Summary
Denne protokollen gir både kvalitative og kvantitative analyser av totale sideroforer, pyoverdin og pyochelin fra Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) er kjent for sin produksjon av et mangfoldig utvalg av virulensfaktorer for å etablere infeksjoner i verten. En slik mekanisme er rensing av jern gjennom sideroforproduksjon. P. aeruginosa produserer to forskjellige sideroforer: pyochelin, som har lavere jernchelaterende affinitet, og pyoverdin, som har høyere jernchelaterende affinitet. Denne rapporten viser at pyoverdin kan kvantifiseres direkte fra bakterielle supernatanter, mens pyochelin må ekstraheres fra supernatanter før kvantifisering.
Den primære metoden for kvalitativt analyse av siderophoreproduksjon er Chrome Azurol Sulfonate (CAS) agarplateanalysen. I denne analysen fører frigjøringen av CAS-fargestoff fra Fe3+-Dye-komplekset til en fargeendring fra blå til oransje, noe som indikerer sideroforproduksjon. For kvantifisering av totale sideroforer ble bakterielle supernatanter blandet i like store mengder med CAS-fargestoff i en mikrotiterplate, etterfulgt av spektrofotometrisk analyse ved 630 nm. Pyoverdin ble direkte kvantifisert fra bakteriell supernatant ved å blande den i like store mengder med 50 mM Tris-HCl, etterfulgt av spektrofotometrisk analyse. En topp på 380 nm bekreftet tilstedeværelsen av pyoverdine. Når det gjelder Pyochelin, var direkte kvantifisering fra bakteriell supernatant ikke mulig, så det måtte ekstraheres først. Påfølgende spektrofotometrisk analyse viste tilstedeværelsen av pyochelin, med en topp på 313 nm.
Introduction
Organismer krever jern for å utføre ulike vitale funksjoner, for eksempel elektrontransport og DNA-replikasjon1. Pseudomonas aeruginosa, et gramnegativt opportunistisk patogen, er kjent for å ha en rekke virulensfaktorer for å etablere infeksjon i verten, blant annet en mekanisme er siderofordannelse2. Under jernnedbrytende forhold frigjør P. aeruginosa spesialiserte molekyler kalt siderophorer, som slukker jern fra omgivelsene. Siderophores chelate jern ekstracellulært, og det resulterende ferric-siderophore komplekset transporteres aktivt tilbake til cellen3.
P. aeruginosa er kjent for å produsere to sideroforer, pyoverdine og pyochelin. Pyoverdin er kjent for å ha en høyere jernchelaterende affinitet (1: 1), mens pyochelin er kjent for å ha en mindre jernchelaterende affinitet (2: 1) 4. Pyochelin kalles også en sekundær siderophore fordi den har en lavere jernchelaterende affinitet5. Produksjon og regulering av sideroforer styres aktivt av Quorum Sensing (QS) systemer i P. aeruginosa6.
I tillegg til jernslukking er sideroforer også involvert i regulering av virulensfaktorer og spiller en aktiv rolle i biofilmdannelse7. Siderophores tjener ytterligere viktige roller, inkludert involvering i cellesignalering, forsvar mot oksidativt stress og tilrettelegging av interaksjoner mellom mikrobielle samfunn8. Siderophores er vanligvis kategorisert basert på de spesifikke funksjonelle gruppene som de chelaterer jern gjennom. De tre primære bidentatligandene i denne klassifiseringen er catecholate, hydroxamate og α-hydroxycarboxylate3. Pyoverdiner er kjennetegn på fluorescerende Pseudomonas-arter som P. aeruginosa og P. fluorescens5. De består av en blandet grønn fluorescerende kromofor koblet til et oligopeptid inneholdende 6-12 aminosyrer. Flere ikke-ribosomale peptidsyntetaser (NRP) er involvert i deres syntese9. Fire gener involvert i pyoverdinproduksjon og regulering er pvdL, pvdI, pvdJ og pvdD10. Pyoverdine er også ansvarlig for infeksjon og virulens hos pattedyr11. P. aeruginosa er kjent for å produsere pyochelin under moderate jernbegrensende forhold, mens pyoverdin produseres under alvorlige jernbegrensende miljøer12. To operoner involvert i pyochelinproduksjon er pchDCBA og pchEFGHI13. Det bemerkes at i nærvær av pyocyanin induserer pyochelin (katkolat) oksidativ skade og betennelse og genererer hydroksylradikaler, som er skadelige for vertsvev11.
Chrome Azurol Sulfonate (CAS) analysen er allment vedtatt på grunn av sin omfattende, høye følsomhet og større bekvemmelighet sammenlignet med mikrobiologiske analyser, som, selv om de er følsomme, kan være altfor spesifikke14. CAS-analysen kan utføres på agaroverflater eller i en løsning. Den er avhengig av fargeendringen som oppstår når jernionet overgår fra sitt intense blå kompleks til oransje. CAS-kolorimetrisk analyse kvantifiserer uttømmingen av jern fra et Fe-CAS-surfaktant ternært kompleks. Dette spesielle komplekset, bestående av metall, organisk fargestoff og overflateaktivt middel, har en blå farge og utviser en absorpsjonstopp ved 630 nm.
Denne rapporten presenterer en metode for kvalitativ påvisning av sideroforproduksjon, hvor man kan oppdage produksjonen av sideroforer på en agarplate. En metode for kvantitativ estimering av total sideroforproduksjon i en mikrotiterplate og deteksjon og kvantitativ analyse av to sideroforer, pyoverdin og pyochelin, fra P. aeruginosa, er også gitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle bakterieisolater av P. aeruginosa ble hentet fra medisinske mikrobiologiske laboratorier fra Vadodara og Jaipur, India. Alle utvalgte kliniske isolater ble håndtert i Biosafety Cabinet (BSL2) og ytterste forsiktighet ble tatt ved håndtering av bakterieisolater under forsøkene. De kommersielle detaljene for alle reagensene/løsningene er gitt i materialfortegnelsen.
1. Fremstilling av Chrome Azurol Sulfonate (CAS) fargestoff og agar media
- Forbered CAS-fargestoff (100 ml) med følgende sammensetning:
- Løs opp 60 mg CAS i 50 ml destillert vann (oppløsning 1).
- Løs opp 2,7 mg FeCl3·6H2O i 10 ml 10 mM HCl (oppløsning 2).
- Løs opp 73 mg cetrimoniumbromid (HDTMA) i 40 ml destillert vann (oppløsning 3).
- Bland forsiktig løsning 1, løsning 2 og løsning 3. Oppbevar den i en glassflaske.
- Forbered CAS-agar ved å følge trinnene nedenfor:
- Tilsett 100 ml MM9 saltoppløsning til 750 ml destillert vann.
- Løs opp 32,24 g piperazin-N,N'-bis(2-etansulfonsyre) (PIPES) fri syre.
- Tilsett 15 g Agar agar. Autoklav og la den avkjøles.
- Tilsett 30 ml steril Casaminosyreoppløsning og 10 ml steril 20% glukoseoppløsning til blandingen.
- Tilsett 100 ml CAS-fargestoff, bland og hell det under aseptiske forhold.
MERK: Fremstilling av MM9-medier, Casaminosyre-oppløsning og 8-hydroksykinolin er gitt i tilleggsfil 1. PIPES-bufferen er pH-følsom. Det vil ikke oppløses før pH 5,6 er oppnådd. Sørg for at pH overvåkes kontinuerlig, fordi når PIPES begynner å oppløses i vann, vil det senke pH-verdien ytterligere. Ekstraher Casaminosyre med samme volum av 3% 8-hydroksykinolin oppløst i kloroform. La den ikke-blandbare oppløsningen ligge ved 4 °C i ca. 20 minutter og samle forsiktig opp den øvre fasen av oppløsningen uten å forstyrre den nedre fasen.
2. Kvalitativ analyse av produksjonen av sideroforer
- Sett OD600 nm til 0,2 for 24 timers dyrkede kulturer av P. aeruginosa.
- Bruk en steril trådløkke til å strippe bakteriekulturen på en CAS-agarplate.
- Inkuber ved 30 °C i 24 timer.
MERK: Peptone vannmedier eller 0,8% vanlig saltvann kan brukes til å fortynne bakteriekulturen. Hvis ingen bakterievekst observeres ved 24 timer, inkuber CAS-plater i 48 til 72 timer.
3. Kvantitativ estimering av totale sideroforer
- Re-inokulere 24-h-dyrkede kulturer av P. aeruginosa i Peptone vannmedier etter justering OD600 nm til 0,25, og inkubere ved 30 ° C i 48 timer.
- Etter 48 timer, sentrifuger bakteriekulturen ved 4650 x g i 10 minutter ved romtemperatur.
- Etter sentrifugering, tilsett 100 μL cellefri supernatant til en 96-brønns mikrotiterplate og tilsett 100 μL CAS-fargestoff til den.
- Dekk platen med aluminiumsfolie og inkuber ved romtemperatur i 20 minutter.
- Etter inkubasjon, ta spektrofotometriske avlesninger ved 630 nm.
- Beregn resultatene oppnådd for kvantifisering av totale siderophores som Prosent Siderophore Unit (PSU).
MERK: PSU kan beregnes som: [(Ar - As) / Ar] x 100
hvor, Ar = absorbans av referansen ved 630 nm, As = absorbans av prøvens cellefrie supernatant. For referansen bør CAS-fargestoff tilsettes ikke-inokulert peptonvannmedier. Fyll alt glass, for eksempel reagensrør, kolber, etc., med 6 M HCl i 2 timer og skyll dem to ganger med destillert vann for å fjerne spor av jern på dem.
4. Kvantitativ estimering av pyoverdin
- Re-inokulere 24-h-dyrkede kulturer av P. aeruginosa i Peptone vannmedier etter justering OD600 nm til 0,25 og inkubere ved 30 ° C i 48 timer.
- Etter 48 timer måler du OD600 nm av bakterieveksten før du fortsetter videre.
- Sentrifuger bakteriekulturen ved 4650 x g i 10 minutter ved romtemperatur.
- Etter sentrifugering, tilsett 100 μL cellefri supernatant til en 96-brønns mikrotiterplate og tilsett 100 μL 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) til den.
- Ta spektrofotometriske avlesninger ved OD405 nm.
5. Pyochelin ekstraksjon og spektrofotometri
- Re-inokulere 24-h-dyrket kulturer av P. aeruginosa i King's B media (tilleggsfil 1) etter justering OD600 nm til 0,25 og inkubere ved 30 ° C i 24 timer.
- Etter 24 timer, ta 100 ml kultur og sentrifuge ved 4650 x g i 10 minutter ved romtemperatur.
- Etter sentrifugering, tilsett 5 ml 1 M sitronsyre til supernatanten. Trekk ut to ganger med 50 ml etylacetat.
- Filtrer den organiske fasen med magnesiumsulfat gjennom et sprøytefilter. Oppbevar den filtrerte organiske fasen ved -20 °C.
- Ta spektrofotometriske avlesninger ved 320 nm.
MERK: Siden pyochelin er en svært ustabil forbindelse ved romtemperatur, utfør ekstraksjonsprosessen på is. Bruk en 50 ml sprøyte til filterseparasjon. Plasser bomull på sprøytens spiss og tilsett 1 g magnesiumsulfat på den. Fest et sterilt sprøytefilter på sprøytespissen og samle filtratet i et sterilt rør.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før kvantifisering av sideroforer fra kliniske isolater ble det gjort en kvalitativ screening for sideroforproduksjon for å sikre produksjon av sideroforer. Kvalitativ påvisning av sideroforer fra kliniske isolater ble observert ved stripebakterier på CAS-agarplater. Tre kliniske isolater, nemlig MR1, TL7, J3, sammen med PAO1 (referansestammen), ble valgt for studien. Alle tre kliniske isolater og PAO1 viste positive resultater for sideroforproduksjon, der en klar oransje glorie rundt bakterieveksten på den blå agaroverflaten indikerte positiv sideroforproduksjon (figur 1). Haloformasjonen på CAS-agar (figur 1) ga en grov estimering av sideroforproduksjonen med kliniske isolater. Derfor ble det utført kvantitativ estimering av sideroforproduksjon ved bruk av CAS-reagens og flytende medier.
Total sideroforkvantifisering ble utført direkte fra den cellefrie supernatanten. Etter inkubasjon ble det observert en fargeendring der gul farge indikerte fjerning av CAS-fargestoff fra Fe-komplekset. Her ble CAS-fargestoff med uninokulert vekstmedium brukt som kontroll, noe som ble tatt for beregningen av sideroforer. Det var ingen signifikant forskjell i total sideroforproduksjon i isolatene MR1 og TL7, mens det var en signifikant total sideroforproduksjon i J3 sammenliknet med PAO1 (figur 2).
Deretter ble pyoverdinkvantifisering utført direkte fra cellefrie supernatanter. Pyoverdiner frigjøres i cellemiljøer, så den cellefrie supernatanten ble brukt til pyoverdinkvantifisering. Det ble også utført en UV-områdeskanning med spektrofotometeret, der toppen ved 380 nm bekreftet tilstedeværelsen av pyoverdin (figur 3A). Spektrofotometriske målinger ble tatt ved 405 nm, og resultatene ble tolket som OD405 / OD600 nm. Alle isolatene viste pyoverdinproduksjon, der isolatene MR1 og J3 viste signifikant lavere pyoverdin sammenlignet med PAO1, mens det ikke ble observert noen signifikant forskjell for TL7 (figur 3B).
Pyochelin kan ikke kvantifiseres direkte fra den cellefrie supernatanten. Det var ikke mulig å ekstrahere pyochelin fra 1 ml cellefri supernatant, så det ble ekstrahert fra 100 ml cellefri supernatant. Den ble syrnet med 1 M sitronsyre. Siden pyochelin er en svært ustabil forbindelse, ble ekstraksjonsprosessen utført på is. Pyochelin-deteksjon ble utført ved å kjøre en UV-områdeskanning fra et område på 300 til 600 nm, hvor toppen ved OD320 nm bekreftet tilstedeværelsen av pyochelin (figur 4A). Pyochelin kvantifisering ble utført ved å ta spektrofotometriske avlesninger ved OD320 nm. Beregningene ble gjort ved å dele OD320/OD600. Isolatene MR1, TL7 og J3 viste signifikant høyere produksjon av pyochelin sammenlignet med referanseisolatet PAO1 (figur 4B).
Sammenlignende sideroforproduksjon i ulike bakterielle vekstmedier ble utført for å kontrollere mengden av totale sideroforer produsert i ulike vekstmedier. Fire forskjellige medier ble valgt, hvor Luria-buljong, Kings B-media og Pepton-vann ble ekstrahert med 3% 8-hydroksykinolin, og uekstrahert Luria-buljong ble valgt for studien. Det var ingen signifikant forskjell mellom sideroforproduksjon i ekstrahert Luria-buljong, Kings B-medier og Pepton-vannmedier, mens en signifikant forskjell ble observert for sideroforproduksjon i ikke-ekstrahert Luria-buljong.
Figur 1: Sideroforproduksjon på CAS-agar. Vekst av P. aeruginosa på CAS-agarplater av 24-h-dyrket kultur ble oppdaget på CAS-agarplater og inkubert ved 30 °C i 24 timer. Siderophore tilstedeværelse er indikert av en oransje halo rundt bakteriekolonien (PAO1, MR1, TL7 og J3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Total sideroforproduksjon. Total sideroforproduksjon ble vurdert for PAO1 og tre kliniske isolater (MR1, TL7 og J3). 100 μL cellefri supernatant (av PAO1, MR1, TL7 og J3 dyrket i 24 timer i peptonvannbuljong) ble tilsatt til en 96-brønns mikrotiterplate, deretter tilsatt 100 μL CAS-fargestoff. Enveis ANOVA-test ble utført for statistisk signifikans. Feilfelt representerer ± standardavvik (SD) mellom tre biologiske replikater. *tilsvarer p < 0,05; NS tilsvarer p > 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Pyoverdinproduksjon. Pyoverdinproduksjon av P. aeruginosa-stamme PAO1 og kliniske isolater (MR1, TL7 og J3) vurdert etter 24 timers vekst i peptonvannmedier. Bakteriekulturene ble sentrifugert, og 100 μL cellefri supernatant ble tilsatt en 96-brønns mikrotiterplate. Deretter ble 100 μL av 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) tilsatt. Pyoverdin-deteksjon ble gjort ved UV-spektrofotometri med et område på 350 nm til 600 nm. Spektrometrisk analyse ved 380 nm pyoverdinproduksjon (A). Kvantifisering av pyoverdinproduksjon (B). Feilfelt angir standardfeilen i forhold til gjennomsnittet av triplikate eksperimenter. Feilfelt representerer ± SD mellom tre biologiske replikater. tilsvarer p < 0,0001, **tilsvarer p < 0,01, og ns tilsvarer p > 0,05 basert på enveis ANOVA-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Pyochelinproduksjon. Pyochelin produksjon av PAO1 (brukt som referanse) og kliniske isolater (MR1, TL7 og J3) ved bruk av ekstraksjon med etylacetat og magnesiumsulfat. Spektrofotometrisk analyse med et område fra 230 nm til 400 nm (A). Kvantifisering av pyochelin (B). Tre uavhengige eksperimenter ble utført for hvert isolat. Feilfelt representerer ± SD mellom tre biologiske replikater. tilsvarer p < 0,001 basert på enveis ANOVA-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Sammenlignende sideroforproduksjon i ulike bakterielle vekstmedier. Total sideroforproduksjon i fire forskjellige vekstmedier hvor Kings B-medier, Pepton-vannmedier og Luria-buljong ble ekstrahert med 3% 8-hydroksykinolin for å fjerne sporjern fra det, og Luria-buljong (ikke ekstrahert) ble valgt. Ekstraksjon med 3% 8-hydroksykinolin ble utført ved å tilsette et likt volum på 3% 8-hydroksykinolin til mediet. Feilfelt representerer ± SD mellom tre biologiske replikater. **tilsvarer p < 0,001, og ns tilsvarer p > 0,5 basert på enveis ANOVA-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Medieoppskrifter brukt i denne studien. Klikk her for å se filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen gjør det mulig for forskere å kvantifisere totale sideroforer og to forskjellige siderophorer av P. aeruginosa, nemlig pyoverdin og pyochelin, fra den bakterielle cellefrie supernatanten. I CAS-agarplateanalysen danner CAS-fargestoff og Fe3+-ioner et kompleks. Når bakterier produserer sideroforer, slukker de Fe3+-ioner fra CAS-Fe3+-komplekset, noe som fører til en fargeendring rundt bakterieveksten. Denne endringen resulterer i en klar oransje halo rundt bakterieveksten14,15. Selv om bakterier kan stripes direkte på CAS-agarplater, kan de samlede resultatene påvirkes. Streker et høyt antall bakterieceller kan skape en bred oransje halo rundt bakterieveksten, mens bruk av færre bakterieceller kan resultere i en smal klar sone. For å løse dette, streket vi et jevnt antall bakterieceller ved å justere OD600. Kresne bakterier kan vise resultater i 24 timer, mens sakte voksende bakterier kan ta mer enn 72 timer for å demonstrere siderophore produksjon.
For kvantitativ bestemmelse av totale sideroforer ble klassisk spektroskopi opprinnelig anvendt, noe som nødvendiggjør et betydelig volum supernatant for siderophoredeteksjon, noe som gjør det upraktisk. Kvantifiseringen av totale sideroforer utføres nå ved hjelp av en 96-brønns plate med en modifisert CAS-analyse. Denne tilnærmingen har resultert i en reduksjon i bruken av reagenser, bakteriell supernatant, tid og økt nøyaktighet sammenlignet med tradisjonelle spektroskopiske metoder16. Andre studier har også rapportert bruk av mikrotiterplater som en tidsbesparende og mer effektiv metode17. Kvantifisering av totale sideroforer ved hjelp av en mikrotiterplate har vist seg å være en effektiv tilnærming. I denne studien ble 48 timer gamle bakteriekulturer dyrket i jernfrie medier valgt for undersøkelse. En komparativ studie ble også utført for å vurdere siderophoreproduksjon i forskjellige vekstmedier, som Luria Broth, Luria Broth (ekstrahert med 3% 8-hydroksykinolin), King's B media (ekstrahert med 3% 8-hydroksykinolin) og Peptone vannmedier (ekstrahert med 3% 8-hydroksykinolin). Det ble observert at Pepton-vannmedier viste den høyeste mengden sideroforproduksjon, og dermed ble den valgt for videre eksperimenter. En graf som viser sideroforproduksjonen i ulike vekstmedier er inkludert i tilleggsfigur 1.
Pyoverdin kan detekteres og kvantifiseres ved hjelp av spektrofluorimetriske avlesninger, men bare pyoverdin er kjent for å utvise fluorescens. Pyoverdine i kompleks med Fe3+ ioner utviser ikke fluorescens18,19. For pyoverdindeteksjon og kvantifisering ble 48 timer gamle bakteriekulturer valgt for studier. P. aeruginosa er kjent for å produsere pyochelin under innledende jern-sultende forhold og bytter til pyoverdine produksjon etter eksponering for alvorlige jern-stress forhold. Det har blitt påvist at pyoverdin kan chelate andre metalliske kationer, som aluminium, gallium, mangan og krom, men bare jern blir vellykket transportert til cellemembranen19.
I likhet med totale sideroforer og pyoverdin, kan pyochelin ikke kvantifiseres direkte fra cellefri supernatant og må ekstraheres ved bruk av diklormetan20. Diklormetan er ublandbar med den cellefrie supernatanten og danner et eget lag nederst. I denne studien ble forskjellige næringsmedier testet, inkludert Luria-buljong, Peptonvann og Casaminosyre-medier, men en betydelig mengde pyochelin ble oppnådd fra Kings B-medier. Mens Hoegy et al. hadde brukt CAA-medier i protokollen, modifiserte vi den med Kings B-medier, da CAA-medier ikke støttet bakterievekst21. Metoden ble videre modifisert ved å ekstrahere næringsmedier med 8-hydroksykinolin for å fjerne eventuelle jernrester fra mediet, og skape et jernfattig medium. I tillegg ble inkubasjonstiden funnet å påvirke pyochelinproduksjonen betydelig. Dumas et al. viste at P. aeruginosa bytter fra pyochelin til pyoverdinproduksjon under alvorlige jernbegrensende forhold12. I denne studien ble pyochelin ekstraksjon og deteksjon utført fra 24 timer gamle bakteriekulturer, da pyochelin ikke ble påvist i 48-h kulturer. Volumet av supernatanten påvirker også pyochelin deteksjon, og dermed ble 100 ml cellefri supernatant brukt til ekstraksjon. Videre var pyochelinproduksjonen signifikant høyere i MR1-, TL7- og J3-isolater, muligens på grunn av bakteriestammer som ikke klarer å produsere pyoverdin til tross for at de har potente jernkelatorer22.
Ji et al. introduserte en ny og sensitiv tilnærming for pyochelin kvantifisering, validere den ved hjelp av LC / MS / MS. Denne metoden gjaldt imidlertid bare P . aeruginosa-isolater fra sputum hos pasienter med cystisk fibrose. LC / MS / MS, som er et kostbart oppsett, er kanskje ikke rimelig for de fleste laboratorier23. Visaggio et al. utviklet en bioluminescerende helcellebasert biosensor, som muliggjør rask, sensitiv og enkelttrinns pyochelinkvantifisering. Denne metoden kan likevel ikke gi kvantifisering for totale sideroforer og pyoverdin24.
Siderophore jernopptakssystemer kan ha en antimikrobiell applikasjon i legemiddellevering for multiresistente bakterier, da de spiller en avgjørende rolle i bakteriell overlevelse og virulens. Denne tilnærmingen kan tilby en ny måte å bekjempe multiresistente bakterier25. Legemidler som ikke kan trenge inn i bakteriell cellemembran, kan knyttes til en siderofor, og det resulterende Fe-siderophorkomplekset kan transporteres inne i bakteriemembranen26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfattere anerkjenner finansiering fra DBT - Biotechnology Teaching Program, DBT - BUILDER Program og FIST. MR takk fellesskap mottatt fra SHODH. HP takk fellesskap mottatt fra CSIR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Agar, Type I | HIMEDIA | GRM666 | |
| 8-Hydroxyquinoline | Loba Chemie | 4151 | |
| Casamino Acid | SRL Chemicals | 68806 | |
| Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) | HIMEDIA | RM4867-100G | |
| Chloroform | Merck | 1070242521 | |
| Chrome azurol sulfonate | HIMEDIA | RM336-10G | |
| Citric acid | Merck | 100241 | |
| Dextrose monohydrate | Merck | 108342 | |
| Dichloromethane | Merck | 107020 | |
| Ferric chloride hexahydrate | HIMEDIA | GRM6353 | |
| Glass Flasks | Borosil | 5100021 | |
| Glass Test-tubes | Borosil | 9820U05 | |
| Hydrochloric acid | SDFCL | 20125 | |
| King's medium B base | HIMEDIA | M1544-500G | |
| M9 Minimal Medium Salts | HIMEDIA | G013-500G | |
| Magnesium Sulphate | Qualigens | 10034 | |
| MultiskanGO UV Spectrophotometer | Thermo Scientific | 51119200 | |
| Peptone Type I, Bacteriological | HIMEDIA | RM667-500G | |
| PIPES free acid | MP Biomedicals | 190257 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| Proteose peptone | HIMEDIA | RM005-500G | |
| Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer | Shimadzu | 2072310058 | |
| Sigma Laborzentrifuge | Sigma-Aldrich | 3-18K | |
| Sodium chloride | Qualigens | 15915 |
References
- Wang, J., Pontopolous, K.
- Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).
- Ghssein, G., Ezzeddine, Z. A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline. Biology. 11 (12), 1711 (2022).
- Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process. Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).
- Cornelis, P., Dingemans, J. Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).
- Lin, J., Cheng, J., Shen, X. The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).
- Sass, G., et al. Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).
- Dao, K. -H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent. Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).
- Geum-Jae-Jeong,, et al. Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions. Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).
- Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments. Biological Sciences. 280 (1764), 20131055 (2013).
- Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of blue agar cas assay for siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).
- Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity. Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).
- Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores. Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).
- Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway. Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).
- Brandel, J., et al. a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes. Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).
- Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J.
- Cunrath, O., et al. The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges. Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).
- Ji, A. J., et al. A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients. Biomarkers & Applications. 4 (1), 135 (2019).
- Visaggio, D., et al. A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin. ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).
- Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).
- Il, J. M. R., Lin, Y. -M., Lu, Y., Miller, M. J. Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents. Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).
