Summary
Este protocolo descreve um procedimento cirúrgico minimamente invasivo para bandagem da aorta ascendente em suínos.
Abstract
Modelos animais de grande porte de insuficiência cardíaca desempenham um papel essencial no desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas devido ao seu tamanho e semelhanças fisiológicas com os seres humanos. Esforços têm sido dedicados a criar um modelo de insuficiência cardíaca induzida por sobrecarga de pressão e bandagem aórtica ascendente ainda supracoronária e não um mimetismo perfeito da estenose aórtica em humanos, muito semelhante à condição humana.
O objetivo deste estudo é demonstrar uma abordagem minimamente invasiva para induzir sobrecarga pressórica do ventrículo esquerdo através da colocação de uma banda aórtica, precisamente calibrada com sensores de pressão de alta fidelidade introduzidos percutaneamente. Este método representa um refinamento do procedimento cirúrgico (3Rs), resultando em gradientes transestenóticos homogêneos e reduzida variabilidade intragrupo. Além disso, permite uma recuperação rápida e sem intercorrências dos animais, levando a taxas mínimas de mortalidade. Durante todo o estudo, os animais foram acompanhados por até 2 meses após a cirurgia, empregando-se ecocardiografia transtorácica e análise de alça pressão-volume. No entanto, períodos de acompanhamento mais longos podem ser alcançados, se desejado. Esse modelo animal de grande porte mostra-se valioso para testar novas drogas, particularmente aquelas direcionadas à hipertrofia e às alterações estruturais e funcionais associadas à sobrecarga de pressão ventricular esquerda.
Introduction
A insuficiência cardíaca (IC) é uma doença que ameaça a vida e afeta milhões de pessoas em todo o mundo, causando grandes impactos sociais e econômicos1. Uma de suas etiologias importantes é a valvopatia aórtica ou estenose aórtica (EA). A estenose aórtica é mais prevalente em idade avançada e é a segunda lesão valvar mais comum nos Estados Unidos. A mortalidade relacionada à EA também tem aumentado na Europa, particularmente em países sem acesso a procedimentos intervencionistas recentes2. Dada a complexidade da IC e a escassez de inovações terapêuticas, há uma necessidade premente de modelos animais confiáveis que possam replicar a condição humana e facilitar o teste de novas intervenções3. Enquanto os modelos de roedores superam os modelos animais de grande porte, estes últimos oferecem várias vantagens devido ao seu tamanho e semelhanças fisiológicas, permitindo o teste de doses de drogas e dispositivos médicos destinados ao uso humano.
O objetivo deste método é estabelecer um modelo reprodutível de bandagem da aorta ascendente (AAB) aplicável à maioria das espécies animais de grande porte utilizadas em pesquisas biomédicas. Neste estudo, o procedimento é demonstrado em suínos utilizando uma abordagem minimamente invasiva, aderente aos princípios dos 3Rs (substituição, redução e refinamento4). Essa abordagem garante a criação de um gradiente de pressão preciso, resultando em alta reprodutibilidade (potencialmente reduzindo o número de animais necessários). Além disso, a pequena incisão cirúrgica (2-3 cm) minimiza o insulto cirúrgico, melhorando o bem-estar do animal em comparação com abordagens mais agressivas como esternotomia e toracotomiasmaiores5 (refinamento). Além disso, fornecer uma demonstração em vídeo do método, juntamente com descrições detalhadas na literatura, poderia potencialmente reduzir a necessidade de animais usados exclusivamente para fins de treinamento (substituição), diminuindo ainda mais o uso de animais. Este modelo pode ser adaptado para diferentes linhagens/raças de suínos com taxas de crescimento distintas e induz sobrecarga pressórica sustentada, levando a hipertrofia significativa após 1 ou 2 meses de seguimento.
Os métodos atuais empregam estenose fixa6, desconsiderando a variabilidade do tamanho dos animais, ou calculam o gradiente usando leituras de pressão preenchidas com líquido7, que são menos confiáveis do que sensores de pressão de alta fidelidade e são suscetíveis ao amortecimento do sinal8. Outra abordagem utiliza uma única medida de pressão distal à estenose5. No entanto, a calibração da estenose por meio de sinais simultâneos de pressão proximal e distal usando sensores de pressão de alta fidelidade entregues percutaneamente representa uma otimização substancial do protocolo, resultando em melhor homogeneidade dos grupos. Ao demonstrar visualmente esse método, outros pesquisadores devem ser capazes de replicá-lo sem obstáculos significativos, aumentando a disponibilidade desse modelo e promovendo a aplicação dos princípios dos 3Rs.
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Protocol
Os experimentos em animais foram realizados no laboratório de Cirurgia Experimental do Centro de Pesquisa e Desenvolvimento Cardiovascular da Universidade do Porto (UnIC, Porto, Portugal). A comissão de ética animal institucional aprovou o estudo de acordo com a Autoridade Nacional de Saúde Animal (DGAV, Ref: 2021-07-30 011706 0421/000/000/2021). Os experimentadores eram licenciados (autorização FELASA-equivalente à Laboratory Animal Sciences) ou eram cirurgiões cardiotorácicos ou anestesiologistas. Os animais utilizados neste trabalho foram machos de origem Landrace x Pietrain e foram adquiridos de um criador licenciado pela DGAV (PTAH03). O peso inicial dos animais foi de 20-25 kg, o que permitiu um seguimento máximo de 2 meses (70-80 kg, Figura 1). Períodos de acompanhamento mais longos são comprometidos devido ao crescimento significativo dos animais, que nossas infraestruturas não foram capazes de suportar.
1. Anestesia e monitorização dos sinais vitais
- Jejue o animal selecionado durante a noite com água ad libitum.
- Pese o animal consciente (permita que ele ande em uma balança animal) ou use uma estimativa baseada no peso de chegada e na taxa de crescimento esperada.
- Preparar um cocktail de cetamina (15 mg/kg), midazolam (0,5 mg/kg) e azaperone (4 mg/kg) numa seringa Luer lock de 20 ml ligada a uma linha de extensão (100 cm) seguida de uma agulha de 21 G (ver Tabela de Materiais). Certifique-se de ter anestésico suficiente para contabilizar o volume morto da tubulação de injeção.
- Isolar o porco em um ambiente calmo e seguro (geralmente uma sala de manutenção do animal vazia, se possível) e anestesiar o animal através de uma injeção intramuscular no pescoço ou no músculo da pata traseira (seguindo protocolo institucional). Certifique-se de que o animal esteja em um lugar silencioso e escuro e certifique-se de que ele não pode se machucar enquanto perde a decúbito, o que deve levar de 10 a 15 minutos.
OBS: O uso de uma linha de extensão evita a necessidade de contenção do animal. - Quando o animal estiver em decúbito, coloque o animal anestesiado em uma maca e transporte o animal para a sala de cirurgia (medir o peso do animal neste momento se a pesagem consciente não for uma opção).
- Posicionar o animal em decúbito lateral direito ou esquerdo, dependendo da orelha a ser canulada. Limpe o ouvido várias vezes com clorexidina e álcool em movimento circular. Em seguida, canular a veia marginal da orelha com cateter intravenoso de 20 G e fixá-la com adesivo não tecido (ver Tabela de Materiais). Conecte o cateter IV a um coletor de torneira de 3 portas pré-lavado com soro fisiológico.
NOTA: Alternativamente, em comparação com uma linha de infusão IV padrão (linha de gotejamento), uma bomba de infusão permite o ajuste preciso da taxa de fluxo (2 mL/kg/h). - Colocar um adesivo transdérmico de fentanil (50 μg/h) (ver Tabela de Materiais) na orelha contralateral.
- Colocar o animal em uma mesa cirúrgica radiotransparente, em decúbito dorsal, em cima de um colchão aquecido, e prendê-lo no lugar (alças prendendo as patas à mesa cirúrgica).
- Conecte uma linha de perfusão de propofol ao coletor de torneira de 3 portas. A manutenção da anestesia será feita com propofol administrado através de uma seringa de 50 mL montada em uma bomba de perfusão de seringa (ver Tabela de Materiais) a uma taxa de 10-20 mg/kg/h.
- Administrar um bolus de propofol (4 mg/kg) e fentanil (10 μg/kg) (ver Tabela de Materiais) para induzir apneia e permitir a intubação.
OBS: O animal estará em apneia a partir deste momento, devendo ser estabelecida ventilação mecânica. Antes de prosseguir, verifique se a fonte de oxigênio está disponível e se o ventilador (consulte a Tabela de Materiais) está calibrado e pronto para ventilação. - Depois de garantir a perda de reatividade, e com um usuário mantendo a boca do porco aberta enquanto simultaneamente puxa a língua para fora, use um laringoscópio com uma lâmina de Miller número 4 (ver Tabela de Materiais) para identificar e mobilizar suavemente a epiglote, obtendo uma visão das cordas vocais. Introduza o tubo endotraqueal diretamente ou avance um bougie e o tubo endotraqueal sobre ele primeiro. Algumas pinças intestinais atraumáticas podem auxiliar na mobilização do palato mole e no acesso à epiglote.
- Inflar o balonete do tubo endotraqueal e conectá-lo ao aparelho de anestesia/ventilador. Ajustar os parâmetros ventilatórios para 8-10 mL/kg de volume corrente, frequência respiratória de 15-25 respirações por minuto e 5 cm H2O de PEEP (pressão expiratória final positiva). Ajustar os parâmetros ventilatórios para manter o CO2 expirado entre 35 e 45 mmHg.
- Posicione o sensor de SpO2 na língua ou orelha (onde o melhor sinal é obtido), coloque a sonda de temperatura esofágica e conecte os eletrodos de ECG (ver Tabela de Materiais).
- Aplique pomada lubrificante oftálmica estéril para evitar lesões na córnea.
2. Canulação arterial
- Depois de garantir a profundidade anestésica adequada pela ausência de reflexo palpebral e frequência cardíaca e pressão arterial constantes, limpe e desinfete completamente a área da virilha com clorexidina e álcool em um movimento circular. Cobrir o animal com campos estéreis fenestrados (ver Tabela de Materiais), com o orifício posicionado na área da artéria femoral (previamente confirmado por palpação ou ultrassonografia). Administrar cefazolina (25 mg/kg) como profilaxia antibiótica.
- Se o procedimento envolver recuperação do animal (bandagem aórtica), utilizar a técnica asséptica a partir deste ponto.
NOTA: Uma técnica asséptica rigorosa não é necessária se for um procedimento terminal (análise PV Loop). Entretanto, trabalhar de forma estéril é vantajoso para evitar infecções que poderiam afetar as medidas hemodinâmicas. - Identificar o local da punção e infiltrar-se na área com lidocaína a 1% subcutânea.
- Identificar a artéria femoral comum usando a sonda vascular (ver Tabela de Materiais) e confirmar a posição do marcador ultrassonográfico e a profundidade correta.
OBS: A punção da artéria femoral pode ser realizada em eixo curto, eixo longo ou combinação de ambas as técnicas, utilizando uma modalidade biplanar em determinados sistemas. No entanto, nossa equipe emprega mais frequentemente a abordagem de eixo curto. - Prepare a bainha introdutora (ver Tabela de Materiais) lavando o introdutor e o dilatador com soro fisiológico heparinizado antes de montá-lo. Certifique-se de que a torneira de 3 vias na porta lateral do introdutor esteja na posição de fora em direção ao animal para evitar a perda de sangue ao remover o dilatador.
- Avançar uma agulha arterial (de preferência ecogênica, ver Tabela de Materiais) na artéria femoral enquanto monitora seu trajeto por ultrassonografia. Uma vez atingida a luz arterial, o que pode ser confirmado pela saída do sangue arterial pulsátil do cubo da agulha, avance um fio-guia com ponta em J para dentro da artéria. A introdução correta do fio-guia pode ser confirmada com ultrassom.
- Remova a agulha, mantenha pressão no local da punção para evitar sangramento adicional e avance o conjunto introdutor + dilatador (tamanho 6 Fr, 10 cm de comprimento) na artéria. Retirar o dilatador e confirmar a posição do introdutor aspirando de seu orifício lateral e lavando sequencialmente com soro fisiológico estéril.
- Conecte uma linha de pressão arterial ao portal lateral do introdutor da artéria femoral para monitorização da pressão arterial. Certifique-se de que a altura do transdutor de pressão esteja no nível dos átrios direitos e que a pressão atmosférica seja zero.
- Cobrir o introdutor com um pano estéril até a cateterização do ventrículo esquerdo.
3. Banda da aorta ascendente (preparação)
- Ajustar a posição do animal para um leve decúbito lateral direito e elevar a pata dianteira esquerda.
- Localizar a posição da aorta ascendente utilizando o transdutor de ultrassom cardíaco (ver Tabela de Materiais) e marcar o local da incisão antes de desinfetar completamente o tórax do animal com clorexidina e álcool em movimento circular.
- Cubra o animal com campos estéreis.
- Administrar um bolus de fentanil (10 μg/kg) para garantir analgesia suficiente. Para confirmar a profundidade da anestesia e analgesia, observar a ausência de reflexos palpebrais e nenhuma alteração na frequência cardíaca ou pressão arterial ao fazer a primeira incisão.
- Fazer uma incisão cutânea de 2-3 cm ao nível do 3/4ºespaço intercostal e dissecar a fáscia subjacente e as camadas musculares até atingir o espaço intercostal.
- Entre no tórax usando tesoura romba enquanto o animal está em expiração forçada sem PEEP para evitar danos ao pulmão.
- Aumentar a incisão para permitir a colocação das lâminas do afastador até um máximo de 3 cm.
- Retraia as costelas e visualize as estruturas subjacentes. Se a incisão for feita no local correto, a artéria pulmonar deve ser prontamente visível. A aorta será posterior a ela.
- Com pinças e tesouras de cirurgia cardíaca minimamente invasivas, abra o pericárdio e retraia os átrios esquerdos e qualquer tecido pulmonar que cubra a visão da aorta com gaze estéril úmida.
NOTA: Evite manipular demais os átrios esquerdos, pois isso levará à fibrilação atrial. Se isso ocorrer e não resolver espontaneamente, aplicar cardioversão elétrica. - Separe cuidadosamente a aorta da artéria pulmonar até atingir o seio pericárdico transverso. Este será o canal pelo qual o material de bandagem será passado.
OBS: Para bandagem da aorta ascendente podem ser utilizados diversos materiais, dependendo do tamanho do animal e do período de seguimento. Para animais com crescimento limitado e/ou curto período de seguimento, pode-se utilizar uma gravata zip com cabo de náilon (opção mais barata), enquanto para animais de crescimento mais rápido e/ou maior período de seguimento, pode-se utilizar prótese vascular fixada com clipes de titânio (opção mais cara), evitando a internalização da banda (discutida em detalhes nas seções abaixo) (vide Tabela de Materiais). - Opção 1 (cabo de nylon):
- Corte um segmento de ~10 cm de tubo de plástico estéril com um lúmen pequeno o suficiente para se encaixar confortavelmente na ponta da banda de nylon.
OBS: A tubulação estéril e a banda de nylon são previamente esterilizadas por esterilização em óxido de etileno ou submersão em formaldeído por pelo menos 24 h. - Utilizar pinça curva de 90° para passar a tubulação plástica (que serve como guia atraumática para a banda de nylon) ao redor da aorta, através do trajeto previamente criado, do espaço entre a aorta e a artéria pulmonar (proximal) em direção ao espaço entre a aorta e os átrios direitos (distal). A palpação com o dedo pode ajudar a guiar a pinça pelo caminho correto.
- Tome cuidado para não aplicar muita tensão na artéria pulmonar ou átrio direito, pois isso pode levar à instabilidade hemodinâmica. Preste muita atenção aos sinais vitais durante esta etapa para evitar períodos prolongados de hipotensão sistêmica.
- Uma vez visualizada a guia plástica no lado distal, segure-a com pinça de tecido e puxe-a cuidadosamente ao redor da aorta, trazendo consigo a banda de náilon. Conecte as duas extremidades da banda de nylon sem contrair a aorta.
- Corte um segmento de ~10 cm de tubo de plástico estéril com um lúmen pequeno o suficiente para se encaixar confortavelmente na ponta da banda de nylon.
- Opção 2 (enxerto de PTFE)
- Corte um enxerto estéril de ePTFE de ~10 cm de um enxerto de 5 mm e 40 cm de comprimento.
- Use uma pinça curva de 90° para manusear o enxerto e passá-lo ao redor da aorta. Consulte as etapas 3.11.2 e 3.11.3.
- Coloque um marcador radiopaco (ver Tabela de Materiais) na área de bandagem para facilitar a cateterização da aorta.
- Cubra o espaço intercostal com gaze úmida e campos estéreis.
4. Cateterismo de ventrículo esquerdo (VE)/aorta
- Administrar heparina (200 U.kg-1).
NOTA: Os procedimentos endovasculares estão associados a um risco de formação de coágulos e embolização distal, enquanto a administração de heparina levaria a sangramento excessivo durante o acesso cirúrgico à aorta. Portanto, o cateterismo VE/aorta é realizado após o acesso da aorta e a colocação da bandagem. - Conecte um adaptador de válvula de hemostasia dupla ou uma válvula de hemostasia em forma de estrela a um cateter-guia MP1 de 6 Fr (consulte a Tabela de Materiais) e lave com soro fisiológico heparinizado. Pré-carregar o cateter-guia com fio-guia de ponta em J de 260 cm 0,035. Introduzir esta montagem através da bainha arterial femoral.
NOTA: Pode haver um risco de sangramento ao avançar dois sensores de pressão de alta fidelidade (HFPS) através de uma válvula de hemostasia transversal padrão. Uma abordagem alternativa poderia ser o uso de dois cateteres-guia separados, mas isso exigiria um segundo local de acesso arterial. Para resolver tanto a questão do sangramento quanto a necessidade de locais de acesso adicionais, pode-se optar por uma válvula de hemostasia de porta dupla ou uma válvula de hemostasia em forma de estrela. Essas alternativas resolvem o problema de sangramento e eliminam a necessidade de pontos de acesso extras. Uma vez que o cateter-guia é avançado através da bainha arterial, é importante notar que o orifício lateral da bainha não permitirá a medição da pressão arterial. Para medir a pressão arterial, é necessário conectar a linha arterial ao orifício lateral do adaptador da válvula de hemostasia do cateter-guia. - Avançar o fio-guia e guiar o cateter para a aorta ascendente sob orientação fluoroscópica. Quando a valva aórtica for identificada, cruze-a cuidadosamente com o fio-guia e introduza o cateter-guia no VE. Se necessário, use contraste para facilitar o posicionamento anatômico. Verifique os traços de pressão para confirmar o posicionamento do VE.
- Remova o fio-guia deixando o cateter-guia no VE. Lave o cateter após a aspiração e certifique-se de que não há bolhas de ar no cateter.
- Avançar uma HFPS já calibrada, através de uma das portas da válvula dupla de hemostasia, para o VE. Uma marca com uma caneta estéril pode ser colocada no corpo do cateter para saber quando ele sai da ponta do cateter-guia. Alternativamente, a confirmação de um sinal claro de pressão ventricular é um sinal de saída do cateter-guia (interferência de sinal é observada enquanto a HFPS está dentro do cateter-guia).
- Avançar uma segunda HFPS através do outro orifício da válvula dupla de hemostasia e para o VE.
- Puxe o cateter-guia de volta para a aorta ascendente distalmente ao marcador radiopaco colocado no local da bandagem, deixando uma das HFPS no VE. Confirme a posição do cateter usando traços de pressão.
NOTA: O HPPS deve ser conectado ao sistema de registro e colocado em soro fisiológico estéril por pelo menos 30 minutos antes do uso para permitir que o sensor de pressão se equilibre. Antes de introduzir a HFPS no cateter-guia, certifique-se de zerar a pressão colocando o sensor na superfície do soro fisiológico estéril. - Cobrir o local de acesso vascular com um drape estéril e mover-se para o tórax para contrair a aorta.
5. Banda da aorta ascendente (constrição)
- Puxar levemente a banda de náilon (opção 1) ou o enxerto de ePTFE (opção 2) para garantir que a HFPS esteja adequadamente posicionada - a pressão do VE deve subir, enquanto a pressão aórtica distal à bandagem (marcador radiopaco) não deve aumentar.
- Se o posicionamento do cateter estiver incorreto, ajuste a posição da HFPS para garantir que a pressão proximal e distal ao local da constrição seja claramente registrada.
- Opção 1: fechar a banda de náilon até que fique aconchegante ao redor da aorta.
- Feche a banda de nylon um clique de cada vez enquanto monitora de perto as pressões. Após cada clique, deixe as pressões se estabilizarem.
- Feche a banda de nylon gradualmente até atingir o gradiente de pressão desejado. A meta é um gradiente de aproximadamente 100 mmHg, garantindo que as pressões diastólicas finais do ventrículo esquerdo não excedam 25 mmHg.
NOTA: Se o gradiente alcançado for um pouco inferior a 100 mmHg (ou seja, entre 90-95 mmHg), abstenha-se de apertar ainda mais a banda de nylon. É fundamental não apertar demais nessa situação. No entanto, se a banda de nylon for acidentalmente apertada excessivamente durante o procedimento ou após a estabilização, pode-se usar cortadores ósseos (ver Tabela de Materiais) para cortar a banda de nylon e, em seguida, repetir os procedimentos anteriores (passo 3.11 e passo 5.3) para reajustar e alcançar o gradiente de pressão adequado. - Coloque um pedaço de tubo plástico estéril na extremidade da fita de nylon para evitar qualquer dano acidental às estruturas circundantes.
- Opção 2: aproximar as extremidades do PTFE e contrair a banda usando pinça de 45°, enquanto monitora as pressões, para estimar a localização relativa da constrição.
- Coloque um hemoclipe de titânio na posição da pinça (o pinçamento das duas extremidades do enxerto de ePTFE deixará uma marca nele, servindo para guiar a posição do hemoclipe).
- Verifique o gradiente de pressão. Se o gradiente for ótimo, confirme a posição anterior do hemoclipe colocando um segundo hemoclipe imediatamente acima do anterior (isso não aumentará a constrição, mas evitará qualquer deslizamento distal do clipe).
- Se o gradiente não for suficiente, coloque um clipe adicional abaixo do clipe anterior (contraindo ainda mais a aorta). Faça isso até que o gradiente esteja ideal. Se o gradiente for muito grande, use o aplicador de clipe para remover o clipe e coloque outro mais distalmente.
- Cortar as extremidades do enxerto de ePTFE para evitar excesso de material do enxerto no tórax e suturar o enxerto para o lado proximal da aorta usando uma sutura 5.0 (ver Tabela de Materiais) para evitar o movimento distal do enxerto.
- Aguarde 15 minutos após a colocação da bandagem para estabilizar as pressões e determinar se o gradiente permanece ideal ou se a descompensação e a falha aguda se instalarão. Se a hipotensão ocorrer sem resolução espontânea, é muito provável que o VE esteja descompensando, e o alívio da bandagem é necessário.
- Fechar o pericárdio com sutura PDS II 3-0 (ver Tabela de Materiais).
- Coloque um dreno torácico e conecte-o a um aspirador cirúrgico. Aumentar a PEEP para 10 cmH2O para começar a recrutar qualquer pulmão que sofreu atelectasia.
- Fechar a parede torácica por planos com sutura PDS II 3-0.
- Fechar o último ponto muscular enquanto se retira o dreno torácico e com a ventilação interrompida ao final da expiração com alta pressão (ajustada manualmente para 20-30 cmH2O).
- Retomar a ventilação normal e fechar a pele com sutura PDS II 3-0 com padrão intradérmico após lavar a ferida operatória com iodopovidona.
- Remova os Mikro-caths (ver Tabela de Materiais) e verifique a pressão superficial para ter em conta a deriva de pressão durante o procedimento.
- Remova o cateter-guia.
- Retirar a bainha introdutora e aplicar compressão manual para fechamento da arteriotomia. Aplique a compactação no site de acesso por pelo menos 10 minutos. Avaliar o local da hemostasia removendo lentamente a pressão e confirmando a ausência de sangramento ou formação de hematoma.
- Coloque um ponto no local da punção usando uma sutura absorvível, se necessário.
NOTA: Se necessário, neste momento, um ecocardiograma transtorácico rápido pode ajudar a determinar se a função cardíaca é boa e permitir a estimativa do gradiente de pressão aórtica. Embora não seja necessário (já que o gradiente de pressão foi medido com sensores de pressão de alta fidelidade), um gradiente derivado do eco pode ser usado para comparar o modelo com dados clínicos. Vale ressaltar que, devido à cirurgia, a qualidade da imagem estará comprometida. - Interromper a anestesia e extubar o animal assim que a ventilação espontânea for detectada. Desconecte o animal do ventilador e certifique-se de que o fluxo de ar adequado seja sentido através do tubo endotraqueal e que a oxigenação periférica não seja comprometida.
- Extubar e colocar um Guedel se necessário.
- Retirar o cateter da veia periférica.
- Monitorar o animal por pelo menos 15 minutos enquanto monitora ECG/frequência cardíaca e oxigenação periférica.
- Se estiver estável, leve o animal a um curral de recuperação limpo com temperatura ambiente aumentada. Use um dispositivo portátil de sinais vitais (consulte a Tabela de Materiais) para monitorar continuamente a frequência cardíaca e a saturação até que o animal recupere a consciência.
- Acompanhar os animais pelo período desejado e realizar ecocardiograma transtorácico ou análise de alça pressão-volume para determinar a função cardíaca.
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Representative Results
Durante o desenvolvimento inicial do modelo, a taxa de mortalidade foi de aproximadamente 30%, com animais morrendo de insuficiência cardíaca aguda após bandagem e complicações cirúrgicas. No entanto, após o estabelecimento do modelo, as complicações cirúrgicas tornaram-se menos comuns, e a taxa de mortalidade caiu para cerca de 15%. Os dois óbitos ocorridos foram por ruptura aórtica durante dissecção.
O uso de sensores de pressão de alta fidelidade permite a obtenção de sinais de pressão de alta qualidade (Figura 2), permitindo calibração precisa e em tempo real da estenose. Isso garante que todos os animais operados experimentem um grau semelhante de sobrecarga de pressão ventricular esquerda, reduzindo a variabilidade dentro do grupo. Além disso, o próprio cateter tem uma haste de 2,3 F, que tem impacto mínimo na obstrução do fluxo em comparação com cateteres maiores cheios de líquido. Após um investimento inicial, os cateteres podem ser reutilizados várias vezes e, se a esterilização for necessária, o óxido de etileno pode ser usado (geralmente disponível através da colaboração com os departamentos cirúrgicos do hospital).
O gradiente transestenótico pode ser calculado em tempo real pelo software, que mede a diferença de pressão entre o ventrículo esquerdo (pressão proximal) e a aorta distal (pressão distal). Alguns minutos de estabilização entre cada passo de constrição garantem que o ventrículo esquerdo tenha tempo para se adaptar. Após a determinação do grau de constrição desejado, um período de estabilização de 15 min deve ser aplicado para garantir que o grau de bandagem permaneça estável e o animal seja compensado (Figura 2A).
Essa abordagem é superior a outras metodologias que não medem o gradiente transestenótico em tempo real e carecem tanto da homogeneidade de haver gradiente semelhante entre todos os animais (92,3 ± 2,3 mmHg, média e erro padrão da média, respectivamente, para 7 animais operados) quanto de monitorização rigorosa das pressões do ventrículo esquerdo. Além disso, essa abordagem evita as dificuldades associadas à realização de ecocardiografia transtorácica em suínos, particularmente em certas raças, como o porco vietnamita, que tem um esterno mais significativamente saliente.
O ecocardiograma transtorácico pode confirmar a bandagem aórtica tanto no pós-operatório imediato quanto no seguimento (Figura 3). A cirurgia de bandagem resulta em estenose significativa da aorta com fluxo turbulento, que pode ser avaliada qualitativamente ou quantificada pelo Doppler de onda contínua. A Figura 2 mostra imagens representativas da ecocardiografia de seguimento de 2 meses, mostrando estenose aórtica significativa (fileira superior) e hipertrofia concêntrica do ventrículo esquerdo (fileiras média e inferior). Dois meses após a bandagem, os animais desenvolvem hipertrofia cardíaca significativa. A avaliação macroscópica revelou corações maiores e parede ventricular esquerda mais espessa (Figura 4). O período de acompanhamento de dois meses foi determinado com base na taxa de crescimento dos animais utilizados, uma vez que um período de acompanhamento mais longo resultaria em animais demasiado grandes para serem manuseados pelas nossas infraestruturas.
Figura 1: Esquema do protocolo de bandagem aórtica. Após receberem de 20 a 25 kg de suínos machos, os animais são submetidos a um período de quarentena de 1 semana. No dia do procedimento, os animais são anestesiados, o VE e a aorta são cateterizados e colocados sensores de pressão de alta fidelidade, seguidos de bandagem aórtica e recuperação do animal. Todo o procedimento, uma vez dominado, dura em torno de 2 h. Dois meses após a cirurgia, os animais são submetidos a uma avaliação terminal, incluindo coleta de amostras e mensuração de variáveis fisiológicas. Bandagem AB-aórtica, Ao-aorta, ventrículo esquerdo-VE, PV-pressão-volume, RHC-cateterismo cardíaco direito, ultrassonografia US. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Medidas pressóricas durante a bandagem aórtica. (A) Traços representativos das pressões do VE e da aorta (distal à bandagem) durante a bandagem aórtica. Zoom in do VE e da pressão aórtica antes (B) e após (C) constrição, mostrando a criação do gradiente (diferença entre o pico sistólico do VE e a pressão aórtica). (D) Arrancamento do sensor de pressão ventricular, fazendo a transição da aorta proximal para a bandagem para a aorta distal à bandagem. AP-pressão arterial, pressão do ventrículo esquerdo da PVE, sensor de pressão de alta fidelidade MC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ecocardiografia transtorácica. O seguimento de 2 meses após a cirurgia revela estenose significativa da aorta (seta preta, fileira superior). A hipertrofia do VE é aparente, tanto em 2D (setas brancas, fileira do meio), quanto no modo M, que também demonstra hipertrofia concêntrica (setas brancas, fileira inferior). A barra vertical corresponde a 3 cm, e as imagens do PSAX 2D foram adquiridas a 15 cm de profundidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise macroscópica post-mortem do coração. A bandagem aórtica leva à cardiomegalia, com nítida hipertrofia da parede do VE. As fatias cardíacas são base, cavidade média e ápice da esquerda para a direita. Aderências pericárdicas podem ser vistas em todo o epicárdio. As barras de escala representam 1 cm (linha superior) e 4 cm (linha inferior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nos últimos anos, vários estudos têm utilizado a bandagem aórtica cirúrgica como modelo para sobrecarga de pressão ventricular esquerda e insuficiência cardíaca (descendo9 para a aortaascendente10), permitindo aos pesquisadores obter vários fenótipos adaptados às suas necessidades específicas. Embora o uso de tais modelos exija equipamentos caros e conhecimento especializado, as informações que eles fornecem são inestimáveis. A raça suína, devido ao seu tamanho e semelhança com o coração humano, serve como modeloideal11, ganhando aceitação ética como doadora de órgãos para xenotransplante.
A principal etapa crítica neste método é a dissecção da aorta e a colocação do material de bandagem (cabo de náilon ou enxerto de ePTFE) ao seu redor. Durante essa etapa, várias complicações podem ocorrer, incluindo laceração ou ruptura das estruturas vizinhas ou da própria aorta. O controle de tais complicações pode ser obtido colocando-se uma sutura de corda de perseguição ou uma sutura de colchão com pledgets no orifício, se o sangramento puder ser controlado para visualizar adequadamente a ferida. Recomenda-se fortemente a realização do procedimento por cirurgião cardiotorácico, o que reduz significativamente as taxas de complicações e mortalidade.
Outro passo crítico é a constrição da aorta, que deve ser feita em etapas sequenciais com períodos de estabilização entre eles. Prestar muita atenção às pressões periféricas sistêmicas é crucial, pois a hipotensão sustentada significativa (pressão arterial média abaixo de 60 mmHg) pode resultar da incapacidade do VE de lidar com a estenose atual. Se não for resolvida, especialmente quando as pressões ventriculares começam a cair também, a insuficiência cardíaca aguda levará à perda do animal. A remoção do cabo de nylon ou clipe de titânio é necessária quando a hipotensão não se resolve espontaneamente.
Entretanto, a principal limitação desse modelo, e de muitos modelos de bandagem aórtica, é a localização da banda em relação aos óstios coronarianos. A colocação de bandagem supracoronária não mimetiza totalmente a estenose aórtica e pode levar ao aumento da pressão arterial na circulação coronariana, o que pode ser protetor12. Evidências limitadas sugerem que não há diferenças entre a bandagem aórtica subcoronária e supracoronariana emporcos13, indicando que o aumento das complicações associadas à cirurgia de bandagem subcoronária pode não valer a pena.
Dependendo da cepa animal utilizada e do tempo de acompanhamento, a internalização da banda pode se tornar um problema. Embora descrita principalmente emroedores14, também tem sido observada na artéria pulmonar desuínos15. O uso de segmentos de enxerto de ePTFE aumenta significativamente a área de contato e elimina a ocorrência de internalização de banda. No entanto, os enxertos de ePTFE são mais caros, e ao usar raças de crescimento lento, como o porco vietnamita de barriga de panela, a internalização da banda não é um problema ao usar tirolesas de nylon. Os pesquisadores devem escolher sua abordagem com base na raça animal utilizada.
Para raças de crescimento rápido, o acompanhamento a longo prazo pode ser desafiador devido ao tamanho dos animais (disponibilidade de infraestrutura e equipamentos grandes o suficiente para lidar com animais de >100 kg) e custos proibitivos de manutenção.
Outra limitação desse modelo, assim como de todos os modelos que necessitam de acesso ao espaço pericárdico, é a presença de aderências pericárdicas significativas após a cirurgia. Nossa experiência não mostra diferença entre fechar ou não a incisão pericárdica após a colocação da banda. Embora não afete a função, dissecar o coração e identificar diferentes estruturas torna-se mais demorado, e o epicárdio provavelmente será danificado se o pericárdio estiver totalmente separado.
Este método minimamente invasivo representa um refinamento significativo do procedimento cirúrgico típico, levando a uma recuperação sem intercorrências e mais rápida. O uso de dois cateteres de alta fidelidade para medida simultânea de pressão e gradiente em tempo real melhora significativamente a acurácia do procedimento e a reprodutibilidade do modelo, levando a uma redução no número de animais necessários. O modelo pode ser aplicado ao estudo de novas intervenções terapêuticas ou dispositivos voltados para a hipertrofia ventricular esquerda, bem como na determinação de novos mecanismos fisiopatológicos associados à sobrecarga pressórica do ventrículo esquerdo.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado e financiado no âmbito do projeto QREN 2013/30196, da Fundação Bancária "la Caixa", do projeto Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), LCF/PR/HP17/52190002. A JS e o EB foram apoiados pelo programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo do acordo de subvenção Marie Sklodowska-Curie n.º 813716. O PdCM foi apoiado pelo projeto Stichting Life Sciences Health (LSH)-TKI MEDIATOR (LSHM 21016).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 PDS II suture | Ethicon | Z683G | Aorta banding |
| 5-0 prolene | Ethicon | 7472H | Aorta banding |
| ACUSON NX2 Ultrasound System | Siemens | (240)11284381 | Vascular Access and Echocardiography |
| Arterial Extension 200 cm | PMH | 303.0666 | Anesthesia Maintenance |
| Atlan A300 Ventilator | Draeger | 8621300 | Ventilation |
| Bone cutters | Fehling | AMP 367.00 | Aorta banding |
| Cefazolin 1000 mg | Labesfal | 100063 | Antibiotic |
| Chlorhexidine 4% Wash Solution | AGA | 19110008 | Cleaning |
| Doyen Intestinal Forceps | Aesculap | EA121R | Intubation |
| Echogenic Introducer Needle | Teleflex | AN-04318 | Vascular Access |
| Endotracheal tube | Intersurgical | 8040070 | Intubation |
| ePTFE vascular graft (5 mm x 40 cm) | GORE-TEX | S0504 | Aorta banding |
| Extension line 100 cm | PMH | 303.0394 | Anesthesia Induction |
| F.O. Laryngoscope | Luxamed | E1.317.012 | Intubation |
| F.O. Miller Blade 4 204 x 17 mm | Luxamed | 3 | Intubation |
| Fenestrated Sterile Drape | Bastos Viegas | 4882-256 | Aseptic Technique |
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | B.Braun | 5758883 | Anesthesia / Analgesia |
| Guidewire 260 cm J-tip | B.Braun | J3 FC-FS 260-035 | Left Ventricle catheterization |
| Infusomat Space Infusion Pump | B.Braun | 24101800 | Fluids / Drug administration |
| Intercostal retractor | Fehling Surgical | MRP-1 | Thoracotomy |
| Introcan Certo IV Catheter 20G | B.Braun | 4251326 | Fluids / Drug administration |
| Isotonic Saline Solution 0.9% | B.Braun | 5/44929/1/0918 | Fluids / Drug administration |
| Ketamidor 100 mg/mL | Richter pharma | 1121908AB | Anesthesia Induction |
| L10-5v Linear Transducer | Siemens | 11284481 | Vascular Access |
| Midazolam 15 mg/3 mL | Labesfal | PLB762-POR/2 | Anesthesia Induction |
| Mikro-cath | Millar | 63405(1) | Pressure recording |
| MP1 guide catheter 6 Fr | Cordis | 67027000 | Left Ventricle catheterization |
| Needle Holder | Fehling Surgical | ZYY-5 | Aorta banding |
| Non-woven adhesive | Bastos Viegas | 442-002 | Fluids / Drug administration |
| P4-2 Phased Array Transducer | Siemens | 11284467 | Echocardiography |
| Perfusor Compact Syringe Perfusion Pump | B.Braun | 8717030 | Fluids / Drug administration |
| Pressure Signal Conditioner | ADinstruments | PCU-2000 | Pressure recording |
| Propofol Lipuro 2% | B.Braun | 357410 | Anesthesia Maintenance |
| Radifocus Introducer II Standard Kit B - Introducer Sheath | Terumo | RS+B60K10MQ | Vascular Access |
| Radiopaque marker | Scanlan | 1001-83 | Aorta banding |
| Scissors | Fehling Surgical | Thoracotomy | |
| Skinprep (Chlorhexidine 2% / 70% Isopropyl alcohol) | Vygon | SKPC015ES | Disinfection |
| Stopcock manifold (3 ports) | PMH | 310.0489 | Fluids / Drug administration |
| Straight forceps | Fehling Surgical | ZYY-1 | Thoracotomy |
| Stresnil 40 mg/mL | ecuphar | 572184.2 | Anesthesia Induction |
| Syringe Luer Lock 20 cc | Omnifix B.Braun | 4617207V | Anesthesia Induction |
| Syringe Luer Lock 50 cc | Omnifix B.Braun | 4617509F | Anesthesia Maintenance |
| Transdermal fentanyl Patch 50 mcg/h | Mylan | 5022153 | Analgesia |
| Ultravist | Bayer | KT0B019 | Angiography |
| Universal Hemostasis Valve Adapter | Merit Medical | UHVA08 | Left Ventricle catheterization |
| Velcro Limb Immobilizer | PMH | SU-211 | Animal stabilization |
| Venofix A, 21 G | B.Braun | 4056337 | Anesthesia Induction |
| Vista 120S Patient Monitor | Draeger | MS32997 | Monitoring |
| Weck titanium clip | Teleflex | 523760 | Aorta banding |
| Weck titanium clip applier | Teleflex | 523166 | Aorta banding |
| Zhiem Vision | Iberdata | N/A | Fluoroscopy |
References
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