Summary
Här presenterar vi ett protokoll för ett automatiserat cellodlingssystem. Detta automatiserade odlingssystem minskar arbetskraften och gynnar användarna, inklusive forskare som inte är bekanta med att hantera inducerade pluripotenta stamceller (iPS), från underhåll av iPS-celler till differentiering till olika typer av celler.
Abstract
Humaninducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) med oändlig självförökande förmåga har förväntats ha tillämpningar inom många områden, inklusive klarläggande av patologier för sällsynta sjukdomar, utveckling av nya läkemedel och regenerativ medicin som syftar till att återställa skadade organ. Trots detta är den sociala implementeringen av hiPSC fortfarande begränsad. Detta beror delvis på svårigheten att reproducera differentiering i kulturen, även med avancerad kunskap och sofistikerade tekniska färdigheter, på grund av iPSC:s höga känslighet för små miljöförändringar. Tillämpningen av ett automatiserat odlingssystem kan lösa detta problem. Experiment med hög reproducerbarhet oberoende av en forskares skicklighet kan förväntas enligt en gemensam procedur mellan olika institut. Även om flera automatiserade odlingssystem som kan upprätthålla iPSC-kulturer och inducera differentiering har utvecklats tidigare, är dessa system tunga, stora och kostsamma eftersom de använder sig av humaniserade, multiartikulerade robotarmar. För att förbättra ovanstående problem utvecklade vi ett nytt system med hjälp av ett enkelt x-y-z-axelglidskenesystem, vilket gör att det kan vara mer kompakt, lättare och billigare. Dessutom kan användaren enkelt ändra parametrar i det nya systemet för att utveckla nya hanteringsuppgifter. När en uppgift har upprättats är allt användaren behöver göra att förbereda iPSC, tillhandahålla de reagenser och förbrukningsvaror som behövs för den önskade uppgiften i förväg, välja uppgiftsnummer och ange tiden. Vi bekräftade att systemet kunde upprätthålla iPSCs i ett odifferentierat tillstånd genom flera passager utan matarceller och differentiera till olika celltyper, inklusive kardiomyocyter, hepatocyter, neurala stamceller och keratinocyter. Systemet kommer att möjliggöra mycket reproducerbara experiment mellan institutioner utan behov av skickliga forskare och kommer att underlätta det sociala genomförandet av hiPSC inom ett bredare spektrum av forskningsområden genom att minska hindren för nya inträden.
Introduction
Denna artikel syftar till att tillhandahålla faktiska och detaljerade hanteringsprocedurer för ett automatiserat odlingssystem för humaninducerade pluripotenta stamceller (iPSC), som vi producerade genom att samarbeta med ett företag, och att visa representativa resultat.
Sedan publiceringen av artikeln 2007 har iPSC väckt uppmärksamhet över hela världen1. På grund av dess största egenskap att kunna differentiera till vilken typ av somatisk cell som helst, förväntas den kunna tillämpas inom olika områden såsom regenerativ medicin, belysa orsakerna till svårbehandlade sjukdomar och utveckla nya terapeutiska läkemedel 2,3. Dessutom skulle användningen av humana iPSC-härledda somatiska celler kunna minska djurförsöken, som är föremål för betydande etiska restriktioner. Även om många homogena iPSC:er ständigt krävs för att forska fram nya metoder med iPSC:er, är det för mödosamt att hantera dem. Dessutom är det svårt att hantera iPSC på grund av dess höga känslighet, även för subtila kulturella och miljömässiga förändringar.
För att lösa detta problem förväntas automatiserade odlingssystem utföra uppgifter istället för människor. Vissa grupper har utvecklat ett fåtal automatiserade humana pluripotenta stamcellsodlingssystem för cellunderhåll och differentiering och publicerat sina resultat 4,5,6. Dessa system är utrustade med flerledade robotarmar. Robotarmar har inte bara fördelar genom att de i hög grad efterliknar mänskliga armrörelser utan också nackdelar genom att de kräver högre kostnader för armen/armarna, större och tyngre systemförpackningar och tidskrävande utbildningsinsatser av ingenjörerna för att uppnå de riktade rörelserna 7,8. För att göra det lättare att introducera apparaten till fler forskningsanläggningar vid tidpunkterna för ekonomisk, rymd- och personalförbrukning har vi utvecklat ett nytt automatiserat odlingssystem för underhåll och differentiering av iPSC till olika celltyper9.
Vår motivering för det nya systemet var att anta ett X-Y-Z-axelskensystem istället för multiledade robotarmar9. För att ersätta de komplexa handliknande funktionerna hos robotarmar tillämpade vi en ny idé på detta system, som automatiskt kan ändra tre typer av specifika funktionella armspetsar. Här visar vi också hur användare enkelt kan göra uppgiftsscheman med enkla beställningar på programvara på grund av bristen på krav på ingenjörernas bidrag under hela processen.
Ett av robotodlingssystemen har demonstrerat tillverkningen av embryoidkroppar med hjälp av 96-brunnars plattor som 3D-cellaggregat för differentiering4. Systemet som redovisas här kan inte hantera 96-hålsplattor. En uppnådde den nuvarande graden god tillverkningssed (cGMP) med hjälp av en cellinje, även om det inte var en human pluripotent stamcell5. Det automatiserade odlingssystemet som beskrivs här har nu utvecklats med det specifika syftet att underlätta laboratorieexperiment (figur 1). Den har dock tillräckligt med system för att hålla rena nivåer som motsvarar ett nivå IV-säkerhetsskåp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den etiska kommittén vid Kansai Medical University godkände generering och användning av de friska frivilliga iPSCs som heter KMUR001 (godkännande nr 2020197). Donatorn, som var öppet rekryterad, gav formellt informerat samtycke och samtyckte till den vetenskapliga användningen av cellerna.
OBS: Det aktuella gränssnittet (specialprogramvaran som heter "ccssHMI" som körs under operativsystemet Windows XP) är den grundläggande funktionsskärmen. Under det tidigare nämnda gränssnittet är en serie flikar arrangerade, så att användare kan initiera olika operationer.
1. Lastning
- Klicka på knappen Laddar på programvarans övre skärm. Klicka på knappen Loading Preparation Start .
- Placera skålen/skålarna eller tallriken/tallrikarna som ska föras in i apparaten på plats i apparaten.
OBS: Nödvändig information för identifiering av skålen ska skrivas på varje lock. - Stäng det främre skjutfönstret manuellt och tryck på knappen för mekanisk säkerhetsbekräftelse.
- Välj typ och mängd av maträtter eller tallrikar i programvaran.
- Klicka på knappen Loading Preparation Completed . Klicka på knappen Loading Start .
- När en parabol har laddats upp till systemet väljer du informationen på parabolen, t.ex. med iPS-celler eller utan iPS-celler, i programvaran. Registrera anteckningar om varje maträtt i programvaran.
- Klicka på knappen Registrering i slutet för att slutföra laddningen.
2. Lossning
- Klicka på knappen Ladda ur på programvarans övre skärm. Välj den eller de maträtter som ska tas bort i programvaran.
- När du har valt rätt(er) klickar du på knappen Lossa förberedelsestart . Klicka på knappen Avlastningsstart .
- Efter att skålen/skålarna har överförts från inkubatorn till arbetsbänken i systemet, tryck på knappen Diskborttagning .
- Öppna det främre skjutfönstret manuellt och ta ut skålen/skålarna. Stäng det främre skjutfönstret manuellt och tryck på knappen för mekanisk säkerhetsbekräftelse.
3. Tillägg av förbrukningsvaror: pipetter, rör och medium
- För att fylla på förbrukningsvaror som pipetter, rör och medium, klicka på knappen Förbrukningsvaror på programvarans övre skärm och välj sedan den artikel som ska fyllas på.
- Pipetter
- Klicka på pipettknappen . Välj knappen Fyll på .
- Välj ett rack som användaren vill fylla på i programvaran. Klicka på knappen Fyll på Start .
- Efter att ha bekräftat att locket till pipettförvaringsutrymmet på arbetsbänken är öppet, öppna det främre skjutfönstret manuellt och fyll på pipetterna efter behov.
- Stäng det främre skjutfönstret manuellt och tryck på knappen för mekanisk säkerhetsbekräftelse. Klicka på knappen Påfyllning slutförd .
- Klicka på knappen Inställningar för lagerpåfyllnad och ange informationen för lagerpåfyllnaden och klicka sedan på knappen Registrering .
- Klicka på knappen Påfyllning slutförd .
- Rör
- Klicka på knappen Tube . Välj knappen Fyll på .
- Välj ett rack som användaren vill fylla på i programvaran. Klicka på knappen Fyll på Start .
- När du har bekräftat att racket har flyttats till toppen klickar du på knappen Fyll på rör .
- Öppna det främre skjutfönstret manuellt och fyll på rören efter behov.
- Stäng det främre skjutfönstret manuellt och tryck på knappen för mekanisk säkerhetsbekräftelse.
- Klicka på knappen Påfyllning slutförd .
- Klicka på knappen Inställningar för lagerpåfyllnad och ange informationen för lagerpåfyllnaden och klicka sedan på knappen Registrering . Klicka på knappen Stäng .
- Medium
- Klicka på knappen Medel . Välj knappen Fyll på i programvaran.
- Välj ett rack av tre som användarna vill fylla på. Klicka på knappen Fyll på Start .
- Efter att ha bekräftat att locket till medieförvaringsutrymmet har öppnats, öppna det främre skjutfönstret manuellt och fyll på mediet.
- Stäng det främre skjutfönstret manuellt och tryck på knappen för mekanisk säkerhetsbekräftelse.
- Klicka på knappen Påfyllning slutförd .
- Klicka på knappen Fyll på och ange informationen för mediet, inklusive mediets namn och mängd. Ange ytterligare kommentarer om det behövs.
- Klicka på knappen Registrering .
- Klicka på knappen Stäng .
- Pipetter
4. Val av uppgift
- Klicka på knappen Uppgift på programvarans övre skärm.
- Välj knappen Uppgiftsinställning . Välj önskad uppgift i uppgiftslistan och klicka på knappen Nästa steg .
- Ange datum och tid för att utföra uppgiften och klicka sedan på knappen Registrering . Välj en maträtt eller tallrik för att utföra uppgiften och klicka sedan på knappen Registrering .
- När du har bekräftat den valda uppgiften klickar du på knappen Registrering . Bekräfta att uppgiften har registrerats på nästa skärm.
- Om det behövs ställer du in nästa uppgift på samma sätt.
- Klicka på Start-knappen i slutet. Sedan startar aktiviteten automatiskt vid det angivna datumet och den angivna tiden.
OBS: Omedelbart efter att ha avslutat varje uppgift tänds UV-lampor (placerade på två sidor av huven) automatiskt, och efter 5-30 minuter, i enlighet med hjälpinställningen, stängs de av för att hålla huven i aseptiskt skick. För att stoppa kan användare klicka på Start-knappen . - Om användarna vill avbryta en schemalagd aktivitet i förväg klickar du på knappen Stoppa .
- När du har valt den uppgift som ska avbrytas klickar du på knappen Redigera uppgift .
- Klicka på knappen Avbryt uppgift . Bekräfta att uppgiften har tagits bort på nästa skärm.
5. Kontrollera cellbilder
- Varje uppgift innehåller mikroskopiska observationer (fotografering) före och efter uppgiftsarbetet. Observera cellodlingens framsteg fotografiskt genom att införliva en mikroskopisk fotograferingsuppgift före eller efter varje uppgift.
- Välj förinställda uppgiftsprogram, inklusive att välja flera specifika platser för skålen eller brunnsplattan i förväg för observation av fasta punkter för att övervaka samma plats över tid.
6. Passage och differentiering
- Följ stegen i avsnitt 1-5 och ställ in det automatiserade cellodlingssystemet så att det utför passering och differentiering. Instrumentinställningarna för passaging, kardiomyocytdifferentiering, hepatocytdifferentiering, neural prekursorcellsdifferentiering och keratinocytdifferentiering visas i tabell 1, tabell 2, tabell 3, tabell 4 respektive tabell 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Upprätthållande av humaninducerade pluripotenta stamceller
Vi använde tre hPSC-linjer (RIKEN-2F, 253G1 och KMUR001). Vi har optimerat underhållsprotokollet genom dagliga manuellt utförda experiment och ytterligare optimerat detaljprogrammen genom de sju preliminära experiment som utförs av systemet. Till exempel är skjuvspänningar som orsakas av spettets vätskehastigheter från olika pipetter som hanteras av människor och systemet ganska olika; Därför optimerade vi tidslängden för den enzymatiska nedbrytningen och antalet pipetteringar för celldispersion i systemet.
Humana inducerade pluripotenta stamceller hölls på en 10 cm skål belagd med 0,5 μg/cm 2-cellsodlingsmatris med hiPSC-odlingsmedium (t.ex. Neutristem eller StemFit AK02N). För passage programmerades systemet att tvätta hiPSC tre gånger med 5 ml fosfatbuffertsaltlösning utan kalcium (PBS[-]) och sedan behandla med 3 ml TrypLE-uttrycksenzym kompletterat med 10 μM av Rho-kinashämmaren (Y-27632) i 15 minuter vid 37 °C. Därefter tillsatte systemet 9 ml PBS(-) med 0,15 % bovint serumalbuminfraktion V (BSA) till plattan och utförde två rörelseuppsättningar som aspirerade 10 ml cellinnehållande vätska och dispenserade vätskan från pipettspetsen i en sicksackrörelse över plattans ovansida, som lutades 20° närmare plattans yta. och upprepade ovanstående sekvens av operationer med plattan lutad i 20° på motsatt sida. Sedan samlade systemet det cellinnehållande mediet i ett 15 ml rör och täckte det, varefter det centrifugerades vid 115 x g i 5 minuter för att deponera cellerna. Därefter aspirerade systemet supernatanten och dispergerade cellpelleten i enstaka celler med hjälp av 10 ml odlingsmedium med 10 μM Y-27632 genom pipettering 10 gånger. Systemet överförde 1 ml trypanblå lösning till ett nytt 15 ml rör, tillsatte sedan 1 ml av cellsuspensionen och blandade dem genom pipettering fem gånger. Därefter aspirerades 100 μL av Trypan blåfärgad celllösning och doserades i inloppsfönstret på engångshemocytometern i hållaren. Systemet flyttade hemocytometerhållaren till det mikroskopiska observationsområdet och tog ett foto, som omedelbart analyserades av programvara, och den erhållna cellkoncentrationen tillämpades på nästa steg. För underhåll av iPSC sådde systemet cellerna med en celldensitet på 15 000 celler/cm2 i nya plastplattor med en diameter på 10 cm belagda med 0,5 μg/cm 2-cellsodlingsmatris. För differentieringsexperiment sådde systemet cellerna vid den erforderliga celltätheten i det medium som förbereddes för varje somatisk celltyp i 6-brunnsplattor belagda med en cellodlingsmatris utspädd till 1/100. Slutligen utförde systemet korslåsning fem gånger innan plattorna överfördes till inkubatorn. Tre nya 10 cm-plattor innehållande iPSC:er och tre förbelagda plattor för cellodlingsmatris laddades in i systemet, och andra nödvändiga artiklar förbereddes också enligt de respektive procedurer som nämns ovan. En cykel av underhållskultur består av en passaging-uppgift på dag 1 följt av ett byte av odlingsmedium en gång om dagen i 3 dagar. Under hela experimentet var denna cykel inställd på fem cykler. Dessutom fylldes förbrukningsvaror på i tur och ordning.
Enligt det beställda schemat utfördes fem cykler av underhållskultur framgångsrikt som planerat av systemet. Från cellfotografierna som togs automatiskt under varje uppgift bekräftades det att cellerna förökade sig smidigt över tiden. Cellexpansionen (n = 3) beräknades och visades i figur 2. För att bekräfta om det odifferentierade tillståndet för iPSCs förblir oförändrat även efter underhållsodling i det automatiserade odlingssystemet, utfördes immunocytometorisk analys (Oct3/4 och SSEA4) med hjälp av de återstående proverna vid varje passering (Figur 3A). Dessutom, efter fem cykler, lastades de tre skålarna ut ur systemet, och immunhistokemisk analys (Oct3/4, SSEA4 och Tra1-81) utfördes också (Figur 3B). Båda analyserna med fluorescerande immunfärgning visade att iPS-cellernas odifferentierade tillstånd bevarades. Karyotypning av iPSC:er utfördes även före och efter underhållsodling i ett automatiserat odlingssystem. Även om en abnormitet observerades i en allel av kromosom 17 innan underhållskulturen påbörjades, observerades ingen särskild förändring av systemet efter 5 underhållsodlingar, inklusive avvikelsen (Figur 3C). De inställningar som används för underhåll av iPSC:er sammanfattas i tabell 1.
Differentiering
Kardiomyocyter
Differentieringsprotokollet från en tidigare publikation följdes här10. Systemet sådde odifferentierade hiPSCs (KMUR001) med en densitet av 30 000 celler/cm2 på cellodlingsmatrisbelagda 6-brunnsplattor i hiPSC-odlingsmedium kompletterat med 10 μM Y-27632. Systemet bytte medium till humant pluripotent stamcellsmedium med 6 μM av GSK-3ß-hämmaren CHIR-99021, 20 ng/ml Activin A och 10 ng/ml BMP4 efter 3 dagar (differentieringsdag 1). På differentieringsdag 3 bytte systemet till CDM3-medium: RPMI 1640, 500 μg/ml rekombinant humant albumin och 213 μg/ml L-askorbinsyra-2-fosfat med 2 μM Wnt-C59. På differentieringsdag 5 bytte systemet till färskt CDM3-medium; därefter upprepade man bytet till färskt CDM3-medium varannan dag. De inställningar som används för kardiomyocytdifferentiering av iPSCs sammanfattas i tabell 2.
Hepatocyter
Differentieringsprotokollet från en tidigare publikation följdes här11. Systemet sådde odifferentierade hiPSCs (RIKEN2F) med en densitet av 25 000 celler/cm2 på cellodlingsmatrisbelagda 6-brunnsplattor i hiPSC-odlingsmedium kompletterat med 10 μM Y-27632. Efter 2 dagar (differentieringsdag 1) bytte systemet medium till RPMI-1640 plus 2 % B27 Minus insulin (RPMI-B27) innehållande 100 ng/ml Activin A, 6 μM CHIR-99021 och 1 % glutamintillskott (t.ex. GlutaMAX) i 24 timmar. På differentieringsdag 2 bytte vi medium till RPMI-B27 med 50 ng/ml Activin A. På differentieringsdag 5 bytte systemet medium till RPMI-B27, innehållande 1 % glutamintillskott och 10 ng/ml BMP-4. På differentieringsdag 9 bytte systemet medium till hepatocytmognadsmedium: Leibovitz L-15-medium innehållande 8,3 % tryptosfosfatbuljong, 10 μM hydrokortison-21-hemisuccinat, 50 μg/ml natrium-L-askorbat, 100 nM dexametason, 0,58 % insulin-transferrin-selen, 2 mM glutamintillskott, 8,3 % fetalt bovint serum och 100 nM rac-1,2-dihexadecylglycerol. Därefter upprepade systemet bytet av medium till ett nytt medium varannan dag. De inställningar som används för hepatocytdifferentiering av iPSCs sammanfattas i tabell 3.
Neuronala prekursorceller
Differentieringsprotokollet från en tidigare publikation följdes här12. Systemet sådde odifferentierade hiPSCs (RIKEN2F) med en densitet av 25 000 celler/cm2 på basalmembranmatrisbelagda 6-brunnsplattor i Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM)/F12 och neurobasala medium (1:1) kompletterat med 10 % Knockout-serumersättning, 0,1 mM icke-essentiella aminosyror, 1 mM glutamintillskott med 10 μM TGF-beta-receptorhämmare (SB431542), 10 μM BMP-signalhämmare (dorsomorfin), och 10 μM Y-27632 (differentieringsdag 1). På differentieringsdag 5 bytte systemet medium till DMEM/F12 och neurobasalt medium 1:1 kompletterat med 0,1 mM icke-essentiella aminosyror, 1 mM glutamintillskott, 1 % N-2-tillskott, 1 % B-27-tillskott, 50 μg/ml askorbinsyra-2-fosfat, 10 μM SB431542 och 10 μM dorsomorfin. På differentieringsdag 9 ändrade systemet mediet till DMEM/F12 och neurobasalmedium 1:1 kompletterat med 0,1 mM icke-essentiella aminosyror, 1 mM glutamintillskott, 1 % N-2-tillskott, 1 % B-27-tillskott, 50 μg/ml askorbinsyra-2-fosfat och 1 μM all-trans-retinsyra. På differentieringsdag 13-16 bytte systemet medium varje dag med DMEM/F12 och neurobasalt medium 1:1 kompletterat med 0,1 mM icke-essentiella aminosyror, 1 mM glutamintillskott, 1% N-2-tillskott, 1% B-27-tillskott, 50 μg/ml askorbinsyra-2-fosfat och 10 ng/ml bFGF och 10 ng/ml EGF. De inställningar som används för neural prekursorcelldifferentiering av iPSCs sammanfattas i tabell 4.
Keratinocyter
Differentieringsprotokollet från en tidigare publikation följdes här13. Systemet sådde odifferentierade hiPSCs (253G1) med en densitet av 15 000 celler/cm2 i cellodlingsmatrisbelagda 6-brunnsplattor i hiPSC-odlingsmedium med 10 μM Y-27632. Efter 2 dagar senare (differentieringsdag 1) bytte systemet medium till Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM)/F12 och Neurobasalmedium (1:1) med 0,1 mM icke-essentiella aminosyror, 1 mM glutamin, 55 μM 2-merkaptoetanol, 1 % N-2-tillskott, 2 % B-27-tillskott, 50 μg/ml askorbinsyra-2-fosfat, 0,05 % bovint serumalbumin och 100 ng/ml FGF-basiskt. På differentieringsdag 3 och därefter byttes mediet till humant keratinocytmedium (utan tillägg för dag 3 och med tillägg på/efter dag 5) med tillsats av 0,5 μg/ml hydrokortison, 1 μM all-trans-retinsyra, 25 ng/ml hBMP-4, 2,4 μg/ml adenin, 1,37 ng/ml trijodtyronin, 0,3 mM askorbinsyra-2-fosfat, och 2 μM forskolin, varannan dag av systemet. De inställningar som används för keratinocytdifferentiering av iPSCs sammanfattas i tabell 5.
Som nämnts ovan utfördes hela processen med hjälp av endast automatiserad odlingsutrustning, från sådd av iPS-celler till den efterföljande serien av differentieringsprotokoll. Uttrycket av karakteristiska markörer i varje cell utvärderades (Figur 4). Det visade sig att differentiering kunde induceras med hjälp av endast ett automatiserat odlingssystem.
Figur 1: Sammanfattning av det automatiserade odlingssystemet. (A) Bild av systemet som visar storlek och layoutskiss 1. (B) Bild på arbetsbänken och layoutskiss 2. (C) Handverktyg: fat, rör och pipett. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Bando et al.9. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Passaging-uppgift och celltillväxt. (A) Kvadraten illustrerar varje process. (B) iPSC-expansion beräknad med hjälp av varje automatiserat cellantal i de tre oberoende experimenten. (C) Representativa bilder som tas automatiskt från passage till passage. Skalstreck = 400 μm och 100 μm (infälld). Denna siffra har modifierats med tillstånd från Bando et al.9. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Automatiserat långtidsunderhåll av iPSC. (A) Alla immunocytometriska analyser av de tre oberoende experimenten för Oct-3/4 och SSEA-4. Varje blått histogram indikerar att det inte finns någon primär antikroppskontroll. Varje rött histogram representerar den indikerade antigenspecifika signalen. (B) Representativa bilder av immunohistokemiskt färgade celler för Oct-3/4, SSEA-4 och Tra 1-81. Skalstreck = 50 μm. (C) Karyotyp av RIKEN2F-iPSC efter femte passagen. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Bando et al.9. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Immunhistokemisk färgning. Immunhistokemiska bilder av hepatocyter (skalstaplar = 100 μm), kardiomyocyter (skalstaplar = 100 μm), neuronala stamceller (skalstaplar = 100 μm) och keratinocyter (skalstaplar = 200 μm). Denna siffra har modifierats med tillstånd från Bando et al.9. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Passageförberedelser och systeminställningar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Preparat för differentiering av kardiomyocyter och systeminställningar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 3: Preparat för differentiering av hepatocyter och systeminställningar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 4: Förberedelser för differentiering av neurala prekursorceller och systeminställningar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 5: Preparat för differentiering av keratinocyter och systeminställningar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett kritiskt steg i protokollet är att om en användare hittar några fel, klicka på knappen Avbryt, stoppa eller återställ när som helst och börja om från det första steget. Programvaran kan undvika mänskliga misstag, inklusive dubbelbokning, öppna dörrar medan systemuppgifterna är aktiva och brist på påfyllning. En annan kritisk punkt för framgångsrik och effektiv differentiering till den önskade somatiska cellen är rätt val av pluripotenta stamcellslinjer eftersom varje pluripotent stamcell har en okontrollerbar bias i sina differentieringsegenskaper 14,15.
Detta automatiserade odlingssystem för inducerade pluripotenta stamceller kan bibehålla och differentiera dem till olika somatiska celltyper. Storleken på detta system är 200 cm (bredd), 110 cm (djup) och 233 cm (höjd), med en totalvikt på 1,2 ton. Inkubatorn som är inbyggd i enheten rymmer samtidigt trettiosex 10 cm skålar och nio multibrunnsplattor.
Förbättringar jämfört med tidigare modeller är att X-Y-Z-axelns skensystem först konverterades från en 6-axlig ledad arm, som fungerar genom att byta armens spetsverktyg till tre olika delar för tallrikar, rör och pipetter. Armen är upphängd i systemets tak och rör sig längs X-Y-Z-axeln. För det andra introducerades ett cellräkningssystem för foderfria underhållskulturer och differentieringsinduktionsprotokoll som utförs kontinuerligt från passagen. Efter att ha blandat den encelliga suspensionslösningen med den trypanblå lösningen överfördes den till en engångshemocytometer för mikroskopisk observation och avbildning. Programvaran analyserar automatiskt den erhållna bilden för att räkna antalet levande celler och beräkna den volym som krävs för att seeda det erforderliga antalet celler. Noggrannheten i cellantalet som erhölls genom denna bildanalys överensstämde med den som erhölls manuellt.
X-Y-Z-axelns skensystem användes för att hantera varje uppgift snabbare än den tidigare versionen (ledad arm med flera axlar). Med detta automatiserade odlingssystem utfördes fem kontinuerliga passager under 16 dagar, och iPSC:er utökades 625 ± 93 gånger. Även om beviset på uthållighet för tiden för cellunderhåll utan matarceller var kortare än vår tidigare demonstration med matarceller, var cellexpansionen effektivare jämfört med den tidigare demonstrationen6. Den förkortade arbetstiden verkade bidra till att förhindra att cellskador torkade ut under uppgifterna.
Dessutom utfördes differentieringsuppgifter från underhållsodling till differentiering till kardiomyocyter, hepatocyter, neuronala prekursorceller och keratinocyter utan mänsklig inblandning. Efter en serie av dessa kurer bekräftades det genom fluorescensimmunfärgning att de celler som erhölls i det automatiserade odlingssystemet ensamma hade differentierats till de önskade cellerna. Därför, genom att dela ett uppgiftsprogram och använda detta system, kan forskare som inte är bekanta med iPSC-cellhantering få iPSC-härledda somatiska celler för sin egen forskning. Dessutom skulle skillnader i reproducerbarhet mellan forskare eller anläggningar kunna elimineras så mycket som möjligt, och det skulle kunna säkerställa att celler av homogen kvalitet erhålls varje gång.
Genom att anta ett nytt skensystem kunde utrustningen minskas och minskas i vikt till 1,2 ton, ~200 kg lättare än tidigare. Dessutom kan kostnaderna för reservdelar och programinställningar minskas med cirka 10 000 US-dollar. Underhålls- och programmeringskostnaderna beräknades minska med 13 procent. För att motivera fler forskare att enkelt komma in i iPS-cellrelaterad forskning är det också viktigt att hålla nere kostnaderna för utrustningen6. Vi hoppas att nuvarande och nästa generations automatiska odlingssystem kommer att vara ett av bidragen till att hjälpa till att tillhandahålla iPSCs och iPSC-härledda differentierade celler av mer enhetlig kvalitet.
Systemets stora begränsningar är kylskåpets begränsade kapacitet för trevande lagring av kulturer och dess svaghet när det gäller att hantera små mängder (<100 μL) vätska. Dessutom inaktiverar bristen på sofistikerad artificiell intelligens automatisk optimering enligt cellens tillstånd i tid. Den mindre begränsningen är kravet på speciella pipettspetsar som tillhandahålls av systemtillverkarna 4,5. Vi utvecklar nästa generations odlingssystem som kommer att kunna hantera små mängder vätska för medelstora beredningar och inkluderar ett återkopplingsoptimeringssystem baserat på högpresterande artificiell intelligens (systeminlärning). Vår samarbetande tillverkare9 har tillräckligt med know-how för att bygga skräddarsydda system enligt användarnas speciella behov. Utöver detta kommer nästa generations system utrustade med mer generella och bredare funktioner snart att finnas på marknaden. Vi överväger också ett prenumerationsbaserat uthyrningssystem för att leverera uppdaterade system till alla användare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har inget att avslöja.
Acknowledgments
Studien finansierades av ett bidrag från New Business Promotion Center, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Osaka, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15% bovine serum albumin fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm plastic plates | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin mouse | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumin rabbit | Dako | A0001 | |
| All-trans retinoic acid | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Automated culture system | Panasonic | ||
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Bovine serum albumin | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
| Dexamethasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycerol |
| Disposable hemocytometer | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 12634010 | |
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Human pluripotent stem cell medium |
| Fetal bovine serum | Biowest, FL, United States | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292.MF | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Glutamine supplement |
| Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A goat | Santacruz | 6556 | |
| Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Silk | Nippi Inc., Tokyo, Japan | 892 021 | Cell culture matrix |
| Insulin-transferrin-selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Keratin 1 mouse | Santacruz | 376224 | |
| Keratin 10 rabbit | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | Patient-derived iPSCs | |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | 354277 | |
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Göttingen, Germany | 05-100-1A | cell culture medium |
| Oct 3/4 mouse | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Recombinant human albumin | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
| Rho kinase inhibitor, Y-27632 | Sellec Inc., Tokyo, Japan | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | undifferentiated hiPSCs |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| Sodium L-ascorbate | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokyo, Japan | AK02 | cell culture medium |
| TnT rabbit | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 mouse | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
| Trypan blue solution | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
| Tryptose phosphate broth | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, United Kingdom | 5148 | |
β  Tublin mouse |
Promega | G712A |
References
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).
- Egashira, T., et al. Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells. Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).
- Sasamata, M., et al. Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid. SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).
- Tristan, C. A., et al. Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).
- Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific Reports. 5, 16647 (2015).
- McClymont, D. W., Freemont, P. S. With all due respect to Maholo, lab automation isn't anthropomorphic. Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).
- Gonzalez, F., Zalewski, J. Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool. Robotics. 6 (4), 41 (2017).
- Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990 (2022).
- Tohyama, S., et al. Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).
- Shimojo, D., et al. Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
- Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).
- International Stem Cell Initiative. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Keller, A., et al. Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).
