Figura 3). L'intervento di bendaggio provoca una stenosi significativa dell'aorta con flusso turbolento, che può essere valutata qualitativamente o quantificata utilizzando il Doppler ad onda continua. La Figura 2 mostra immagini rappresentative dell'ecocardiografia di follow-up a 2 mesi, che mostrano una significativa stenosi aortica (riga superiore) e ipertrofia concentrica ventricolare sinistra (file centrale e inferiore). Due mesi dopo il bendaggio, gli animali sviluppano una significativa ipertrofia cardiaca. La valutazione macroscopica ha rivelato cuori più grandi e una parete ventricolare sinistra più spessa (Figura 4). Il periodo di follow-up di due mesi è stato determinato in base al tasso di crescita degli animali utilizzati, poiché un periodo di follow-up più lungo avrebbe comportato animali troppo grandi per essere gestiti dalle nostre infrastrutture.
Figura 1: Schemi del protocollo di bandeggiamento aortico. Dopo aver ricevuto suini maschi di 20-25 kg, gli animali vengono sottoposti a un periodo di quarantena di 1 settimana. Il giorno della procedura, gli animali vengono anestetizzati e il ventricolo sinistro e l'aorta vengono cateterizzati e vengono posizionati sensori di pressione ad alta fedeltà, seguiti dal bendaggio aortico e dal recupero dell'animale. L'intera procedura, una volta padroneggiata, dura circa 2 ore. Due mesi dopo l'intervento, gli animali vengono sottoposti a una valutazione terminale, che comprende la raccolta di campioni e la misurazione delle variabili fisiologiche. Bendaggio aortico AB, Ao-aorta, ventricolo sinistro sinistro, PV-pressione-volume, cateterismo cardiaco destro, ecografia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Misurazioni della pressione durante il bendaggio aortico. (A) Tracce rappresentative del ventricolo sinistro e delle pressioni aortiche (distali rispetto al bendaggio) durante il bendaggio aortico. Ingrandire il ventricolo sinistro e la pressione aortica prima (B) e dopo la costrizione (C), mostrando la creazione del gradiente (differenza tra il picco del ventricolo sinistro sistolico e la pressione aortica). (D) Pull-off del sensore di pressione ventricolare, passando dall'aorta prossimale al bendaggio all'aorta distale al bendaggio. AP-pressione arteriosa, LVP-pressione ventricolare sinistra, MC-sensore di pressione ad alta fedeltà. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Ecocardiografia transtoracica. Il follow-up a 2 mesi dall'intervento rivela una stenosi significativa dell'aorta (freccia nera, riga superiore). L'ipertrofia ventricolare sinistra è evidente, sia in 2D (frecce bianche, riga centrale), sia in modalità M, che dimostra anche ipertrofia concentrica (frecce bianche, riga inferiore). La barra verticale corrisponde a 3 cm e le immagini PSAX 2D sono state acquisite a una profondità di 15 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi macroscopica post-mortem del cuore. Il bendaggio aortico porta alla cardiomegalia, con evidente ipertrofia della parete ventricolare sinistra. Le fette di cuore sono la base, la cavità centrale e l'apice da sinistra a destra. Le aderenze pericardiche possono essere osservate in tutto l'epicardio. Le barre della scala rappresentano 1 cm (riga superiore) e 4 cm (riga inferiore). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Negli ultimi anni, diversi studi hanno utilizzato il bendaggio chirurgico dell'aorta come modello per il sovraccarico di pressione ventricolare sinistra e l'insufficienza cardiaca(dalla discesa 9 all'aorta ascendente10), consentendo ai ricercatori di ottenere vari fenotipi su misura per le loro esigenze specifiche. Sebbene l'utilizzo di tali modelli richieda attrezzature costose e conoscenze specialistiche, le informazioni che forniscono sono inestimabili. Il suino, a causa delle sue dimensioni e della somiglianza con il cuore umano, funge da modello ideale11, ottenendo l'accettazione etica come donatori di organi per gli xenotrapianti.
La principale fase critica di questo metodo è la dissezione dell'aorta e il posizionamento del materiale di bendaggio (cavo di nylon o innesto in ePTFE) attorno ad essa. Durante questa fase, possono verificarsi diverse complicazioni, tra cui la lacerazione o la rottura delle strutture circostanti o dell'aorta stessa. Il controllo di tali complicanze può essere ottenuto posizionando una sutura a corda o una sutura a materasso con pegni sul foro se il sanguinamento può essere controllato per visualizzare correttamente la ferita. Si consiglia vivamente di far eseguire la procedura da un chirurgo cardiotoracico, che riduce significativamente i tassi di complicanze e mortalità.
Un altro passaggio critico è la costrizione dell'aorta, che dovrebbe essere eseguita in fasi sequenziali con periodi di stabilizzazione intermedi. Prestare molta attenzione alle pressioni periferiche sistemiche è fondamentale, poiché l'ipotensione significativa sostenuta (pressione arteriosa media inferiore a 60 mmHg) può derivare dall'incapacità del ventricolo sinistro di far fronte alla stenosi corrente. Se non risolto, soprattutto quando anche la pressione ventricolare inizia a diminuire, l'insufficienza cardiaca acuta porterà alla perdita dell'animale. La rimozione del cavo in nylon o della clip in titanio è necessaria quando l'ipotensione non si risolve spontaneamente.
Tuttavia, il limite principale di questo modello, e di molti modelli di bande aortiche, è la posizione della fascia rispetto all'ostio coronarico. Il posizionamento del bendaggio sopracoronarico non imita completamente la stenosi aortica e può portare ad un aumento della pressione sanguigna nella circolazione coronarica, che potrebbe essere protettiva12. Evidenze limitate suggeriscono che non ci sono differenze tra il bendaggio aortico sub-coronarico e sopra-coronarico nei suini13, indicando che l'aumento delle complicanze associate alla chirurgia del bendaggio sub-coronarico potrebbe non essere utile.
A seconda del ceppo animale utilizzato e del tempo di follow-up, l'internalizzazione della banda può diventare un problema. Sebbene sia descritta principalmente nei roditori14, è stata osservata anche nell'arteria polmonare dei suini15. L'utilizzo di segmenti di innesto in ePTFE aumenta significativamente l'area di contatto ed elimina l'insorgenza di internalizzazione della banda. Tuttavia, gli innesti in ePTFE sono più costosi e quando si utilizzano razze a crescita lenta, come il maiale panciuto vietnamita, l'internalizzazione della fascia non è un problema quando si utilizzano fascette di nylon. I ricercatori dovrebbero scegliere il loro approccio in base alla razza animale utilizzata.
Per le razze a crescita rapida, il follow-up a lungo termine potrebbe essere impegnativo a causa delle dimensioni degli animali (disponibilità di infrastrutture e attrezzature abbastanza grandi da gestire animali di >100 kg) e dei costi di manutenzione proibitivi.
Un altro limite di questo modello, così come di tutti i modelli che richiedono l'accesso allo spazio pericardico, è la presenza di aderenze pericardiche significative dopo l'intervento chirurgico. La nostra esperienza non mostra alcuna differenza tra la chiusura o la mancata chiusura dell'incisione pericardica dopo il posizionamento della fascia. Sebbene non influisca sulla funzione, la dissezione del cuore e l'identificazione di strutture diverse diventano più dispendiose in termini di tempo e l'epicardio rischia di essere danneggiato se il pericardio è completamente separato.
Questo metodo minimamente invasivo rappresenta un significativo perfezionamento della tipica procedura chirurgica, portando a un recupero senza incidenti e più rapido. L'uso di due cateteri ad alta fedeltà per la misurazione simultanea della pressione e la misurazione del gradiente in tempo reale migliora significativamente l'accuratezza della procedura e la riproducibilità del modello, portando a una riduzione del numero di animali necessari. Il modello può essere applicato allo studio di nuovi interventi terapeutici o dispositivi mirati all'ipertrofia ventricolare sinistra, nonché alla determinazione di nuovi meccanismi fisiopatologici associati al sovraccarico pressorio ventricolare sinistro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto e finanziato nell'ambito del progetto QREN 2013/30196, della Fondazione Bancaria "la Caixa", del progetto Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), LCF/PR/HP17/52190002. JS ed EB sono stati sostenuti dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie n. 813716. Il PdCM è stato sostenuto dal progetto MEDIATOR (LSHM 21016) di Stichting Life Sciences Health (LSH)-TKI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 PDS II suture | Ethicon | Z683G | Aorta banding |
| 5-0 prolene | Ethicon | 7472H | Aorta banding |
| ACUSON NX2 Ultrasound System | Siemens | (240)11284381 | Vascular Access and Echocardiography |
| Arterial Extension 200 cm | PMH | 303.0666 | Anesthesia Maintenance |
| Atlan A300 Ventilator | Draeger | 8621300 | Ventilation |
| Bone cutters | Fehling | AMP 367.00 | Aorta banding |
| Cefazolin 1000 mg | Labesfal | 100063 | Antibiotic |
| Chlorhexidine 4% Wash Solution | AGA | 19110008 | Cleaning |
| Doyen Intestinal Forceps | Aesculap | EA121R | Intubation |
| Echogenic Introducer Needle | Teleflex | AN-04318 | Vascular Access |
| Endotracheal tube | Intersurgical | 8040070 | Intubation |
| ePTFE vascular graft (5 mm x 40 cm) | GORE-TEX | S0504 | Aorta banding |
| Extension line 100 cm | PMH | 303.0394 | Anesthesia Induction |
| F.O. Laryngoscope | Luxamed | E1.317.012 | Intubation |
| F.O. Miller Blade 4 204 x 17 mm | Luxamed | 3 | Intubation |
| Fenestrated Sterile Drape | Bastos Viegas | 4882-256 | Aseptic Technique |
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | B.Braun | 5758883 | Anesthesia / Analgesia |
| Guidewire 260 cm J-tip | B.Braun | J3 FC-FS 260-035 | Left Ventricle catheterization |
| Infusomat Space Infusion Pump | B.Braun | 24101800 | Fluids / Drug administration |
| Intercostal retractor | Fehling Surgical | MRP-1 | Thoracotomy |
| Introcan Certo IV Catheter 20G | B.Braun | 4251326 | Fluids / Drug administration |
| Isotonic Saline Solution 0.9% | B.Braun | 5/44929/1/0918 | Fluids / Drug administration |
| Ketamidor 100 mg/mL | Richter pharma | 1121908AB | Anesthesia Induction |
| L10-5v Linear Transducer | Siemens | 11284481 | Vascular Access |
| Midazolam 15 mg/3 mL | Labesfal | PLB762-POR/2 | Anesthesia Induction |
| Mikro-cath | Millar | 63405(1) | Pressure recording |
| MP1 guide catheter 6 Fr | Cordis | 67027000 | Left Ventricle catheterization |
| Needle Holder | Fehling Surgical | ZYY-5 | Aorta banding |
| Non-woven adhesive | Bastos Viegas | 442-002 | Fluids / Drug administration |
| P4-2 Phased Array Transducer | Siemens | 11284467 | Echocardiography |
| Perfusor Compact Syringe Perfusion Pump | B.Braun | 8717030 | Fluids / Drug administration |
| Pressure Signal Conditioner | ADinstruments | PCU-2000 | Pressure recording |
| Propofol Lipuro 2% | B.Braun | 357410 | Anesthesia Maintenance |
| Radifocus Introducer II Standard Kit B - Introducer Sheath | Terumo | RS+B60K10MQ | Vascular Access |
| Radiopaque marker | Scanlan | 1001-83 | Aorta banding |
| Scissors | Fehling Surgical | Thoracotomy | |
| Skinprep (Chlorhexidine 2% / 70% Isopropyl alcohol) | Vygon | SKPC015ES | Disinfection |
| Stopcock manifold (3 ports) | PMH | 310.0489 | Fluids / Drug administration |
| Straight forceps | Fehling Surgical | ZYY-1 | Thoracotomy |
| Stresnil 40 mg/mL | ecuphar | 572184.2 | Anesthesia Induction |
| Syringe Luer Lock 20 cc | Omnifix B.Braun | 4617207V | Anesthesia Induction |
| Syringe Luer Lock 50 cc | Omnifix B.Braun | 4617509F | Anesthesia Maintenance |
| Transdermal fentanyl Patch 50 mcg/h | Mylan | 5022153 | Analgesia |
| Ultravist | Bayer | KT0B019 | Angiography |
| Universal Hemostasis Valve Adapter | Merit Medical | UHVA08 | Left Ventricle catheterization |
| Velcro Limb Immobilizer | PMH | SU-211 | Animal stabilization |
| Venofix A, 21 G | B.Braun | 4056337 | Anesthesia Induction |
| Vista 120S Patient Monitor | Draeger | MS32997 | Monitoring |
| Weck titanium clip | Teleflex | 523760 | Aorta banding |
| Weck titanium clip applier | Teleflex | 523166 | Aorta banding |
| Zhiem Vision | Iberdata | N/A | Fluoroscopy |
References
- Savarese, G., et al. Global burden of heart failure: a comprehensive and updated review of epidemiology. Cardiovascular Research. 118 (17), 3272-3287 (2023).
- Hartley, A., et al. Trends in mortality from aortic stenosis in Europe: 2000-2017. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 748137 (2021).
- Silva, K. A. S., Emter, C. A. Large Animal models of heart failure: a translational bridge to clinical success. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 5 (8), 840-856 (2020).
- Brink, C. B., Lewis, D. I. The 12 Rs framework as a comprehensive, unifying construct for principles guiding animal research ethics. Animals (Basel). 13 (7), 1128 (2023).
- Choy, J. S., Zhang, Z. D., Pitsillides, K., Sosa, M., Kassab, G. S. Longitudinal hemodynamic measurements in swine heart failure using a fully implantable telemetry system. PLoS One. 9 (8), 103331 (2014).
- Ishikawa, K., et al. Increased stiffness is the major early abnormality in a pig model of severe aortic stenosis and predisposes to congestive heart failure in the absence of systolic dysfunction. Journal of the American Heart Association. 4 (5), 001925 (2015).
- Emter, C. A., Baines, C. P. Low-intensity aerobic interval training attenuates pathological left ventricular remodeling and mitochondrial dysfunction in aortic-banded miniature swine. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (5), H1348-H1356 (2010).
- Brito, J., Raposo, L., Teles, R. C. Invasive assessment of aortic stenosis in contemporary practice. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 9, 1007139 (2022).
- Tan, W., et al. A Porcine model of heart failure with preserved ejection fraction induced by chronic pressure overload characterized by cardiac fibrosis and remodeling. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 677727 (2021).
- Bikou, O., Miyashita, S., Ishikawa, K. Pig model of increased cardiac afterload induced by ascending aortic banding. Methods in Molecular Biology. 1816, 337-342 (2018).
- Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (5), 432-438 (2014).
- Tian, L., et al. Supra-coronary aortic banding improves right ventricular function in experimental pulmonary arterial hypertension in rats by increasing systolic right coronary artery perfusion. Acta Physiologica (Oxf). 229 (4), 13483 (2020).
- Sorensen, M., Hasenkam, J. M., Jensen, H., Sloth, E. Subcoronary versus supracoronary aortic stenosis. An experimental evaluation. Journal of Cardiothoracic Surgery. 6, 100 (2011).
- Lygate, C. A., et al. Serial high resolution 3D-MRI after aortic banding in mice: band internalization is a source of variability in the hypertrophic response. Basic Research in Cardiology. 101 (1), 8-16 (2006).
- Jalal, Z., et al. Unexpected Internalization of a Pulmonary Artery Band in a Porcine Model of Tetralogy of Fallot. World Journal for Pediatric and Congenital Heart Surgery. 8 (1), 48-54 (2017).
