यह प्रोटोकॉल केली एट अलसे एक अंश है , विच्छेदन और इम्यूनोफ्लोरोसेंट मशरूम शरीर और फोटोरिसेप्टर न्यूरॉन्स के वयस्क ड्रोसोफिला मेलनोगास्टर दिमाग, जे विस Expमें स्टेनिंग । (2017).
1. विच्छेदन स्टेशन की तैयारी
- एक बड़े बेंचटॉप पर संलग्न फाइबर ऑप्टिक हंसनेक्स के साथ स्टीरियोमाइक्रोस्कोप और प्रकाश स्रोत की स्थिति। स्थिर हाथ आंदोलनों को बढ़ावा देने और विच्छेदन करते समय हाथ "शेक" को कम करने के लिए, यह आवश्यक है कि माइक्रोस्कोप के आसपास पर्याप्त हाथ और हाथ आराम की जगह उपलब्ध है। सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप के दोनों ओर लगभग 8 -10 इंच और माइक्रोस्कोप के आधार और बेंच के किनारे के बीच 4 - 6 इंच है।
- एक ग्लास 9-वेल या 3-वेल डिश के 2 या 3 कुओं को पीटीएन बफर के 1.0 एमएल (0.1 एम सोडियम फॉस्फेट बफर पीएच 7.2, 0.1% नॉनएनिक सर्फेक्टेंट के साथ भरें, पूर्ण बफर घटकों के लिए सामग्री की तालिका देखें) और बर्फ पर विच्छेदन स्टेशन के बगल में रखें। नए विच्छेदित दिमाग को इस डिश में स्थानांतरित कर दिया जाएगा और निर्धारण कदम तक संग्रहीत किया जाएगा।
नोट: यदि लाइव इमेजिंग की आवश्यकता है, तो विच्छेदन बफर 1x फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) या एचएल 3 बफर होना चाहिए। यदि इंट्रासेलुलर प्रोटीन स्थानीयकरण की आवश्यकता है, तो पीबीएस को विच्छेदन और निर्धारण के लिए वैकल्पिक बफर के रूप में भी इस्तेमाल किया जा सकता है। निर्धारण के बाद, कोशिका झिल्ली का पारमेबिलाइजेशन तब 0.1% या 0.3% नॉनएनिक डिटर्जेंट वाले पीटीएन वॉश का उपयोग करके किया जाना चाहिए।
- यदि PBS विच्छेदन और निर्धारण के लिए प्रयोग किया जाता है, तो पिपेट युक्तियों को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरण के दौरान प्लास्टिक पिपेट युक्तियों से चिपके रहने से दिमाग को रोकने के लिए डिटर्जेंट युक्तियों (जैसे पीटीएन) के साथ कम से कम एक बार धोया जाना चाहिए।
- एक खाली 35 मिमी ग्लास या प्लास्टिक पेट्री डिश का उपयोग करके, सिलिकॉन इलास्टोमर युक्त विच्छेदन पकवान का निर्माण करें। संक्षेप में, निर्माता के निर्देशों के अनुसार इलास्टोमर घटकों को मिलाएं, 35 मिमी व्यंजनों में डालें, और इसे एक सपाट सतह पर रात भर पॉलीमराइज करने दें। विच्छेदन व्यंजन युक्त इलास्टोमर का उपयोग संदंश के ठीक सुझावों की रक्षा के लिए किया जाना चाहिए, जो आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकता है यदि संदंश और एक कठिन सतह के बीच संपर्क किया जाता है, जैसे कि ग्लास डिश। हम नियमित रूप से ऑनलाइन खुदरा विक्रेताओं से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिलिकॉन लेपित व्यंजन भी खरीदते हैं। विच्छेदन के दौरान इसके विपरीत बढ़ाने के लिए, निष्क्रिय चारकोल (और इस प्रकार रंगीन काला) युक्त सिलिकॉन इलास्टोमर विच्छेदन व्यंजन विशेष रूप से उपयोगी होते हैं।
2. वयस्क मस्तिष्क विच्छेदन प्रक्रिया
- एनेस्थेटाइज 3 - 5 दिन पुराने वयस्क डी मेलनोगास्टर सीओ2 के साथ या बर्फ का उपयोग करके। यदि बर्फ का उपयोग कर रहे हैं, तो मक्खियों से युक्त शीशी को ~ 5 मिनट के लिए एक आइस बाल्टी में उल्टा (प्लग एंड एंड डाउन) रखें। शीशी को बर्फ में उल्टा रखने से मक्खियों को भोजन में दर्ज होने से रोका जा सकता है। एक बार मक्खियों को एनेस्थेटाइज्ड कर दिया गया है, तो मक्खियों को बर्फ में बैठे ठंडे धातु पैड या पेट्री डिश पर या सीओ2 उत्सर्जक फ्लाई पैड पर रखें। यदि न्यूरोडिजेनरेशन का विश्लेषण करने के लिए दिमाग को विच्छेदन करना है, तो पुरानी मक्खियों का भी उपयोग किया जा सकता है।
- पीटीएन का "बुलबुला" बनाने के लिए स्थानांतरण पिपेट या पी 200 पिपेट का उपयोग करके विच्छेदन पकवान के केंद्र में पीटीएन की एक छोटी राशि (150 - 200μL) रखें। विच्छेदन पकवान को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे रखें और प्रकाश व्यवस्था को समायोजित करें और ध्यान केंद्रित करें ताकि पीटीएन का बुलबुला देखने के क्षेत्र को भर सके और समान रूप से प्रकाशित हो।
- धातु या सीओ 2 पैड पर लेटे हुए मक्खियों में हेरफेर करें ताकि वे "पेट अप"(यानी,वेंट्रल साइड अप) हों।
- #5 संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, एक मक्खी के पेट को विच्छेदित करने के लिए समझें और, फ्लाई को पकड़ते हुए, विच्छेदन पकवान पर पीटीएन में इसे पूरी तरह से जलमग्न कर दें।
नोट: प्रोटोकॉल के शेष के लिए, सभी चरणों को किया जाना चाहिए जबकि सिर पीटीएन में डूबा हुआ है।
- #5 संदंश की एक दूसरी जोड़ी का उपयोग करना, मक्खी सूंड के आधार को समझें और शरीर से फ्लाई हेड को अलग करने के लिए दो जोड़ी संदंश को अलग करें। पेट और छाती को त्याग दें। इस चरण के दौरान, यह महत्वपूर्ण है कि सिर जारी नहीं किया जाता है और पीटीएन की सतह पर तैरने की अनुमति नहीं दी जाती है। एक बार सिर तैरने के बाद, मस्तिष्क को कुचले बिना फिर से समझना बहुत मुश्किल हो सकता है।
नोट: इस विधि का उपयोग करके, मस्तिष्क और वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड के बीच कनेक्शन कटे हुए हैं। यदि सीएनएस के इन क्षेत्रों के बीच अक्षुण्ण कनेक्शन की आवश्यकता है, तो एक वैकल्पिक विच्छेदन प्रोटोकॉल का पालन किया जाना चाहिए । यदि सिर निकालने से पहले फ्लाई हेड से सूंड अलग हो जाता है, तो एक छेद होगा जहां सूंड था। इस मामले में, एक आंख के पास छेद के किनारे पर फ्लाई हेड को समझें। फिर एक दूसरे से अलग संदंश के दो जोड़े खींचते हुए बल की एक मध्यम राशि का उपयोग कर सिर हटा दें। कभी-कभी, जब सिर को शरीर से हटा दिया जाता है, तो आंत और/या वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड सिर से जुड़ा रहता है और विच्छेदन जारी रखने से पहले हटा दिया जाना चाहिए ।
- जबकि संदंश की एक जोड़ी सूंड को पकड़ती है, दूसरी जोड़ी को दाईं मक्खी आंख के मध्यीय किनारे को समझना चाहिए। धीरे-धीरे, एक-दूसरे से अलग संदंश खींचें। यह कदम स्थिर पार्श्व बल की एक छोटी राशि के साथ किया जाना चाहिए। जैसे-जैसे संदंश धीरे-धीरे एक-दूसरे से अलग हो जाते हैं, सूंड को सिर से दूर खींचना चाहिए और सिर के क्यूटिकल में एक केंद्रीय छेद बनाना चाहिए। दूसरी जोड़ी से दाईं आंख के मध्यके हिस्से को जारी किए बिना संदंश की पहली जोड़ी के साथ सूंड को त्यागें।
नोट: वयस्क डी मेलनोगेस्टर मस्तिष्क फ्लाई हेड के कौडल(यानीपीछे/पीछे) क्षेत्र में होता है। इस प्रकार, सिर के उस क्षेत्र को लोभी से बचना चाहिए। आदर्श रूप से, मध्यकालीन रेटिना के पास सिर के केवल रोस्ट्रल(यानीसामने) भाग को सीधे संदंश द्वारा समझा जाना चाहिए। मस्तिष्क और संबद्ध श्वासनली अब छल्ली में केंद्रीय छेद के माध्यम से दिखाई देना चाहिए। इस समय, छेद से फैलने वाली श्वासनली के किसी भी सफेद तारदार धागे को हटाया और त्याग दिया जा सकता है।
- संदंश की दूसरी जोड़ी के साथ, बाएं रेटिना के मध्यीय किनारे (सिर के काटने में केंद्रीय छेद के किनारे पर) को समझें। रेटिना और संबंधित क्यूटिकल को हटाने के लिए, धीरे-धीरे संदंश को 180 डिग्री कोण पर एक दूसरे से दूर खींचें। चूंकि रेटिना अंतर्निहित ऑप्टिक पालि से अलग हो जाता है, इसलिए आपको तनाव में थोड़ी कमी महसूस करनी चाहिए। ऑप्टिक पालि फाड़ को रोकने के लिए धीरे-धीरे आगे बढ़ें।
नोट: इस चरण के दौरान बहुत जल्दी संदंश को अलग करने के परिणामस्वरूप ऑप्टिक पालि या मशरूम शरीर संरचनाओं में व्यवधान हो सकता है। कभी-कभी, क्यूटिकल हटा दिया जाएगा लेकिन रेटिना के टुकड़े ऑप्टिक पालि से जुड़े रहेंगे। मशरूम शरीर इमेजिंग कर रहे हैं, तो पूरे रेटिना को हटाना पूरी तरह से आवश्यक नहीं है। हालांकि, अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों (जैसे ऑप्टिक मस्तिष्क लोब्स के रेटिना न्यूरॉन इनरवेशन) के विश्लेषण से रेटिना को पूरी तरह से हटाया जा सकता है।
नोट: चूंकि रेटिना धीरे-धीरे मस्तिष्क के अंतर्निहित ऑप्टिक पालि से अलग हो जाता है, इसलिए ऑप्टिक पालि को सफेद, स्ट्रीनी ट्रेकिया से ढकी एक अपारदर्शी सफेद संरचना के रूप में नमूदार होना चाहिए। एक बार एक रेटिना हटा दिया गया है, यह खारिज किया जा सकता है । रेटिना न्यूरॉन्स के पथविथिवर्त का विश्लेषण करते समय, ऑप्टिक पालि को नुकसान को रोकने के लिए इस कदम के दौरान विशेष सावधानी बरती जानी चाहिए। फोटोरिसेप्टर न्यूरॉन्स के विच्छेदन और लाइव इमेजिंग पर केंद्रित एक अतिरिक्त प्रोटोकॉल भी उपलब्ध है।
- अब, जितना संभव हो उतना दृश्यमान श्वासनली को ध्यान से हटा दें। श्वासनली में पहले से ही हो सकता है या बाद में हवा से भर सकता है, जिससे दिमाग तैरने के लिए और संभावित रूप से, बाद में इम्यूनोस्टेपिंग चरणों के दौरान खो सकता है। श्वासनली को हटाने के लिए, #5 संदंश की एक बहुत तेज जोड़ी का उपयोग करके इसे मस्तिष्क से उठाएं।
- बाएं फ्लाई रेटिना के मध्य क्षेत्र को समझने के लिए दोनों जोड़े संदंश का उपयोग करके शेष रेटिना और आसपास के क्यूटिकल को हटा दें। रेटिना और क्यूटिकल के टुकड़ों को हटाने के लिए रेटिना को आधे हिस्से में सावधानी से फाड़ दें। कुछ मामलों में, मस्तिष्क को कुचलने के बिना शेष क्यूटिकल को हटाना विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण साबित होता है। इन मामलों में, हमने पाया है कि वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड के शेष किस्में इसके बजाय एक जोड़ी संदंश द्वारा समझा जा सकता है जबकि दूसरी जोड़ी संदंश का उपयोग क्यूटिकल के अंतिम को ध्यान से हटाने के लिए किया जाता है।
- एक p200 पिपेट का उपयोग करना, 9 या 3-अच्छी तरह से PTN युक्त पकवान के एक अच्छी तरह से विच्छेदित दिमाग ले जाएँ। एक ही जीनोटाइप के दिमाग को एक ही कुएं में एक साथ पूल किया जाना चाहिए और बर्फ पर रखा जाना चाहिए। मस्तिष्क के ऊतकों को विच्छेदन के एक घंटे के भीतर तय किया जाना चाहिए। दिमाग की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता है, तो दिमाग को छोटे बैचों में तय किया जा सकता है और पूल किया जा सकता है। अधिकांश परिस्थितियों में, एक अनुभवी शोधकर्ता आमतौर पर मस्तिष्क को विच्छेदन कर सकता है और इसे लगभग 3 - 5 मिनट में ग्लास संग्रह पकवान में स्थानांतरित कर सकता है।
