Summary
We presenteren een protocol voor het buigen van draadvormige bacteriële cellen bevestigd aan een cover-slip oppervlak met een optische val van de cellulaire buigstijfheid te meten.
Abstract
We hebben een protocol ontwikkeld om de buigstijfheid van draadvormige staafvormige bacteriën te meten. Krachten worden toegepast met een optische val, een microscopisch kleine drie-dimensionale voorjaar gemaakt van licht dat wordt gevormd wanneer een high-intensity laser beam is gericht op een zeer kleine spot met objectieve een microscoop lens. Te buigen van een cel, hebben we eerst binden levende bacteriën om een chemisch behandelde dekglaasje aan. Omdat deze cellen groeien, het midden van de cellen gebonden blijft aan de dekglaasje maar de groeiende uiteinden vrij zijn van deze terughoudendheid. Door het induceren van filamenteuze groei met de drug cefalexine, we zijn in staat om cellen waarin het ene uiteinde van de cel zat vast aan de oppervlakte te identificeren, terwijl de andere kant bleef ongehecht en vatbaar voor buigkrachten. Een buiging kracht wordt dan toegepast met een optische val door binding een polylysine-coated kraal aan het uiteinde van een groeiende cel. Zowel de kracht en de verplaatsing van de kraal worden geregistreerd en de buigstijfheid van de cel is de helling van deze relatie.
Protocol
- Grow E. coli cellen in Luria-Beltrani bouillon (LB) medium exponentiële fase (OD = 0.2-0.4).
- Groei van de cultuur in LB aangevuld met 50 ug / ml van cefalexine gedurende 15 min tot filamenteuze groei te induceren, en dan concentreren van de cultuur door 5 keer door centrifugeren.
- Maak PEI-gecoate dekglaasje door stromend 1% polyethyleenimine verdund in water in een flow-kamer, en wassen met water na een 5-minuten incubatie.
- Stromen de geconcentreerde celcultuur in de kamer, en gewassen met een mengsel van LB en cefalexine (50μg/mL) na 3 min tot losse cellen te verwijderen.
- Incubeer de kamer bij 37 ° C gedurende 30 min-1 uur te laten de bijgevoegde cellen groeien voor plaatsing op de optische trapping instrument.
- Maak polylysine-gecoate kralen door incuberen van 0,5 micrometer diameter van polystyreen parels (Bangs Labs) in 0,1% polylysine verdund in water gedurende 30 minuten. Was daarna de kralen 3 keer en resuspendeer in water.
- Verdun de kraal-oplossing met een factor twee in LB met cefalexine (50μg/mL) en voeg deze toe in de stroom kamer.
- Optisch val een drijvende kraal en raak het aan de vrije uiteinde van een cel. (We maken gebruik van een Mad Labs stad piëzo stadium om de controle over de beweging van het monster.) Wanneer een geschikte kraal / cel combinatie is gevonden, was de kamer met cefalexine in LB (50μg/mL) om losse kralen te verwijderen.
- Run op maat geschreven LabView programma om buigkrachten van toepassing op cel-en opnemen van kracht-verplaatsing data. Programma Details
- Kalibreer detector reactie van raster het scannen van de bijgevoegde kraal binnen de detectie laserstraal en het opnemen van 3D-PSD spanningssignalen.
- Identificeer cel lange as in de microscoop beeld.
- Bewegen cel in stappen in een richting loodrecht op de cel lange as.
- Noteer de afstand verplaatst en de verplaatsing van de optische val.
- Om te zetten verplaatsing naar toegepaste kracht met behulp van de eerder gemeten val stijfheid en op te slaan tip verplaatsing en kracht om bestand.
Geheimen van het succes: In stap 8), moet men op zoek naar een cel met een goed gedefinieerde vast te beëindigen. Sommige cellen zijn gewoon vast op een tip, en het buigen kracht zijn op het andere tip leidt tot een whole-cell draaien in plaats van buigen. Een geschikte paar wordt gevonden door het buigen van elke cel snel met de hand behulp van de joystick-gecontroleerde fase beweging.
Representatieve resultaten:
Figuur 1. Deze figuur toont kracht-verplaatsing data voor een enkele cel. De helling van deze lijn is de buigstijfheid van de cel.
Discussion
Het protocol hier gepresenteerde is ontworpen om kwantitatief te meten van de buigeigenschappen van bacteriële cellen. Het experiment setup kan worden toegepast op elke staafvormige cel die kan worden ondernomen om filamentously groeien. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze setup om de effecten van het cytoskelet filamenten probe op de buigstijfheid van E. coli-cellen. Deze zelfde techniek kan gebruikt worden om de rol van de druk, celwand stijfheid en andere intracellulaire componenten in het bepalen van de totale buigstijfheid van de cellen te evalueren.
Disclosures
De video productie van dit artikel was gesponsord door Mad Stad Labs, welke instrumenten worden gebruikt in deze studies produceert.
Acknowledgments
Wij erkennen nuttige adviezen uit Mingzhai Zon op binding cellen om oppervlakken. Wij danken Ned Wingreen en Zemer Gitai voor de waardevolle discussies. Dit onderzoek werd ondersteund door National Institutes of Health te verlenen P50GM07150, National Science Foundation LOOPBAAN award PHY-0844466 en de Alfred P. Sloan Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895-5G | |
| polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 181978-5G | |
| polylysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 0.5-μm-diameter polystyrene beads | Bangs Laboratories | PS03N | |
| Nano-LP Series nanopositioning system | Mad City Labs | NanoLP series | http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html |
References
- Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
- Morris, D. M., Jensen, G. J. Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells. Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).
