Summary
Abstract
Metagenomic ספריות ארכיון שברים גדולים של רצפי הגנום של מיקרואורגניזמים רציף ללא צורך טיפוח מוקדמת. יצירת הליך יעיל ליצירה ההקרנה ספריות metagenomic ולכן הוא שימושי עבור תפוקה גבוהה חקירות יעיל לתוך המאפיינים גנטית מטבולית של חיידקים מכלולים שאין להם תרבות. הנה, פרוטוקולים מפתח מוצגים על וידאו, אשר אנו מציעים הוא פורמט שימושי ביותר עבור במדויק לתיאור תהליך ארוך לסירוגין תלוי מכשור רובוטיים (אדם) התערבות ידנית. ראשית, אנו מועסקים רובוטיקה לזהות שיבוטים ספריה על צפיפות גבוהה ממברנות macroarray, שכל אחד מהם יכול להכיל מושבות לשכפל 20-4 צלחות ספריה-384 גם כן. אוטומציה הוא חיוני עבור הליך זה לא רק דיוק ומהירות, אלא גם בשל המזעור של סולם הנדרשים כדי להתאים את מספר גדול של שיבוטים ספריה לתוך סידורים מרחביים צפוף מאוד. לאחר שנוצר, אנחנו הבא הדגימו איך ממברנות macroarray ניתן לגילוי גנים של עניין באמצעות גרסאות של פרוטוקולים סטנדרטיים עבור תיוג בדיקה, הכלאה קרום, זיהוי האות. אנו משלימים את ההפגנה החזותי של נהלים אלה עם תיאורים מפורטים בכתב של השלבים הכרוכים ואת החומרים הדרושים, אשר כולם זמינים באופן מקוון לצד הווידאו.
Protocol
1. הכלאה נוהל
אחת צינור הכלאה ייקח 1 או 2 ממברנות (בגודל 22 על 22 ס"מ). השתמש 50 מ"ל של תערובת הכלאה ו 0.5 מ"ג של ה-DNA בדיקה (10 ng / ml הריכוז הסופי) לכל צינור הכלאה. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, להשתמש בג'ל מטוהרים-DNA כמו בדיקה. אם קנה המידה הכנה בדיקה, להגדיל את מספר צינורות במקום להגדיל את כמות ריאגנטים לכל צינור.
בדיקה הכנה (0.5 מ"ג DNA):
- מדולל 15 μl של פתרון חוצה מקשר עם 60 μl של מים.
- מדולל DNA עד 10 ng / μl עם מים בנפח 50 סך μl ב microtube בורג הכתיר.
- לפגל DNA של 5 דקות במים רותחים.
- במהירות להעביר קרח ולתת להתקרר 5 דקות. ספין בקצרה.
- הוסף 50 μl של חיץ התגובה ומערבבים בעדינות.
- הוסף 10 μl של תיוג מגיב ומערבבים בעדינות.
- הוסף 50 μl של הפתרון צולבות מקשר המדולל משלב 1 ומערבבים בעדינות. וורטקס בעדינות ספין בקצרה.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- שמור על הקרח עד שעות 2 או להוסיף נפח שווה של גליצרול 100% בחנות ב -20 ° C.
הערה: השתמש המים המסופקים עם הערכה. שמור את כל ריאגנטים על קרח אלא אם צויין אחרת.
ממברנה הכנה הכלאה
- מחממים 50 מ"ל של חיץ הכלאה צינור הכלאה עד 60 ° C.
- מוסיפים את החיץ הכלאה על הכלאה הצינור. מרדדים את קרום (ים) ולהוסיף צינור הכלאה. (אם הוספת 2 ממברנות לכל צינור, הגלגול הראשון את קרום one לחלוטין, אז להפשיל את הממברנה אחרים על גבי באותו כיוון).
- דגירה צינור הכלאה ב 60 ° C לפחות ½ ח (ודא קרום (ים) להירטב באופן יסודי.)
- העברת כ 1 מ"ל של חיץ הכלאה עם פיפטה ארוכה מהצינור הכלאה אל הצינור המכיל את תווית בדיקה. וורטקס בעדינות ספין בקצרה. העברת התערובת בחזרה אל צינור הכלאה.
- דגירה ב 60 ° C במשך הלילה.
הערה: מלקחיים שימוש בכפפות בעת הטיפול ממברנות. תוכן מיקס של צינורות הכלאה בעדינות כי תסיסה רבה מדי תגרום להיווצרות קבוע של קצף רצויה. ממברנות יש להוסיף במצב רטוב: לטבול חיץ הכלאה או מים במידת הצורך לנקז נוזלים עודפים לפני שמוסיפים.
2. הליך איתור
כביסה ממברנות
- מחממים חיץ כביסה העיקרי עד 60 ° C. (השתמש מיקרוגל ו / או צלחת חימום).
- אם יש 2 ממברנות בתוך הגליל האחד הכלאה, העברה חד הממברנה אל צינור נקי, שחומם מראש הכלאה ריק.
- בקצרה לשטוף בצינור הכלאה עם כ 50 מ"ל של חיץ לשטוף העיקרי.
- הוסף כ 100 מ"ל של חיץ לשטוף העיקרי צינור הכלאה ו דגירה ב 60 ° C במשך 10 דקות.
- חזור על שלב 3 ו -4.
- העברת קרום כביסה מכולה דגירה עם לפחות 250 מ"ל של חיץ לשטוף משני בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
- חזור על שלב 6.
הערה: ממברנות עשוי להישמר במאגר לשטוף משני בטמפרטורת החדר לתקופה של עד חצי שעה לפני דור האות.
אותות הדור וזיהוי (הליך קרום אחד)
- Two Tape פיסות SaranWrap שטוח על השולחן (אחד עבור לשלב 2 ואחד עבור שלב 4).
- בזהירות לנקז חיץ עודף הממברנה על ידי נגיעה בפינות הממברנה על הצד של המיכל ולהעביר את קרום על SaranWrap (צד מדגם למעלה).
- יוצקים 6-7 מ"ל של ריאגנט ECF על קרום ועוטפים בניילון לקפל מעל הממברנה. בזהירות להפיץ מגיב ECF על קרום בעדינות על ידי העברת Kimwipe על SaranWrap. דגירה של 5 דקות.
- מסננים את מגיב ECF עודף הממברנה ולהעביר אותו על חדש SaranWrap, לעטוף לקפל מעל קרום, וסוגרים את הקצוות עם הקלטת. מכסים את קרום ברדיד אלומיניום. דגירה של 1-2 שעות.
- מכינים את צלחת הזכוכית של הסורק ידי הפצת 1-2 מ"ל של ריאגנט ECF על צלחת זכוכית. ואז להעביר את קרום לצלחת זכוכית (צד מדגם למטה) ולהפיץ עוד 1-2 מ"ל של ריאגנט ECF על הממברנה. שכבת עם SaranWrap ובזהירות לדחוף את כל בועות האוויר מן הממברנה. (ייתכן מקום צלחת נוקשה על גבי SaranWrap כדי לשמור על הקרום נצמד צלחת זכוכית).
- השתמש FLA-5100 פוג'י סורק פלואורסצנטי ("1 1 לייזר תמונת מצב") עם ההגדרות הבאות: עירור 473 ננומטר, זיהוי לסנן LPB (510 ננומטר), רזולוציה 50 מיקרומטר, אות הסיום 16-bit, CH1 400 V. (סריקה לוקח בערך 15-20 דקות לכל קרום בגודל 22 על 22 ס"מ).
אופציונלי: - בואו לשבת במשך 2-4 שעות (או יותר).
- חזור על הסריקה כמו בשלב 6.
3. שלילת ואחסון הליך (NUF גרסה)
- העברת קרום עד 100% ethanol ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות עם תסיסה עדינה.
- החלף אתנול 100% טרי דגירה הלילה בטמפרטורת החדר. (ממברנה עשויה להישאר באתנול במשך כמה ימים.)
- החלף אתנול עם מים מזוקקים דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
- מוסיפים 100 מ"ל מים ו - 5 מ"ל של 10% SDS (SDS 0.5% הסופי) לצינור הכלאה ומערבבים בעדינות. הוסף הממברנה.
- לדגור על 80 מעלות צלזיוס למשך 1 ח
- העברת קרום למיכל, נקי וריק.
- מוסיפים 500 מ"ל מים ו - 5 מ"ל של 10% SDS (SDS הסופי 0.1%) וכוס וחום לרתיחה בתנור מיקרוגל.
- יוצקים את כמעט רותחים 0.1% SDS פתרון מעל הממברנה בעדינות להתסיס במשך כמה דקות. אפשר להתקרר לטמפרטורת החדר.
- יש לשטוף ב מ"ל של לפחות 250 סטרילי 100 מ"מ טריס pH 8 דקות לפחות 10.
- עוטפים בקרום ב SaranWrap וקצוות לסגור היטב עם קלטות. חנות ב 4 ° C. (ממברנות אסור לייבש.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
נוהל הפשטת לא עבר אופטימיזציה. עם זאת, הליך הפשטה ניתנה הוראה של היצרן (2 רוחץ כל 10 דק 'ב 100% אתנול, לשטוף 1 של ח 1 ב 60 ° C ב 0.5% SDS) אינה מספקת. לפחות הדגירה לילה אתנול 100% יש צורך לפרק את המוצר התגובה ECF; הדגירה מספר ימים אתנול 100% נראה כי אין השפעות שליליות על היכולת reprobe הממברנה. SDS של יצרנית הטיפול גם כנראה לא מספיק. NUF ניסתה 1 ח ב 80 ° C עם 0.5% SDS ואחריו טיפול אחד עם כמעט רותחים SDS 0.1% הצלחה. טרייסי הראו כי פעם אחת לשפוך מעל עם כמעט רותחים SDS 0.1% מספיקה.
רמזים מועילים:
המאגר הכלאה, הכלאה צינור, ואת חיץ לשטוף העיקרי חייב להיות שחומם מראש ל 60 מעלות צלזיוס לפני השימוש, יש לשמור בטמפרטורת כי לאורך הניסוי. לדוגמה, לשמור על מאגרים על צלחת חימום עם מדחום שקוע; על צלחת חימום קורנינג, הגדרה של כ - 3 תוצאות 60 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| AlkPhos Direct Labelling Reagents | kit | Amersham | RPN3680 | Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C. |
| ECF Substrate | kit | Amersham | RPN3685 | Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer.Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm). |
| 20x Secondary Wash Buffer | buffer | 121 g Tris(final 1 M), 117 g NaCl(final 2 M).Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months. | ||
| 0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7 | buffer | 69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature. | ||
| 1 M MgCl2 | 50.8 g MgCl2.6H2OAdjust to 250 ml with water. Store at room temperature. | |||
| 10% (w/v) SDS | 20 g SDSAdjust to 200 ml with water. Store at room temperatur | |||
| Combination pack RPN3692 = RPN3680 + RPN3685 | ||||
