Summary
本文介绍了一种协议，该协议允许使用一种称为伊拉斯谟阶梯的设备对精细运动性能进行非侵入性和自动评估，以及在挑战时进行自适应和联想运动学习。可以滴定任务难度，以检测从严重到轻微程度的运动障碍。
Abstract
行为是由行动塑造的，而行动需要运动技能，如力量、协调和学习。如果没有从一个位置过渡到另一个位置的能力，任何维持生命必不可少的行为都是不可能的。不幸的是，运动技能可能会在多种疾病中受到损害。因此，在细胞、分子和回路水平上研究运动功能的机制，以及了解运动障碍的症状、原因和进展，对于开发有效的治疗方法至关重要。鼠标模型经常用于此目的。
本文描述了一种协议，该协议允许使用称为伊拉斯谟阶梯的自动化工具监测小鼠运动性能和学习的各个方面。该测定包括两个阶段：初始阶段，训练小鼠在由不规则梯级构建的水平梯子中导航（“精细运动学习”），以及第二阶段，在移动动物的路径上出现障碍物。扰动可能是意想不到的（“挑战性运动学习”），也可能是先于听觉音调（“联想运动学习”）。该任务易于执行，并由自动化软件完全支持。
该报告显示了当使用灵敏的统计方法进行分析时，测试的不同读数如何允许使用一小群小鼠对小鼠运动技能进行精细监测。我们认为，该方法对于评估由环境改变驱动的运动适应以及运动功能受损的突变小鼠的早期细微运动缺陷具有高度敏感性。
Introduction
已经开发了多种测试来评估小鼠的运动表型。每个测试都提供有关运动行为特定方面的信息1.例如，开放场地测试告知一般运动和焦虑状态;旋转梁和步进梁的协调和平衡测试;足迹分析是关于步态的;跑步机或跑步轮进行强迫或自愿体育锻炼;而复杂的轮子是关于运动技能学习的。为了分析小鼠运动表型，研究人员必须按顺序进行这些测试，这涉及大量的时间和精力，并且通常涉及几个动物队列。如果在细胞或电路水平上有信息，研究者通常会选择监测相关方面的测试并从那里进行跟踪。然而，缺乏以自动化方式区分运动行为不同方面的范式。
本文描述了使用伊拉斯谟量程 2,3 的协议，该系统允许全面评估小鼠的各种运动学习特征。主要优点是该方法的可重复性和灵敏度，以及滴定运动难度和将运动表现缺陷与联想运动学习受损区分开来的能力。主要部件由一个水平梯子组成，该梯子具有交替的高 （H） 和低 （L） 梯级，配备触摸感应传感器，可检测鼠标在梯子上的位置。梯子由 2 x 37 个梯级（L，6 mm;H，12 mm），彼此间隔 15 mm，并以左右交替模式放置，间隙为 30 mm（图 1A）。梯级可以单独移动以产生不同级别的难度，即创建障碍物（将高梯级提高 18 毫米）。伊拉斯谟阶梯与自动记录系统相结合，并将梯级模式的修改与感官刺激相关联，测试精细运动学习和运动性能适应，以应对环境挑战（出现更高的梯级以模拟障碍物、无条件刺激 [US]）或与感官刺激（音调、条件刺激 [CS]）的关联。测试涉及两个不同的阶段，每个阶段评估 4 天内运动性能的改善，在此期间，小鼠每天接受 42 次连续试验。在初始阶段，小鼠被训练在阶梯上导航，以评估“精细”或“熟练”的运动学习。第二阶段包括交错试验，其中在移动动物的路径上呈现更高梯级形式的障碍物。这种扰动可能是意想不到的，以评估“挑战性”运动学习（仅限美国）或通过听觉音调宣布以评估“联想”运动学习（配对试验）。
伊拉斯谟阶梯是最近开发的 2,3.它尚未被广泛使用，因为建立和优化协议需要集中精力，并且专门设计用于评估小脑依赖性联想学习，而没有详细探索其揭示其他运动缺陷的潜力。迄今为止，它已被验证能够揭示与小鼠小脑功能障碍相关的细微运动障碍 3,4,5,6,7,8。例如，connexin36（Cx36）敲除小鼠，其中橄榄神经元中的间隙连接受损，由于缺乏电渗耦合而表现出放电缺陷，但运动表型很难确定。使用伊拉斯谟阶梯的测试表明，下橄榄神经元在小脑运动学习任务中的作用是编码刺激的精确时间编码，并促进对意外事件的学习依赖性反应3,4。脆性 X 信使核糖核蛋白 1 （Fmr1） 敲除小鼠是脆性 X 综合征 （FXS） 的模型，表现出众所周知的认知障碍以及程序记忆形成的轻度缺陷。在伊拉斯谟阶梯中，Fmr1 敲除在步数时间、每次试验的失误或运动性能改善方面没有显着差异，但与野生型 （WT） 同窝动物相比，未能根据突然出现的障碍物调整他们的行走模式，证实了特定的程序和联想记忆缺陷 3,5.此外，具有小脑功能缺陷的细胞特异性小鼠突变系，包括浦肯野细胞输出、增强和分子层中间神经元或颗粒细胞输出受损，在运动协调方面表现出问题，有效步进模式的获取改变，以及跨越阶梯所采取的步数6。新生儿脑损伤会导致小脑学习缺陷和浦肯野细胞功能障碍，也可以通过伊拉斯谟阶梯 7,8 检测到。
在本视频中，我们提供了一个全面的分步指南，其中详细介绍了行为室的设置、行为测试协议和后续数据分析。本报告旨在易于访问和用户友好，专为帮助新移民而设计。该协议提供了对运动训练的不同阶段和小鼠采用的预期运动模式的见解。最后，本文提出了一个使用强大的非线性回归方法进行数据分析的系统工作流程，并提出了在其他研究环境中调整和应用该协议的宝贵建议和建议。
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Protocol
在目前的研究中，使用了成年（2-3个月大）两性C57BL / 6J小鼠。每个笼子饲养两到五只动物，在观察的动物单位中 随意 获取食物和水，并在 12 小时的黑暗/光照循环中保持在温度受控的环境中。所有程序均按照欧洲和西班牙法规（2010/63/UE;RD 53/2013），并得到了瓦伦西亚将军伦理委员会和米格尔·埃尔南德斯大学动物福利委员会的批准。
1. 行为室设置
- 每天同时预订行为测试室，并确定要使用的小鼠列表和顺序，以及它们的托管安排。
- 将实验小鼠放在测试室外，这样它们在不测试时就不会听到空气压缩机的声音和伊拉斯谟阶梯的音调。
- 检查伊拉斯谟梯子系统的所有组件是否都井然有序并可以使用：网络路由器、带有软件的计算机（参见 材料表）、空气压缩机、两个球门箱和梯级正确定位的梯子。
- 在每只动物之后用水广泛清洁球门箱、梯子和梯级，并在每个训练日结束时用水和 70% 乙醇清洁。
2. 行为测试协议
- 创建一个实验并将协议输入软件（补充图S1）。
- 打开软件。
- 要创建实验，请选择 “文件”|”新实验 |新建或设置 |实验方案。
注：本研究中使用的默认协议名为EMC，由鹿特丹伊拉斯谟大学医学中心设计。 - 为实验命名，然后单击 “确定”。
- 检查所选的默认 EMC 协议是否包括 4 天的未受干扰会话（每天 42 次不受干扰的试验）和 4 天的挑战会话（每天 42 次混合试验：未受干扰、仅 CS（音调）、仅 US（障碍物）、配对（按音调宣布障碍物）（参见图 1B）。在右侧面板中，还要检查用于鼓励鼠标越过梯子的灯光提示（最长持续时间为 3 秒）、空气提示（最长持续时间为 45 秒）和顺风（在所有试验类型中为“是”）和提示音（250 毫秒，仅在仅限 CS 和配对试验中为“是”）。
- 要创建其他协议，请选择 Set up |实验方案 |新品 |从头开始 或 从 EMC 协议中复制 ，然后简单地修改它，编辑与 会话数（实验天数） 以及 每天的试验次数和类型相关的表格行。
注意：休息时间、线索类型和激活、持续时间、强度和间隔也可以根据实验问题进行调整。 - 要打开会话列表并命名主题，请选择 “设置”|”会话列表。
- 单击 添加主题和变量。
- 按照小鼠的有序列表输入每个特定的 小鼠标识符、出生日期、性别、基因型和相关类别。
- 启动会话（补充图 S2）。
- 在开始之前，请检查软件是否已打开，然后打开 Ladder。
- 检查空压机是否已连接并打开。
- 要打开 “采集”窗口，请打开“已创建实验”。
- 选择 采集 |开放收购。
- 将带有软件指示的标识符的鼠标放在起始球门框（梯子的右侧）中。
- 选择要在第一个会话中获取的 鼠标标识符 。
- 单击 “开始采集”。
- 按下 红色梯形菜单旋钮 3 次。检查会话是否启动，并自动控制和记录鼠标移动，直到会话的最后一次试用结束。
- 结束会话。
- 检查在第 42次 试用结束时，显示屏是否显示消息 “正在发送数据 ”和 “已获取”。
- 将鼠标放回主笼子。
- 清洁梯子和球门框。
- 放置下一个鼠标并从步骤 2.2.6 开始重复。
- 每天执行选定的会话类型，直到协议结束。根据所选方案每天重复步骤 2.2 和 2.3。
- 导出数据（补充图 S2）。
- 要可视化记录的数据，请从“ 分析 ”菜单、 “试验统计”、“ 会话统计”和 “组统计和图表”中进行选择。
注意：数据可以以电子表格的形式下载，其中包含单个试验的数据以及会话中相同试验类型的方法。还可以按为特定分析选择的变量对会话进行筛选。 - 单击右上角 的“导出 ”按钮，选择文件格式（电子表格）和文件夹位置。
- 右键单击自动生成的图表，然后选择 “另存到文件 为 *.jpg”。
- 要可视化记录的数据，请从“ 分析 ”菜单、 “试验统计”、“ 会话统计”和 “组统计和图表”中进行选择。
3. 数据分析
注意： 伊拉斯谟阶梯根据触摸感应传感器活动的瞬时记录自动测量参数列表。为了进行分析，用户选择的输出参数在电子表格中进行组织和处理。除了软件生成的图表外，用户还可以使用选择的图表软件生成图表，以可视化会话中不同参数的特定变化。
- 选择特定参数来分析前 4 天的基础动机或焦虑状态、感觉反应、运动表现和精细运动学习。
- 选择并绘制控制参数，包括球门框内的休息时间和休息后响应光线和空气提示离开球门框的时间（图2A）。
注意：WT小鼠的休息时间或对线索的反应相对恒定。其他参数，如退出频率，在WT小鼠中基本上可以忽略不计 - 动物很少在没有提示的情况下离开休息箱，或者在梯子中返回一次，导致每次试验的退出频率等于1。如果动物在应用提示之前出去，气流就会被激活，迫使鼠标返回球门框;这不算作软件的试用。 - 在提示后选择并绘制梯子上的时间，测量为鼠标离开目标框后穿过梯子所花费的时间（图 2B）。
注意：幂非线性回归是一种评估学习的可靠方法。Pearson 或 Spearman 系数 （R） 将提供数据拟合是否良好的度量（当动物在会话中学习/改进时，R 值接近 1;R 值接近 0 表示数据是恒定的，小鼠不学习）。 - 选择并绘制 步进模式参数 ，例如作为敏感学习参数的 失误试验的百分比 （图2C）。
- 将正确的台阶定义为从高阶梯到另一个高阶梯 （H-H） 的台阶，无论台阶的长度如何。将涉及较低梯级的台阶类型视为失误。
- 根据按下梯级之间台阶的长度和方向性，将正确的步骤和错误步骤分为短步和长步、后退和跳跃（见 图 1A）。
- 选择并绘制控制参数，包括球门框内的休息时间和休息后响应光线和空气提示离开球门框的时间（图2A）。
- 选择并绘制特定参数，以评估过去 4 天内的挑战性运动学习（仅限美国试验）和联想学习（配对试验）。
- 在提示后在梯子上选择并绘制时间（图 3）。
- 选择并绘制 有失误的试验百分比 （图4A）。
- 选择并绘制扰动 前 和 扰动后步进时间，定义为梯子同一侧障碍物之前（控制步骤）和障碍物之后（适应步骤）之间的梯级激活之间的毫秒精度差异（图4B）。
注意：应执行扰动前与扰动后的步进时间分析，以比较每种类型的会话中的数据。该参数测量小鼠在联想学习过程中预测和克服障碍的能力。
- 使用专用的统计软件（例如SigmaPlot）分析数据。对跨会话从同一试验类型收集的数据进行功效非线性回归分析，以更有效地描述学习过程，并使用双向重复测量 （RM） 方差分析来比较试验类型。
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Representative Results
伊拉斯谟梯子设备、设置和应用的协议如 图 1 所示。该方案包括四次不受干扰和四次挑战会议（每次 42 次试验）。每次试验都是在起始和结束目标框之间的梯子上运行一次。在会话开始时，将鼠标放置在其中一个起始框中。在设定的 15 ± 5 秒（“静止”状态）后，灯亮起（提示 1，最多 3 秒）。然后应用轻微的空气提示（提示2，最大45秒）以鼓励小鼠离开盒子并走到另一端。对空气提示做出反应的时间可能因小鼠和会话而异，并且可以用作比较组间动机或焦虑状态的参数。鼠标到达最终目标框后，将立即开始新的试验。
在第1-4天的WT小鼠中，没有观察到休息时间和对光提示做出反应的时间差异，但在第1天和第2天之间对空气提示做出反应的时间略有减少（图2A）。对越过阶梯的时间的测量产生了从第 1 天到第 4 天的显着学习曲线，该曲线可以用功效回归曲线拟合（R = 0.50，*p = 0.047， 图 2B）。决定越过梯子所花费时间的一个关键参数是失误的发生。与梯子上时间的缩短一致，小鼠在不受干扰的会话中失误的试验数量减少，因为小鼠学会了在上层梯级（H-H台阶）上行走并避开较低的梯级作为更有效的模式穿越梯子（R = 0.90，***p < 0,0001， 图2C）。
从第 5 天到第 8 天，小鼠接受挑战训练，其中引入了意想不到的障碍物 （US）（一个梯级在踏步表面上方随机升高 18 毫米）。在一些试验中，在超声扰动前 250 ms 呈现音调（CS，90 dB，15 kHz 音调持续 250 ms）（见 图 1B）。
随着第 5 天挑战赛的开始，由于障碍物的不可预测的引入，动物在仅限美国的试验中需要更多时间才能越过梯子（第 4 天：5.01 秒; 图2B;第 5 天：7.84 秒; 图3;配对 t 检验，*p < 0.039）。从第 5 天到第 8 天，小鼠性能有所改善，在仅美国会话中产生了显着的学习曲线（R = 0.50，*p = 0.045， 图 3，橙色）。在联想学习试验中，障碍物与音调配对，与仅美国试验相比，动物完成每日会话的速度明显更快（R = 0.63， 图3，紫色;双向RM方差分析，*p = 0.028）。最后，在单独呈现音调（仅CS）的对照试验中，报告了类似于未受干扰会话的显着学习曲线（R = 0.82，***p < 0.001， 图3，蓝色）。
对步骤模式的分析为检测仅美国试验和关联试验之间的差异提供了额外的确认和更高的灵敏度。图4A显示了在仅美国试验中，失误的试验百分比保持不变（R = 0.01，p = 0.90，橙色），而在配对会话期间观察到失误的试验显着减少（R = 0.61，*p = 0.01，紫色）。 图4B显示了仅在美国试验（双向RM方差分析，*p = 0.05）中扰动前和扰动后步进时间之间的显着差异，但在配对试验中则没有，小鼠学习速度更快以克服障碍。所有研究的变量和应用的统计检验均在补充表S1中报告。
图 1：系统、协议和参数。 （A） 伊拉斯谟阶梯由一个水平梯子组成，两侧是两个球门箱。这幅卡通图表示了高低交替梯级的梯子，并记录了主要参数，包括步数类型（正常步数、实线;或失误步数、虚线）和扰动前后步长时间，定义为鼠标需要克服障碍物（无条件刺激;更高梯级）的时间，由音调（条件刺激）宣布或不宣布。（B） 该协议包括四个不受干扰的会话和四个挑战会话（一个会话/天，42 次试验/会话），允许单独分析精细运动学习（蓝色未受干扰且仅 CS）、挑战运动学习（仅限美国，橙色）和联想运动学习（配对 CS + US，紫色）。缩写：H = high;L = 低;CS = 条件刺激;US = 无条件刺激。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：WT小鼠在不受干扰的会话中的运动性能。 （A） 球门框内的休息时间（恒定，15 秒），对提示做出反应的时间：光（恒定，3 秒）和空气（可变）;在第 1-4 天不受干扰的会议中。（B） 在不受干扰的会议期间，在提示（光线和空气）后穿过梯子的时间。（C） 在每次未受干扰的会话中，动物错过一步的试验百分比。使用功效回归分析来研究学习进度（R= 0.50：*p = 0.047，R= 0.90 ***p < 0.0001，n = 4 只小鼠）。缩写：WT = 野生型。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：WT小鼠在挑战过程中的表现。 仅 US（橙色）、配对（紫色）和仅 CS（浅蓝色）试验的第 5-8 天提示后在梯子上的平均时间。采用幂非线性回归分析研究学习进度（*p = 0.047，**p = 0.0093，***p < 0.001，n=4只小鼠）。双因素RM方差分析比较试验类型（*p = 0.028，**p = 0.008，n=4只小鼠，两只雄性和两只雌性，平均±SEM）。缩写：CS = 条件刺激;US = 无条件刺激。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：鼠标步进模式在挑战会话中的变化。 （A） 在仅美国和配对会话期间动物错过步骤的每次会话的试验百分比。功效回归分析用于研究学习过程（*p = 0.013），并使用双因素RM方差分析比较试验类型（*p = 0.032，n = 4只小鼠）。（B） 在整个会话中仅使用美国和配对会话中的扰动前和后步进时间。双向重复测量方差分析，*p < 0.05，n = 4 只小鼠，两只雄性和两只雌性，平均 ± SEM。 请点击这里查看此图的较大版本.
补充图S1：软件界面：如何创建实验和选择方案。 软件的屏幕截图，说明了协议步骤2.1中描述的工作流程，涵盖了步骤2.1.4至2.1.8。 请点击此处下载此文件。
补充图S2：软件界面：如何启动会话和导出数据。 软件屏幕截图，说明了协议步骤2.2和2.5中描述的工作流程，包括步骤2.2.4至2.2.7和2.5.1至2.5.3。 请点击此处下载此文件。
附表S1：统计表。 图2B，C、图3和图4A，B中报告了所研究的所有变量和应用的统计检验的描述。请点击此处下载此文件。
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Discussion
伊拉斯谟阶梯在运动表型评估方面具有超越当前方法的主要优势。测试易于进行、自动化、可重复，并允许研究人员使用单个小鼠队列分别评估运动行为的各个方面。在目前的研究中，可重复性允许利用设备、实验设计和分析方法的特性，用少量的WT小鼠生成可靠的数据。例如，与传统的光束行走测定相比，添加动机线索（空气和光线）以进入阶梯路径和顺风以完成试验，从而提高了一致性，并跳过了实验者干预的需要，这是变异性的主要来源。
需要空气压缩机系统来产生可以根据鼠标方向和位置进行调整的气流。当老鼠试图在预定的试验开始之前离开球门框时，气流会从相反方向产生 30 公里/小时的逆风，使小鼠返回球门框。在试验过程中，它还会产生恒定的顺风（1 至 16 公里/小时），直到鼠标完全越过梯子并进入对面的球门框。如果没有加压空气作为穿越梯子的动力，小鼠经常在梯级上停顿，并以悠闲的速度反转方向，这引入了一个探索性变量，对分析适得其反。
此处描述的标准协议提供了基本精细运动协调和学习（不受干扰的会话）的测量，以及在 8 天的时间跨度内适应挑战和联想运动学习（挑战会话）的测量。对于通常用于神经科学研究的WT小鼠品系（例如此处使用的C57Bl6J小鼠）来说，这项任务很容易，并且是安全的，在任何测试过程中都没有观察到任何伤害。此外，与其他运动测试（如旋转或跑步机）相比，我们没有检测到疲劳迹象。
在 4 天的初始阶段，WT 小鼠通过学习采用最有效的跑步模式（H-H 步）来掌握技能并越过阶梯，并且在第 4 天很少发生失误（图 2B，C）。在第二阶段的第5天，小鼠在第一次遇到障碍物时速度较慢，但很快就适应了（图3，仅限美国）。将障碍物与条件反射刺激（音调）相结合有助于学习，试验持续时间等于不存在障碍物的试验（图3，配对）。值得注意的是，在仅在美国进行的试验中，失误的试验数量保持不变（图4A），而在配对会话中观察到显着减少（图4A），证实了联想学习过程的有效性。
我们提出了一个工作流程，用于分析伊拉斯谟阶梯软件提供的代表性参数。功效回归分析使我们能够使用四只WT小鼠记录显着的学习曲线，并检测挑战学习与联想学习的差异。根据其他文献和试点实验，涉及突变或治疗小鼠的实验设计可能需要将小鼠数量增加到 7-10 只小鼠 4,5,6。在我们手中，每次会话 42 次试验是在小小鼠队列中获得可靠数据的最佳数量，因为平均几次试验可以降低变异性。虽然这个数字可能看起来很高，但每个 42 次试验需要 15 分钟到 35 分钟，每天可以合理测试 12-16 只小鼠。试验持续时间（包括休息时间和对提示的反应以及穿越梯子的时间）在 20 秒到 50 秒之间变化，具体取决于训练日和试验类型。
尽管如此，该系统的多功能性将允许研究人员通过调整各种设置来设计定制的方案，包括每天的会话和试验次数、提示和 CS 的强度和持续时间，以及美国的性质。例如，我们的数据显示WT小鼠的学习曲线很快，特别是在性能达到平台期后的第1天和第2天之间（图2B，C）。这表明，在不受干扰的课程中测试基本运动学习可能并不绝对需要额外的 2 天，并且可以通过将训练持续时间减少到仅 2 天来实施对标准协议的修改。然而，这种适应可能不适合该协议的第二阶段，该阶段包括交错的未受干扰、仅限美国、仅限 CS 和配对试验。刺激是随机和出乎意料地呈现的，以评估特定行为，并且需要将实验试验分为这四类，这使得 42 成为统计功效所需的合适数量的试验。因此，需要对方案进行重组，以评估减少未受干扰试验数量或增加特定挑战试验的可行性。CS（90 dB，15 kHz音调）和US之间的刺激间间隔（ISI）设置为250 ms，也可以改变以研究刺激-反应关联。这种调整将允许研究人员根据科学问题滴定难度级别或专注于不同的行为。
迄今为止，伊拉斯谟阶梯主要用于检测小脑起源的运动协调的细微缺陷。例如，失误是衡量全身运动协调性的指标。在这项研究中，使用了年轻的成年小鼠，但其他人也使用了像 P23 一样年轻的小鼠来研究运动功能的成熟 7,8。可以通过对小鼠左右爪位置的判别分析来研究中枢起源的同侧病变。最后，掌握伊拉斯谟阶梯中的运动技能可能会涉及其他运动控制回路，涉及基底神经节、运动皮层和连接通路，包括胼胝体。将这种行为范式与细胞、分子和电路技术相结合，将有助于研究介导运动适应的电路机制，并可用于促进运动学习。一个这样的例子是研究对轴突髓鞘形成的影响，轴突髓鞘形成对脱髓鞘小鼠模型中精细运动技能的获得高度敏感 9,10。
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Disclosures
作者没有需要披露的利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢视听技术人员和视频制作人 Rebeca De las Heras Ponce 以及首席兽医 Gonzalo Moreno del Val 在小鼠实验期间对良好实践的监督。这项工作由 GVA 卓越计划 （2022/8） 和西班牙研究机构 （PID2022143237OB-I00） 向 Isabel Pérez-Otaño 提供的赠款资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice (Mus musculus) | Charles Rivers | ||
| Erasmus Ladder device | Noldus, Wageningen, Netherlands | ||
| Erasmus Ladder 2.0 software | Noldus, Wageningen, Netherlands | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| Sigmaplot software | Systat Software, Inc. |
References
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