Summary
Этот протокол описывает минимально инвазивную хирургическую процедуру бандажирования восходящей аорты у свиней.
Abstract
Модели сердечной недостаточности на крупных животных играют важную роль в разработке новых терапевтических вмешательств из-за их размера и физиологического сходства с людьми. Усилия были направлены на создание модели сердечной недостаточности, вызванной перегрузкой давлением, и восходящего бандажа аорты, в то время как это все еще надкоронарная и не идеальная имитация аортального стеноза у человека, очень напоминающая состояние человека.
Целью данного исследования является демонстрация минимально инвазивного подхода к индуцированию перегрузки левым желудочком путем установки аортального бандажа, точно откалиброванного с помощью чрескожно введенных высокоточных датчиков давления. Этот метод представляет собой усовершенствование хирургического вмешательства (3R), что приводит к однородным трансстенотическим градиентам и снижению внутригрупповой вариабельности. Кроме того, это позволяет быстро и без происшествий выздоравливать животных, что приводит к минимальному уровню смертности. На протяжении всего исследования за животными наблюдали в течение 2 месяцев после операции с использованием трансторакальной эхокардиографии и анализа петли давления-объема. Тем не менее, при желании можно добиться более длительных периодов наблюдения. Эта модель крупного животного оказалась ценной для тестирования новых препаратов, особенно тех, которые нацелены на гипертрофию и структурные и функциональные изменения, связанные с перегрузкой левого желудочкового давления.
Introduction
Сердечная недостаточность (СН) является опасным для жизни заболеванием, которое поражает миллионы людей во всем мире и приводит к серьезным социальным и экономическим последствиям1. Одной из его значимых этиологий является заболевание аортального клапана или аортальный стеноз (АС). Аортальный стеноз более распространен в пожилом возрасте и занимает второе место по распространенности в Соединенных Штатах. Смертность, связанная с АС, также возросла в Европе, особенно в странах, не имеющих доступа к современным интервенционным процедурам2. Учитывая сложность СН и нехватку терапевтических инноваций, существует острая потребность в надежных моделях на животных, которые могли бы воспроизвести состояние человека и облегчить тестирование новых вмешательств3. В то время как моделей грызунов больше, чем моделей крупных животных, последние имеют ряд преимуществ благодаря своему размеру и физиологическому сходству, что позволяет тестировать дозы лекарств и медицинских устройств, предназначенных для использования человеком.
Целью этого метода является создание воспроизводимой модели восходящей аортальной бандажи (AAB), применимой к большинству крупных видов животных, используемых в биомедицинских исследованиях. В данном исследовании процедура демонстрируется на свиньях с использованием минимально инвазивного подхода, придерживаясь принципов 3R (замена, редукция и уточнение4). Такой подход обеспечивает создание точного градиента давления, что приводит к высокой воспроизводимости (потенциально снижая количество необходимых животных). Кроме того, небольшой хирургический разрез (2-3 см) сводит к минимуму хирургическое повреждение, улучшая самочувствие животных по сравнению с более агрессивными подходами, такими как стернотомия и большая торакотомия5 (уточнение). Кроме того, предоставление видеодемонстрации метода, наряду с подробными описаниями в литературе, потенциально может снизить потребность в животных, используемых исключительно в целях дрессировки (замена), что еще больше сократит использование животных. Эта модель может быть адаптирована для различных линий/пород свиней с различными темпами роста и вызывает длительную перегрузку давлением, приводящую к значительной гипертрофии через 1 или 2 месяца наблюдения.
Современные методы используют фиксированный стеноз6, не принимая во внимание изменчивость размеров животных, или рассчитывают градиент с использованием показаний давления7, заполненных жидкостью, которые менее надежны, чем высокоточные датчики давления, и восприимчивы к затуханию сигнала8. Другой подход использует однократное измерение давления дистальнее стеноза5. Тем не менее, калибровка стеноза с помощью одновременных проксимальных и дистальных сигналов давления с использованием чрескожно доставляемых высокоточных датчиков давления представляет собой существенную оптимизацию протокола, что приводит к улучшению однородности группы. Наглядно демонстрируя этот метод, другие исследователи должны иметь возможность воспроизвести его без существенных препятствий, повышая доступность этой модели и способствуя применению принципов 3R.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты на животных проводились в лаборатории экспериментальной хирургии Университета Порту, Центр сердечно-сосудистых исследований и разработок (UnIC, Порту, Португалия). Институциональный комитет по этике животных одобрил исследование в соответствии с Национальным управлением по охране здоровья животных (Direcção-Geral de Alimentação e Veterinária, DGAV, Ref: 2021-07-30 011706 0421/000/000/2021). Экспериментаторы были либо лицензированы (разрешение FELASA на лабораторные исследования), либо были кардиоторакальными хирургами или анестезиологами. Животные, использованные в этой работе, были самцами породы ландрас х пьетрен и были приобретены у заводчика, лицензированного DGAV (PTAH03). Исходный вес животных составлял 20-25 кг, что позволяло вести наблюдение максимум 2 месяца (70-80 кг, рис. 1). Более длительные периоды наблюдения ставятся под угрозу из-за значительного роста животных, с которым наша инфраструктура не могла справиться.
1. Анестезия и мониторинг жизненно важных функций
- Голодайте выбранное животное в течение ночи с водой вволю.
- Взвесьте животное, находящееся в сознании (позвольте ему ходить на весах) или используйте оценку, основанную на прибывшем весе и ожидаемой скорости роста.
- Приготовьте коктейль из кетамина (15 мг/кг), мидазолама (0,5 мг/кг) и азаперона (4 мг/кг) в шприце с замком Люэра объемом 20 мл, соединенном с удлинительной линией (100 см), а затем иглой 21 г (см. таблицу материалов). Убедитесь, что у вас достаточно анестетика, чтобы учесть мертвый объем инъекционной трубки.
- Изолируйте свинью в спокойной и безопасной обстановке (обычно в пустой комнате для содержания животных, если это возможно) и обезболивайте животное путем внутримышечной инъекции в мышцу шеи или задней ноги (в соответствии с протоколом учреждения). Убедитесь, что животное находится в тихом и темном месте, и убедитесь, что оно не может пораниться, теряя лежачее положение, что должно занять 10-15 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование удлинительной линии позволяет избежать необходимости удерживать животное. - Как только животное окажется лежачьим, положите его на носилки под наркозом и транспортируйте в операционную (измерьте вес животного в этот момент, если сознательное взвешивание было невозможно).
- Расположите животное в правом или левом боковом пролежне в зависимости от уха, которое нужно канюлировать. Очистите ухо несколько раз хлоргексидином и спиртом круговыми движениями. Затем канулируют краевую ушную вену с помощью внутривенного катетера 20 G и закрепите ее с помощью нетканого клея (см. таблицу материалов). Подключите внутривенный катетер к 3-портовому коллектору с запорным краном, предварительно промытым физиологическим раствором.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, по сравнению со стандартной внутривенной инфузионной линией (капельницей), инфузионный насос позволяет точно регулировать скорость потока (2 мл/кг/ч). - Поместите трансдермальный фентаниловый пластырь (50 мкг/ч) (см. Таблицу материалов) в контралатеральное ухо.
- Положите животное на радиопрозрачный хирургический стол, в спинном положении лежа, поверх согревающего матраса, и закрепите его на месте (ремни, прикрепляющие лапы к операционному столу).
- Подсоедините линию перфузии пропофола к 3-портовому коллектору запорного крана. Анестезия обеспечивается пропофолом, вводимым через шприц объемом 50 мл, установленный на шприцевом перфузионном насосе (см. таблицу материалов) со скоростью 10-20 мг/кг/ч.
- Вводят болюс пропофола (4 мг/кг) и фентанила (10 мкг/кг) (см. таблицу материалов), чтобы вызвать апноэ и разрешить интубацию.
ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента животное будет находиться в состоянии апноэ, и необходимо установить искусственную вентиляцию легких. Прежде чем продолжить, убедитесь, что источник кислорода доступен, а аппарат ИВЛ (см. Таблицу материалов) откалиброван и готов к вентиляции. - Убедившись, что потеря реактивности и один пользователь держит рот свиньи открытым, одновременно вытягивая язык наружу, используйте ларингоскоп с лезвием Миллера No 4 (см. таблицу материалов), чтобы определить и мягко мобилизовать надгортанник, получив обзор голосовых связок. Либо вводите эндотрахеальную трубку напрямую, либо сначала продвигайте бужи и эндотрахеальную трубку над ней. Некоторые атравматические кишечные щипцы могут помочь мобилизовать мягкое небо и получить доступ к надгортаннику.
- Надуйте манжету эндотрахеальной трубки и подсоедините ее к наркозному аппарату/аппарату искусственной вентиляции легких. Отрегулируйте вентиляционные параметры до 8-10 мл/кг дыхательного объема, частоту дыхания 15-25 вдохов в минуту и 5 см H2O PEEP (положительное давление в конце выдоха). Отрегулируйте параметры вентиляции, чтобы поддерживать концентрациюCO2 в конце выдоха в диапазоне от 35 до 45 мм рт.
- Расположите датчик SpO2 на языке или ухе (где получается наилучший сигнал), поместите датчик температуры пищевода и прикрепите электроды ЭКГ (см. Таблицу материалов).
- Нанесите стерильную офтальмологическую смазывающую мазь, чтобы предотвратить повреждение роговицы.
2. Артериальная канюля
- После обеспечения надлежащей глубины анестезии при отсутствии пальпебрального рефлекса и стабильном сердцебиении и артериальном давлении тщательно очистить и продезинфицировать паховую область хлоргексидином и спиртом круговыми движениями. Накройте животное фенестрированными стерильными простынями (см. Таблицу материалов), отверстие расположите в области бедренной артерии (предварительно подтвержденное пальпацией или УЗИ). Назначают цефазолин (25 мг/кг) в качестве антибиотикопрофилактики.
- Если процедура связана с восстановлением животного (бандажирование аорты), с этого момента используйте асептическую технику.
ПРИМЕЧАНИЕ: Строгая асептическая техника не требуется, если речь идет о терминальной процедуре (анализ PV Loop). Тем не менее, стерильная работа выгодна, чтобы избежать инфекции, которая может повлиять на гемодинамические показатели. - Определите место прокола и инфильтрируйте область подкожно 1% лидокаином.
- Определите общую бедренную артерию с помощью сосудистого зонда (см. таблицу материалов) и подтвердите положение ультразвукового маркера и правильную глубину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пункция бедренной артерии может быть выполнена с использованием короткой оси, длинной оси или комбинации обоих методов, используя биплоскостную модальность в определенных системах. Тем не менее, наша команда чаще использует подход с короткой осью. - Подготовьте оболочку интродьюсера (см. Таблицу материалов), промыв интродьюсер и расширитель гепаринизированным физиологическим раствором перед сборкой. Убедитесь, что 3-ходовой запорный кран в боковом порту интродьюсера находится в выключенном положении по отношению к животному, чтобы избежать кровопотери при снятии расширителя.
- Ввести артериальную иглу (желательно эхогенную, см. Таблицу материалов) в бедренную артерию, контролируя ее траекторию с помощью ультразвука. Как только будет достигнут просвет артерии, что может быть подтверждено пульсирующей артериальной кровью, выходящей из ступицы иглы, проведите проводник J-образной кончики в артерию. Правильность введения проводника можно подтвердить с помощью УЗИ.
- Извлеките иглу, продолжайте надавливать на место прокола, чтобы избежать дополнительного кровотечения, и продвигайте узел интродьюсер + расширитель (размер 6 Fr, длина 10 см) в артерию. Снимите расширитель и подтвердите положение интродьюсера, отсасывая его из бокового отверстия и последовательно промывая стерильным физиологическим раствором.
- Подключите магистраль артериального давления к боковому порту интродьюсера бедренной артерии для мониторинга артериального давления. Убедитесь, что высота датчика давления находится на уровне правого предсердия, а атмосферное давление равно нулю.
- Накройте интродьюсер стерильной простыней до катетеризации левого желудочка.
3. Бандажирование восходящей аорты (препарирование)
- Отрегулируйте положение животного до легкого правого бокового пролежня и поднимите левую переднюю лапу.
- Определите положение восходящей аорты с помощью ультразвукового датчика сердца (см. Таблицу материалов) и отметьте место разреза, прежде чем тщательно продезинфицировать грудную клетку животного хлоргексидином и спиртом круговыми движениями.
- Накройте животное стерильными простынями.
- Введите болюс фентанила (10 мкг/кг) для обеспечения достаточного обезболивания. Чтобы подтвердить глубину анестезии и анальгезии, обратите внимание на отсутствие пальпебральных рефлексов и отсутствие изменений частоты сердечных сокращений или артериального давления при выполнении первого разреза.
- Делают разрез кожи 2-3 см на уровне 3/4 межреберья и рассекают нижележащие фасции и мышечные слои до достижения межреберья.
- Вводите в грудную клетку тупыми ножницами, пока животное находится на форсированном выдохе без PEEP, чтобы не повредить легкое.
- Увеличьте разрез, чтобы обеспечить размещение втягивающих лопастей максимум до 3 см.
- Втяните ребра и визуализируйте нижележащие структуры. Если разрез сделан в правильном месте, легочная артерия должна быть хорошо видна. Аорта будет располагаться позади него.
- Используя минимально инвазивные кардиохирургические щипцы и ножницы, откройте перикард и втяните левое предсердие и любую легочную ткань, закрывающую вид аорты, с помощью влажной стерильной марли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте слишком частых манипуляций с левыми предсердиями, так как это приведет к фибрилляции предсердий. Если это происходит и не проходит спонтанно, примените электрическую кардиоверсию. - Осторожно отделите аорту от легочной артерии до тех пор, пока не будет достигнут поперечный перикардиальный синус. Это будет канал, через который будет пропускаться обвязочный материал.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для бандажирования восходящей аорты может быть использовано несколько материалов, в зависимости от размера животного и периода наблюдения. Для животных с ограниченным ростом и/или коротким периодом наблюдения можно использовать нейлоновую кабельную стяжку (более дешевый вариант), в то время как для более быстрорастущих животных и/или более длительного периода наблюдения можно использовать трансплантат сосудистого протеза, зафиксированный титановыми зажимами (более дорогой вариант), избегая интернализации бандажа (подробно обсуждается в разделах ниже) (см. таблицу материалов). - Вариант 1 (нейлоновая кабельная стяжка-молния):
- Отрежьте отрезок стерильной пластиковой трубки длиной ~10 см с просветом, достаточно маленьким, чтобы плотно прилегать к кончику нейлоновой ленты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильную трубку и нейлоновую ленту предварительно стерилизуют стерилизацией окисью этилена или погружают в формальдегид не менее чем на 24 часа. - Используйте изогнутые на 90° щипцы, чтобы провести пластиковую трубку (которая служит атравматичным ориентиром для нейлоновой ленты) вокруг аорты по ранее созданной траектории из пространства между аортой и легочной артерией (проксимальный) в пространство между аортой и правым предсердием (дистальный). Пальпация пальцем может помочь направить щипцы по правильному пути.
- Следите за тем, чтобы не оказывать слишком большую нагрузку на легочную артерию или правое предсердие, так как это может привести к гемодинамической нестабильности. Обратите пристальное внимание на жизненно важные показатели на этом этапе, чтобы избежать длительных периодов системной гипотензии.
- Как только пластиковый проводник будет виден на дистальной стороне, захватите его тканевыми щипцами и осторожно потяните вокруг аорты, взяв с собой нейлоновую ленту. Соедините два конца нейлоновой ленты, не сдавливая аорту.
- Отрежьте отрезок стерильной пластиковой трубки длиной ~10 см с просветом, достаточно маленьким, чтобы плотно прилегать к кончику нейлоновой ленты.
- Вариант 2 (трансплантат из вспененного ПТФЭ)
- Вырезать ~10 см стерильного графта из вспененного ПТФЭ из графта длиной 5 мм и длиной 40 см.
- Используйте изогнутые на 90° щипцы, чтобы обработать трансплантат и провести его вокруг аорты. Смотрите шаги 3.11.2 и 3.11.3.
- Поместите рентгеноконтрастный маркер (см. Таблицу материалов) в область бандажа для облегчения катетеризации аорты.
- Накройте межреберье влажной марлей и стерильными простынями.
4. Катетеризация левого желудочка (ЛЖ)/аорты
- Вводят гепарин (200 U.kg-1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эндоваскулярные процедуры связаны с риском образования тромбов и дистальной эмболизации, в то время как введение гепарина приведет к чрезмерному кровотечению во время хирургического доступа к аорте. Таким образом, катетеризация ЛЖ/аорты проводится после доступа к аорте и наложения бандажа. - Подсоедините адаптер двойного клапана гемостаза или звездообразный клапан гемостаза к направляющему катетеру 6 Fr MP1 (см. Таблицу материалов) и промойте гепаринизированным физиологическим раствором. Предварительно нагрузите направляющий катетер с помощью направляющего провода J-образной палочки диаметром 260 см 0,035 дюйма. Вводят этот узел через влагалище бедренной артерии.
ПРИМЕЧАНИЕ: При прохождении двух высокоточных датчиков давления (HFPS) через стандартный клапан гемостаза с поперечным разрезом может возникнуть риск кровотечения. Альтернативным подходом может быть использование двух отдельных направляющих катетеров, но для этого потребуется второй участок артериального доступа. Чтобы решить как проблему кровотечения, так и потребность в дополнительных местах доступа, можно выбрать либо двухпортовый клапан гемостаза, либо звездообразный клапан гемостаза. Эти альтернативы решают проблему кровотечения и устраняют необходимость в дополнительных точках доступа. После того, как направляющий катетер продвигается через артериальную оболочку, важно отметить, что боковой порт оболочки не позволяет измерять артериальное давление. Для измерения артериального давления необходимо подключить артериальный катетер к боковому порту адаптера клапана гемостаза направляющего катетера. - Продвигают проводник и направляют катетер в восходящую аорту под рентгеноскопическим контролем. Когда аортальный клапан будет идентифицирован, осторожно скрестите его проводником и введите направляющий катетер в ЛЖ. При необходимости используйте контраст для облегчения анатомического позиционирования. Проверьте трассы давления, чтобы подтвердить позиционирование НН.
- Снимите проводник, оставив направляющий катетер в LV. Промойте катетер после аспирации и убедитесь, что в катетере нет пузырьков воздуха.
- Переместите уже откалиброванный HFPS через один из портов двойного клапана гемостаза в LV. На корпус катетера можно нанести метку стерильной ручкой, чтобы знать, когда она выходит из наконечника направляющего катетера. В качестве альтернативы, подтверждение четкого сигнала желудочкового давления является признаком выхода из направляющего катетера (интерференция сигнала наблюдается, когда HFPS находится внутри направляющего катетера).
- Продвиньте второй HFPS через другой порт двойного клапана гемостаза в LV.
- Втяните направляющий катетер обратно в восходящую аорту дистально к рентгеноконтрастному маркеру, расположенному на месте бандажирования, оставив один из HFPS в ЛЖ. Подтвердите положение катетера с помощью надавливаний.
ПРИМЕЧАНИЕ: HFPS следует подключить к системе регистрации и поместить в стерильный физиологический раствор не менее чем на 30 минут перед использованием, чтобы датчик давления уравновесился. Перед введением HFPS в направляющий катетер убедитесь, что давление обнулено, поместив датчик на поверхность стерильного физиологического раствора. - Накройте место сосудистого доступа стерильной простыней и переместите к грудной клетке, чтобы сузить аорту.
5. Бандажирование (сужение) восходящей аорты
- Слегка потяните за нейлоновую ленту (вариант 1) или трансплантат из вспененного ПТФЭ (вариант 2), чтобы убедиться, что HFPS правильно расположен - давление ЛЖ должно повышаться, в то время как давление в аорте дистальнее бандажа (рентгеноконтрастный маркер) не должно увеличиваться.
- Если катетер расположен неправильно, отрегулируйте положение HFPS, чтобы обеспечить четкую регистрацию проксимального и дистального давления в месте сужения.
- Вариант 1: затяните нейлоновую ленту до тех пор, пока она не будет плотно прилегать к аорте.
- Закрывайте нейлоновую ленту по одному щелчку за раз, внимательно контролируя давление. После каждого щелчка дайте давлению стабилизироваться.
- Постепенно закрывайте нейлоновую ленту, пока не будет достигнут желаемый градиент давления. Мишенью является градиент примерно 100 мм рт.ст., при этом конечные диастолические давления в левом желудочке не превышают 25 мм рт.ст.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если достигнутый градиент составляет чуть менее 100 мм рт.ст. (т.е. между 90-95 мм рт.ст.), воздержитесь от дальнейшего затягивания нейлоновой ленты. В этой ситуации очень важно не переусердствовать. Однако, если нейлоновая лента случайно чрезмерно натянута во время процедуры или после стабилизации, можно использовать костные резцы (см. Таблицу материалов), чтобы разрезать нейлоновую ленту, а затем повторить предыдущие процедуры (шаг 3.11 и шаг 5.3), чтобы отрегулировать и достичь соответствующего градиента давления. - Поместите кусок стерильной пластиковой трубки на конец нейлоновой ленты, чтобы избежать случайного повреждения окружающих конструкций.
- Вариант 2: аппроксимировать концы из вспененного ПТФЭ и сужать ленту с помощью щипцов под углом 45°, контролируя давление, чтобы оценить взаимное расположение сужения.
- Поместите титановый гемозажим в положение щипцов (зажим двух концов трансплантата из вспененного ПТФЭ оставит на нем след, служащий для направления положения гемоклипсы).
- Проверьте градиент давления. Если градиент оптимальный, подтвердите предыдущее положение гемоклипсы, поместив второй гемоклипс непосредственно над предыдущим (это не увеличит сужение, но предотвратит дистальное проскальзывание клипсы).
- Если градиент недостаточен, поместите дополнительную клипсу под предыдущую клипсу (еще больше сужая аорту). Делайте это до тех пор, пока градиент не станет оптимальным. Если градиент слишком большой, используйте аппликатор клипа, чтобы удалить клип и поместить другой более дистально.
- Обрежьте концы трансплантата из вспененного ПТФЭ, чтобы избежать слишком большого количества трансплантата в грудной клетке, и пришите трансплантат к проксимальной стороне аорты с помощью шва 5,0 (см. Таблицу материалов), чтобы избежать дистального смещения трансплантата.
- Подождите 15 минут после установки бандажа, чтобы стабилизировать давление и определить, остается ли градиент оптимальным или установится декомпенсация и острое разрушение. Если гипотензия возникает без спонтанного разрешения, весьма вероятно, что ЛЖ декомпенсирует, и требуется облегчение бандажа.
- Закройте перикард шовным материалом 3-0 PDS II (см. таблицу материалов).
- Установите дренаж грудной клетки и подключите его к хирургическому аспиратору. Увеличьте PEEP до 10 смH2O, чтобы начать рекрутировать любое легкое, которое пострадало от ателектаза.
- Закрыть грудную стенку послойно, наложив шов 3-0 PDS II.
- Закрывают последний мышечный шов, снимая дренаж грудной клетки и прекращая вентиляцию по окончании выдоха высоким давлением (вручную доводя до 20-30 смН2О).
- Возобновите нормальную вентиляцию и закройте кожу с помощью шва 3-0 PDS II с внутрикожным рисунком после промывания операционной раны йодом-повидоном.
- Снимите кати Микро (см. Таблицу материалов) и проверьте поверхностное давление, чтобы учесть дрейф давления во время процедуры.
- Извлеките направляющий катетер.
- Снимите оболочку интродьюсера и примените ручную компрессию, чтобы закрыть артериотомию. Приложите компрессию к месту доступа не менее чем на 10 минут. Оценивают участок на предмет гемостаза, медленно снимая давление и подтверждая отсутствие кровотечения или образования гематомы.
- Наложите шов на место прокола, при необходимости наложив рассасывающийся шов.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости в это время быстрая трансторакальная эхокардиограмма может помочь определить, хорошая ли сердечная функция, и позволить оценить градиент аортального давления. Хотя в этом нет необходимости (поскольку градиент давления был измерен с помощью высокоточных датчиков давления), градиент, полученный на основе эхо-сигнала, можно использовать для сравнения модели с клиническими данными. Обратите внимание, что из-за операции качество изображения будет нарушено. - Прекратите анестезию и экстубируйте животное, как только будет обнаружена спонтанная вентиляция легких. Отключите животное от аппарата искусственной вентиляции легких и убедитесь, что через эндотрахеальную трубку проходит надлежащий поток воздуха и что периферическая оксигенация не нарушена.
- Экстубируйте и при необходимости наложите Геделя.
- Удалите катетер периферических вен.
- Наблюдайте за животным в течение не менее 15 минут, контролируя ЭКГ/частоту сердечных сокращений и периферическую оксигенацию.
- Если животное стабильно, отведите его в чистый загон для восстановления с повышенной температурой окружающей среды. Используйте портативное устройство для определения жизненно важных показателей (см. Таблицу материалов) для непрерывного мониторинга частоты сердечных сокращений и сатурации до тех пор, пока животное не придет в сознание.
- Наблюдайте за животными в течение желаемого периода времени и выполняйте трансторакальную эхокардиографию или анализ петли давления-объема для определения сердечной функции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Во время первоначальной разработки модели уровень смертности составлял примерно 30%, при этом животные умирали от острой сердечной недостаточности после бандажирования и хирургических осложнений. Однако после того, как модель была создана, хирургические осложнения стали встречаться реже, и уровень смертности снизился примерно до 15%. Две смерти, которые произошли, произошли из-за разрыва аорты во время расслоения.
Использование высокоточных датчиков давления позволяет получать высококачественные сигналы давления (рис. 2), позволяющие проводить точную калибровку стеноза в режиме реального времени. Это гарантирует, что все прооперированные животные испытывают одинаковую степень перегрузки давлением в левом желудочке, что снижает вариабельность внутри группы. Кроме того, сам катетер имеет стержень 2,3 F, который оказывает минимальное влияние на препятствие потоку по сравнению с более крупными катетерами, заполненными жидкостью. После первоначальных инвестиций катетеры можно использовать многократно, а при необходимости стерилизации можно использовать окись этилена (обычно доступную в сотрудничестве с хирургическими отделениями больницы).
Трансстенотический градиент может быть рассчитан в режиме реального времени с помощью программного обеспечения, которое измеряет разницу давлений между левым желудочком (проксимальное давление) и дистальным отделом аорты (дистальное давление). Несколько минут стабилизации между каждым этапом сужения гарантируют, что левый желудочек успеет адаптироваться. После определения желаемой степени сужения следует применить 15-минутный стабилизационный период, чтобы гарантировать, что степень кольцевания остается стабильной и животное компенсируется (Рисунок 2А).
Этот подход превосходит другие методики, которые не измеряют трансстенозный градиент в режиме реального времени и не имеют как однородности одинакового градиента между всеми животными (92,3 ± 2,3 мм рт.ст., среднее значение и стандартная ошибка среднего значения, соответственно, для 7 прооперированных животных), так и жесткого мониторинга давления в левом желудочке. Кроме того, этот подход позволяет избежать трудностей, связанных с выполнением трансторакальной эхокардиографии у свиней, особенно у некоторых пород, таких как вьетнамская пузатая свинья, у которой грудина значительно выступает.
Трансторакальная эхокардиография может подтвердить бандажирование аорты как сразу после операции, так и в периоды наблюдения (рис. 3). Операция бандажирования приводит к значительному стенозу аорты с турбулентным потоком, который может быть качественно оценен или количественно определен с помощью непрерывной допплерографии. На рисунке 2 представлены репрезентативные изображения 2-месячной эхокардиографии, показывающие значительный аортальный стеноз (верхний ряд) и концентрическую гипертрофию левого желудочка (средний и нижний ряды). Через два месяца после кольцевания у животных развивается значительная гипертрофия сердца. Макроскопическая оценка показала увеличение сердца и более толстую стенку левого желудочка (рис. 4). Двухмесячный период наблюдения был определен на основе темпов роста используемых животных, так как более длительный период наблюдения привел бы к тому, что животные были бы слишком большими, чтобы их можно было обрабатывать нашей инфраструктурой.
Рисунок 1: Схема протокола бандажирования аорты. После получения 20-25 кг свиней-самцов животных отправляют на 1-недельный карантинный период. В день процедуры животным делают анестезию, катетеризируют ЛЖ и аорту, устанавливают высокоточные датчики давления, после чего проводят бандажирование аорты и восстановление животного. Вся процедура, после освоения, длится около 2 часов. Через два месяца после операции животных подвергают заключительному обследованию, включающему сбор образцов и измерение физиологических показателей. АБ-бандажирование аорты, АО-аорта, ЛЖ-левый желудочек, ВП-давление-объем, РГК-катетеризация правых отделов сердца, УЗИ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Измерения давления во время бандажирования аорты. (A) Репрезентативные следы ЛЖ и аортального давления (дистальнее бандажирования) во время бандажирования аорты. Увеличьте масштаб ЛЖ и аортального давления до (В) и после (С) сужения, показав создание градиента (разница между пиковым систолическим ЛЖ и аортальным давлением). (D) Отрыв датчика давления в желудочках, переход от проксимального отдела аорты к бандажу к аорте дистальнее бандажа. AP - артериальное давление, LVP - давление в левом желудочке, MC - высокоточный датчик давления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Трансторакальная эхокардиография. При наблюдении через 2 месяца после операции выявлен значительный стеноз аорты (черная стрелка, верхний ряд). Гипертрофия ЛЖ проявляется, как в 2D (белые стрелки, средний ряд), так и в М-режиме, который также демонстрирует концентрическую гипертрофию (белые стрелки, нижний ряд). Вертикальная полоса соответствует 3 см, а 2D-изображения PSAX были получены на глубине 15 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Посмертный макроскопический анализ сердца. Бандажирование аорты приводит к кардиомегалии, с явной гипертрофией стенки ЛЖ. Сердечные срезы имеют основание, среднюю полость и вершину слева направо. Спайки перикарда можно увидеть по всему эпикарду. Масштабные линейки обозначают 1 см (верхний ряд) и 4 см (нижний ряд). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В последние годы в нескольких исследованиях хирургическое бандажирование аорты использовалось в качестве модели перегрузки левым желудочковым давлением и сердечной недостаточности (нисходящее9 к восходящей аорте10), что позволило исследователям получить различные фенотипы, адаптированные к их конкретным потребностям. Хотя использование таких моделей требует дорогостоящего оборудования и специальных знаний, информация, которую они предоставляют, бесценна. Свиньи, благодаря своим размерам и схожести с человеческим сердцем, служат идеальной моделью11, получая этическое признание в качестве доноров органов для ксенотрансплантации.
Основным критическим этапом в этом методе является рассечение аорты и размещение вокруг нее бандажного материала (нейлонового кабеля или трансплантата из вспененного ПТФЭ). Во время этого этапа может возникнуть несколько осложнений, включая разрыв или разрыв окружающих структур или самой аорты. Контроль таких осложнений может быть достигнут путем наложения на отверстие шва с нитью или матрасного шва с закладками, если кровотечение можно контролировать, чтобы правильно визуализировать рану. Настоятельно рекомендуется, чтобы процедура проводилась кардиоторакальным хирургом, что значительно снижает уровень осложнений и смертности.
Еще одним важным этапом является сужение аорты, которое должно выполняться последовательно с периодами стабилизации между ними. Пристальное внимание к системному периферическому давлению имеет решающее значение, так как устойчивая значительная гипотензия (среднее артериальное давление ниже 60 мм рт. ст.) может быть результатом неспособности ЛЖ справиться с текущим стенозом. Если не решить проблему, особенно когда давление в желудочках также начнет падать, острая сердечная недостаточность приведет к потере животного. Удаление нейлонового троса или титанового зажима необходимо, когда гипотония не проходит самопроизвольно.
Однако основным ограничением этой модели, как и многих других моделей бандажирования аорты, является расположение бандажа относительно коронарного устья. Наложение надкоронарного бандажа не полностью имитирует аортальный стеноз и может привести к повышению артериального давления в коронарном кровообращении, что может быть защитным12. Ограниченные данные свидетельствуют об отсутствии различий между субкоронарным и супракоронарным бандажированием аорты у свиней13, что указывает на то, что повышенные осложнения, связанные с операцией субкоронарного бандажирования, могут быть неоправданными.
В зависимости от используемого штамма животного и времени наблюдения, интернализация группы может стать проблемой. Хотя он в основном описан у грызунов14, он также наблюдался в легочной артерии свиней15. Использование сегментов трансплантата из вспененного ПТФЭ значительно увеличивает площадь контакта и исключает возникновение интернализации ленты. Тем не менее, трансплантаты из вспененного ПТФЭ стоят дороже, и при использовании медленно растущих пород, таких как вьетнамская пузатая свинья, интернализация ленты не является проблемой при использовании нейлоновых стяжек. Исследователи должны выбирать свой подход, исходя из используемой породы животных.
Для быстрорастущих пород долгосрочное наблюдение может быть затруднительным из-за размера животного (наличие инфраструктуры и оборудования, достаточно большого, чтобы справиться с животными весом >100 кг) и непомерно высоких затрат на содержание.
Еще одним ограничением этой модели, как и всех моделей, требующих доступа к перикардиальному пространству, является наличие значительных спаек перикарда после операции. Наш опыт не показывает разницы между закрытием или незакрытием разреза перикарда после установки бандажа. Хотя это не влияет на функцию, рассечение сердца и идентификация различных структур становится более трудоемким, и эпикард, скорее всего, будет поврежден, если перикард полностью разделен.
Этот минимально инвазивный метод представляет собой значительное усовершенствование типичной хирургической процедуры, что приводит к более быстрому выздоровлению без осложнений и быстрее. Использование двух высокоточных катетеров для одновременного измерения давления и измерения градиента в режиме реального времени значительно повышает точность процедуры и воспроизводимость модели, что приводит к сокращению необходимого количества животных. Модель может быть применена для изучения новых терапевтических вмешательств или устройств, направленных на гипертрофию левого желудочка, а также для определения новых патофизиологических механизмов, связанных с перегрузкой левым желудочковым давлением.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана и профинансирована в рамках проекта QREN 2013/30196, банковского фонда «la Caixa», проекта Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), LCF/PR/HP17/52190002. JS и EB были поддержаны программой исследований и инноваций Европейского Союза «Горизонт 2020» в рамках грантового соглашения No 813716 имени Марии Склодовской-Кюри. PdCM был поддержан проектом Stichting Life Sciences Health (LSH)-TKI MEDIATOR (LSHM 21016).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 PDS II suture | Ethicon | Z683G | Aorta banding |
| 5-0 prolene | Ethicon | 7472H | Aorta banding |
| ACUSON NX2 Ultrasound System | Siemens | (240)11284381 | Vascular Access and Echocardiography |
| Arterial Extension 200 cm | PMH | 303.0666 | Anesthesia Maintenance |
| Atlan A300 Ventilator | Draeger | 8621300 | Ventilation |
| Bone cutters | Fehling | AMP 367.00 | Aorta banding |
| Cefazolin 1000 mg | Labesfal | 100063 | Antibiotic |
| Chlorhexidine 4% Wash Solution | AGA | 19110008 | Cleaning |
| Doyen Intestinal Forceps | Aesculap | EA121R | Intubation |
| Echogenic Introducer Needle | Teleflex | AN-04318 | Vascular Access |
| Endotracheal tube | Intersurgical | 8040070 | Intubation |
| ePTFE vascular graft (5 mm x 40 cm) | GORE-TEX | S0504 | Aorta banding |
| Extension line 100 cm | PMH | 303.0394 | Anesthesia Induction |
| F.O. Laryngoscope | Luxamed | E1.317.012 | Intubation |
| F.O. Miller Blade 4 204 x 17 mm | Luxamed | 3 | Intubation |
| Fenestrated Sterile Drape | Bastos Viegas | 4882-256 | Aseptic Technique |
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | B.Braun | 5758883 | Anesthesia / Analgesia |
| Guidewire 260 cm J-tip | B.Braun | J3 FC-FS 260-035 | Left Ventricle catheterization |
| Infusomat Space Infusion Pump | B.Braun | 24101800 | Fluids / Drug administration |
| Intercostal retractor | Fehling Surgical | MRP-1 | Thoracotomy |
| Introcan Certo IV Catheter 20G | B.Braun | 4251326 | Fluids / Drug administration |
| Isotonic Saline Solution 0.9% | B.Braun | 5/44929/1/0918 | Fluids / Drug administration |
| Ketamidor 100 mg/mL | Richter pharma | 1121908AB | Anesthesia Induction |
| L10-5v Linear Transducer | Siemens | 11284481 | Vascular Access |
| Midazolam 15 mg/3 mL | Labesfal | PLB762-POR/2 | Anesthesia Induction |
| Mikro-cath | Millar | 63405(1) | Pressure recording |
| MP1 guide catheter 6 Fr | Cordis | 67027000 | Left Ventricle catheterization |
| Needle Holder | Fehling Surgical | ZYY-5 | Aorta banding |
| Non-woven adhesive | Bastos Viegas | 442-002 | Fluids / Drug administration |
| P4-2 Phased Array Transducer | Siemens | 11284467 | Echocardiography |
| Perfusor Compact Syringe Perfusion Pump | B.Braun | 8717030 | Fluids / Drug administration |
| Pressure Signal Conditioner | ADinstruments | PCU-2000 | Pressure recording |
| Propofol Lipuro 2% | B.Braun | 357410 | Anesthesia Maintenance |
| Radifocus Introducer II Standard Kit B - Introducer Sheath | Terumo | RS+B60K10MQ | Vascular Access |
| Radiopaque marker | Scanlan | 1001-83 | Aorta banding |
| Scissors | Fehling Surgical | Thoracotomy | |
| Skinprep (Chlorhexidine 2% / 70% Isopropyl alcohol) | Vygon | SKPC015ES | Disinfection |
| Stopcock manifold (3 ports) | PMH | 310.0489 | Fluids / Drug administration |
| Straight forceps | Fehling Surgical | ZYY-1 | Thoracotomy |
| Stresnil 40 mg/mL | ecuphar | 572184.2 | Anesthesia Induction |
| Syringe Luer Lock 20 cc | Omnifix B.Braun | 4617207V | Anesthesia Induction |
| Syringe Luer Lock 50 cc | Omnifix B.Braun | 4617509F | Anesthesia Maintenance |
| Transdermal fentanyl Patch 50 mcg/h | Mylan | 5022153 | Analgesia |
| Ultravist | Bayer | KT0B019 | Angiography |
| Universal Hemostasis Valve Adapter | Merit Medical | UHVA08 | Left Ventricle catheterization |
| Velcro Limb Immobilizer | PMH | SU-211 | Animal stabilization |
| Venofix A, 21 G | B.Braun | 4056337 | Anesthesia Induction |
| Vista 120S Patient Monitor | Draeger | MS32997 | Monitoring |
| Weck titanium clip | Teleflex | 523760 | Aorta banding |
| Weck titanium clip applier | Teleflex | 523166 | Aorta banding |
| Zhiem Vision | Iberdata | N/A | Fluoroscopy |
References
- Savarese, G., et al. Global burden of heart failure: a comprehensive and updated review of epidemiology. Cardiovascular Research. 118 (17), 3272-3287 (2023).
- Hartley, A., et al. Trends in mortality from aortic stenosis in Europe: 2000-2017. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 748137 (2021).
- Silva, K. A. S., Emter, C. A. Large Animal models of heart failure: a translational bridge to clinical success. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 5 (8), 840-856 (2020).
- Brink, C. B., Lewis, D. I. The 12 Rs framework as a comprehensive, unifying construct for principles guiding animal research ethics. Animals (Basel). 13 (7), 1128 (2023).
- Choy, J. S., Zhang, Z. D., Pitsillides, K., Sosa, M., Kassab, G. S. Longitudinal hemodynamic measurements in swine heart failure using a fully implantable telemetry system. PLoS One. 9 (8), 103331 (2014).
- Ishikawa, K., et al. Increased stiffness is the major early abnormality in a pig model of severe aortic stenosis and predisposes to congestive heart failure in the absence of systolic dysfunction. Journal of the American Heart Association. 4 (5), 001925 (2015).
- Emter, C. A., Baines, C. P. Low-intensity aerobic interval training attenuates pathological left ventricular remodeling and mitochondrial dysfunction in aortic-banded miniature swine. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (5), H1348-H1356 (2010).
- Brito, J., Raposo, L., Teles, R. C. Invasive assessment of aortic stenosis in contemporary practice. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 9, 1007139 (2022).
- Tan, W., et al. A Porcine model of heart failure with preserved ejection fraction induced by chronic pressure overload characterized by cardiac fibrosis and remodeling. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 677727 (2021).
- Bikou, O., Miyashita, S., Ishikawa, K. Pig model of increased cardiac afterload induced by ascending aortic banding. Methods in Molecular Biology. 1816, 337-342 (2018).
- Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (5), 432-438 (2014).
- Tian, L., et al. Supra-coronary aortic banding improves right ventricular function in experimental pulmonary arterial hypertension in rats by increasing systolic right coronary artery perfusion. Acta Physiologica (Oxf). 229 (4), 13483 (2020).
- Sorensen, M., Hasenkam, J. M., Jensen, H., Sloth, E. Subcoronary versus supracoronary aortic stenosis. An experimental evaluation. Journal of Cardiothoracic Surgery. 6, 100 (2011).
- Lygate, C. A., et al. Serial high resolution 3D-MRI after aortic banding in mice: band internalization is a source of variability in the hypertrophic response. Basic Research in Cardiology. 101 (1), 8-16 (2006).
- Jalal, Z., et al. Unexpected Internalization of a Pulmonary Artery Band in a Porcine Model of Tetralogy of Fallot. World Journal for Pediatric and Congenital Heart Surgery. 8 (1), 48-54 (2017).
