تضمين رؤوس ذبابة الفاكهة البالغة في البارافين: تحضير الأنسجة لعلم الأنسجة

Abstract

< p class = "jove_content" >المصدر: Sunderhaus ، E. R. ، Kretzschmar ، D. علم الأنسجة الكتلي لتحديد التنكس العصبي في ذبابة الفاكهة . J. Vis. Exp. (2016).

يصف هذا الفيديو كيفية تضمين رؤوس ذبابة الفاكهة في البارافين باستخدام طريقة ذوي الياقات البيضاء ، وهي تقنية تعد رؤوس الذباب للتقسيم التسلسلي. تستخدم أقسام البارافين للفحوصات النسيجية لتشريح الدماغ ولتقييم التنكس العصبي. يوضح البروتوكول المميز كيف يمكن معالجة الذباب المتعدد في مستحضر واحد ، وبالتالي زيادة كفاءة الوقت وتقليل القطع الأثرية التجريبية.

Protocol

هذا البروتوكول مقتطف من Sunderhaus and Kretzschmar ، علم الأنسجة الجماعي لقياس التنكس العصبي في ذبابة الفاكهة ، J. Vis. Exp. (2016).

< p class = "jove_title" >1. تثبيت الرأس على الياقات والتضمين في البارافين

< strong class = "note" > ملاحظة: يجب أن تتم جميع الخطوات في عملية التثبيت في غطاء الدخان. على الرغم من أن ميثيل بنزوات لا يشكل خطرا على الصحة ، إلا أنه له رائحة مميزة للغاية ، والتي يمكن أن تكون غامرة إذا لم يتم التعامل معها في غطاء الدخان.

1. قبل تخدير الذباب ، اصنع 50 مل من محلول كارنوي عن طريق إضافة 15 مل من الكلوروفورم و 5 مل من حمض الخليك الجليدي إلى 30 مل من 99٪ إيثانول (لا تخلط الكلوروفورم وحمض الخليك). اسكبه في وعاء زجاجي ذو قاع مسطح ، مثل طبق متبلور ، للتأكد من أن الياقات يمكن أن تكون مسطحة ومغطاة بالكامل بالمحلول.
2. تخدير الذباب باستخدام ثاني أكسيد الكربون₂ أو الأثير.
3. يطير الخيط (حتى 20 مع معظم الياقات) من أعناقهم في الياقات باستخدام الملقط. تذكر محاذاة جميع الرؤوس في نفس الاتجاه ، كما هو موضح في <الفئة القوية = "xfig">الشكل 1أ ، وكن لطيفا لضمان عدم حدوث أي ضرر للرأس أو العينين.
4. قم بتضمين ذباب العين الجيبي (الأسهم ، <فئة قوية = "xfig" >الشكل 1أ) في مواضع عشوائية بحيث يمكن التعرف بسهولة على ترتيب الذباب في الأقسام. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كان للذباب التجريبي لون عين فاتح أو أبيض ، فقم بربط بعض الذباب ذو العيون الحمراء ، مثل النوع البري ، بينهما للتأكد من وجود صبغة كافية لتلطيخ الشريحة. سجل ترتيب الذباب على ورقة بروتوكول مع رقم الياقة إذا كنت تستخدم أكثر من طوق واحد.
5. بمجرد الانتهاء من الطوق ، ضعه في محلول كارنوي المحضر لمدة 3.5 - 4 ساعات.
6. تخلص من محلول Carnoy في علبة التخلص المناسبة وابدأ في غسل الإيثانول. تأكد من سكبها ببطء حتى لا تزعج وضع الياقات في الحاوية.
7. اغسل الياقات لمدة 30 دقيقة في 99٪ إيثانول مرتين.
8. اغسل الياقات بالإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 1 ساعة. تأكد من تغيير الغسالات في الوقت المحدد لمنع الجفاف المفرط.
9. ضع الياقات في ميثيل بنزوات O / N في RT. أغلق الحاوية بالبارافيلم لمنع تبخر ميثيل بنزوات.
10. صب ميثيل البنوزات في الحاوية المناسبة التي تستخدم لمرة واحدة في غطاء الدخان. أضف خليطا معدا مسبقا من 1: 1 نقطة انصهار منخفضة (56-57 درجة مئوية) شمع البارافين وميثيل بنزوات. من هذه النقطة فصاعدا ، يجب حفظ الياقات في حاضنة عند 65 درجة مئوية للتأكد من أن البارافين لا يتصلب
11. اسكب خليط ميثيل البنوزات والبارافين في الحاوية المناسبة التي تستخدم لمرة واحدة ، واسكب شمع البارافين النقي المنصهر ، المحفوظ عند 65 درجة مئوية ، على الياقات.
12. قم بتغيير البارافين بعد 30 دقيقة وكرر ذلك 5 مرات على الأقل. يجب إجراء ما لا يقل عن 6-8 غسلات.
13. بمجرد اكتمال الغسيل ، ضع الياقات في صينية مكعبات ثلج مطاطية بها فتحات بحجم الياقات تقريبا. صب البارافين المنصهر فوقها حتى يتم تغطيتها بالكامل واتركها تتماسك (حاول تجنب فقاعات الهواء).
14. قم بإزالة كتل البارافين التي تحتوي على الياقات من صينية مكعبات الثلج. افصل كتلة البارافين عن الياقة باستخدام شفرة حلاقة ، وقطع الياقة برفق. ستكون الرؤوس في كتلة البارافين بينما ستبقى الجثث في الياقة. يمكن الاحتفاظ بالكتل في درجة حرارة الغرفة.
15. لتنظيف الياقات ، انقعها في عامل إزالة التدقيق عند 65 درجة مئوية لإزالة البارافين ، وتنظيفها بفرك خفيف ، واغسلها بالإيثانول قبل إعادة الاستخدام.

Results

p class = "jove_content" >
الشكل 1: الأقسام التسلسلية للبارافين. أ) باستخدام طريقة ذوي الياقات البيضاء ، يمكن معالجة الذباب التجريبي والتحكم كعينة واحدة عن طريق ربطها في طوق واحد. يتم إدخال ذباب العين الجيبي عديم العين للتوجيه (الأسهم). ب) تخطيطي يوضح اتجاه رؤوس الذبابة في الياقة. ج) في هذه الصورة ، يتم توجيه أقسام من رؤوس ذبابة مختلفة من اليسار إلى اليمين على الشريحة. من أعلى إلى...

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments طوق جينيسي العلمية TS 48-100 نحن نستخدم أطواق مصنوعة حسب الطلب مصنوعة من قطعة واحدة من المعدن بدلا من الطبقات مثل تلك التي صممتها Genesee. صينية مكعبات الثلج المطاطية للتضمين متجر منزلي يمكن صنع الحجم ليناسب عن طريق لصق جدران إضافية طبق تبلور شركة فيشر العلمية 08-762-3 الاثير شركة فيشر العلمية E138-1 ايثانول شركة مختبرات ديكون 2701 كلوروفورم شركة فيشر العلمية سي 298-500 حمض الخليك الجليدي شركة فيشر العلمية أ 38-212 ميثيل بنزوات شركة فيشر العلمية M205-500 رائحة مميزة - استخدمه في غطاء الدخان! شمع البارافين منخفض نقطة الانصهار شركة فيشر العلمية تي 565 تأكد من الاحتفاظ بالذوبان الإضافي في حمام مائي 65 درجة مئوية