Summary
여기서는 형광 표지된 microRNA의 풍부함에 대한 체외 평가를 통해 microRNA 패키징의 역학을 연구하고 세포외 소포체(EV)로 내보낼 수 있는 간단한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
세포외 소포체(EV)는 다양한 세포에서 분비되는 세포 통신의 중요한 매개체입니다. 이러한 EV는 단백질, 지질 및 핵산(DNA, mRNA, microRNA 및 기타 비암호화 RNA)을 포함한 생체 활성 분자를 한 세포에서 다른 세포로 셔틀하여 수용 세포에서 표현형 결과를 초래합니다. 다양한 EV 화물 중에서 microRNA(miRNA)는 EV의 명확한 조절 장애와 풍부함으로 인해 미세 환경을 형성하고 수용 세포를 교육하는 역할로 많은 주목을 받았습니다. 추가 데이터는 많은 miRNA가 EV에 활발하게 로드된다는 것을 나타냅니다. 이러한 명백한 증거에도 불구하고, miRNA 분류의 역학 및 메커니즘에 대한 연구는 제한적입니다. 여기서는 EV-miRNA 로딩의 역학을 이해하고 miRNA 내보내기와 관련된 메커니즘을 식별하는 데 사용할 수 있는 EV-miRNA의 유세포 분석을 사용하는 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에서는 EV에서 농축되고 공여체 세포에서 고갈되도록 미리 결정된 miRNA를 형광단에 접합하고 공여체 세포로 transfection합니다. 그런 다음 형광 태그가 부착된 miRNA는 qRT-PCR을 사용하여 EV에 로딩되고 세포에서 고갈되는지 확인합니다. transfection control 및 transfection된 세포 집단을 게이팅하기 위한 도구로서, 형광 표지된 세포 RNA(세포 보유 및 EV 고갈)가 포함되어 있습니다. EV-miRNA 및 cell-retained-miRNA로 transfection된 세포는 72시간 동안 형광 신호에 대해 평가됩니다. EV-miRNA에 특이적인 형광 신호 강도는 세포 보유 miRNA에 비해 빠르게 감소합니다. 이 간단한 프로토콜을 사용하여 이제 miRNA 로딩의 역학을 평가하고 miRNA를 EV에 로딩하는 다양한 요인을 식별할 수 있습니다.
Introduction
MicroRNA(miRNA)는 전사 후 유전자 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 작은 비암호화 RNA의 가장 특징적인 하위 집합 중 하나입니다. 대부분의 miRNA의 발현과 생물발생은 핵에서 일차 miRNA(pri-miRNA)의 전사로 시작되는 일련의 조정된 사건을 따릅니다. 마이크로프로세서 복합체에 의해 precursor-miRNA(pre-miRNA)로 핵 처리된 후, pre-miRNA는 세포질로 내보내지고, 여기서 RNase III 엔도뉴클레아제에 의해 추가 처리를 거쳐 21-23개의 뉴클레오티드 성숙 miRNA 듀플렉스로 다이서됩니다1. 처리된 성숙한 miRNA의 가닥 중 하나가 표적 메신저 RNA(mRNA)에 결합하여 표적의 분해 또는 번역 억제를 유도합니다2. 여러 다양한 표적 mRNA를 동시에 조절하는 miRNA의 다원성 역할에 기초하여 miRNA 발현이 엄격하게 조절되는 것은 놀라운 일이 아닙니다3. 실제로, 부적절한 표현은 다양한 질병 상태, 특히 암의 원인이 됩니다. miRNA의 비정상적인 발현은 질병 특이적 시그니처를 나타낼 뿐만 아니라 예후 및 치료 잠재력의 표적으로 부상했습니다 4,5,6. 세포 내 역할 외에도 miRNA는 비자율적 역할도 합니다. 예를 들어, miRNA는 기증자 세포에 의해 선택적으로 EV로 패키징되어 정상 및 질병 생리학에서 다양한 표현형 반응을 유도하는 수용 부위로 내보낼 수 있습니다 7,8,9.
EV 관련 miRNA가 기능적 생체 분자라는 명확한 증거에도 불구하고, miRNA의 특정 하위 집합이 암과 같은 질병 상태에서 어떻게 조절되지 않는지, 그리고 세포 기계가 miRNA를 Evs10,11로 선택하고 분류하는 방법은 완전히 이해되지 않았습니다. 미세환경 조절에서 EV-miRNA의 잠재적인 역할을 감안할 때, 세포 간 통신 및 질병 발병기전에서 EV의 역할을 완전히 설명하기 위해 일부 miRNA의 내보내기와 관련된 메커니즘을 식별하는 것이 중요합니다. miRNA가 EV로 방출되는 과정을 이해하면 miRNA 수출의 중요한 매개체를 강조할 뿐만 아니라 잠재적인 치료제에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이러한 수준의 지식을 얻기 위해서는 이러한 새로운 실험적 질문에 충실하게 대처할 수 있도록 도구를 조정해야 합니다. 실제로, 전기차를 평가하는 연구는 새로운 기술과 제어 장치의 도입으로 인해 기하급수적으로 증가하고 있다12,13. EV로 수출된 miRNA의 풍부도를 평가하는 것과 관련하여 차세대 염기서열분석 및 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)이 현재 표준 도구였습니다. 이러한 도구는 EV에서 miRNA의 풍부도를 평가하는 데 유용하지만 감도와 특이성에는 한계가 있으며 역학을 평가하기 위해 이러한 정적 접근 방식을 사용하는 것은 충분하지 않습니다. miRNA를 EV로 수출하는 역학을 설명하려면 특수 도구의 조합이 필요합니다. 여기에서는 형광 복합 miRNA를 사용하여 기증자 세포에서 miRNA 방출 및 EV로의 통합의 역학을 분석하는 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 또한 이 방법의 장점과 한계에 대해 논의하고 최적의 사용을 위한 권장 사항을 제공합니다. 이 논문에 제시된 다재다능한 방법은 EV로의 miRNA 방출과 세포 통신 및 질병에서의 잠재적 역할을 연구하는 데 관심이 있는 연구자에게 유용할 것입니다.
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Protocol
참고: 이 기술을 사용하기 위한 전제 조건으로, 선택적으로 내보낸 miRNA의 식별 및 검증이 필요합니다. EV로 분류된 miRNA 화물에 따라 세포주가 다르기 때문에 사용 전에 관심 세포주 및 관련 EV에서 miRNA를 평가하는 것이 좋습니다. 또한 리포펙타민 기반 transfection은 프로토콜의 중요한 단계 중 하나입니다. 실험을 설정하기 전에 transfection 효율을 미리 결정하는 것이 좋습니다.
1. 형광단 접합 EV-miRNA를 이용한 배양 및 transfecting 세포에서 세포 성장
- 200,000 내지 400,000 세포를 적절한 배양 배지에서 6-웰 플레이트의 삼중 웰에 플레이트한다. 균일한 세포 분포를 보장하기 위해 플레이트를 부드럽게 휘젓습니다. 세포가 70%-80% 밀도에 도달할 때까지 약 24-48시간 동안 배양합니다.
- transfection할 각 웰에 대해 제조업체의 지침에 따라 microcentrifuge 튜브에 있는 100μL의 무혈청 배지에 transfection 시약을 희석합니다.
참고: 이 설정 전에 관심 세포주에 대한 최적의 지질 농도를 결정해야 합니다. - transfection할 각 웰에 대해 형광단 접합 EV-miRNA(2nM)와 cell-miRNA(2nM)를 100μL의 무혈청 배지에 있는 마이크로 원심분리 튜브에 별도로 희석합니다.
참고: 총 부피는 transfection된 well의 총 수에 대해 계산해야 합니다. 이 프로토콜에서 형광은 7개의 시점에서 평가되었습니다. 따라서, 총 부피는 단계 1.2의 경우 700 μL, 단계 1.3의 경우 700 μL였다. 또한 세포의 양성 형광 집단을 확실하게 캡처하려면 사용자는 비형광 스크램블 miRNA로 세포를 transfection하고 이러한 세포를 배제하는 게이트를 설정해야 합니다. - 희석된 RNA 혼합물(1.3단계)을 희석된 transfection 시약(1.2단계)에 추가하고 튜브를 3-4회 뒤집어 부드럽게 혼합합니다. 결합된 지질-RNA 혼합물을 실온(RT)에서 30분 동안 배양합니다.
- 세포에서 일반 배양 배지를 제거하고 각 웰에 800μL의 무혈청 배지를 추가합니다. 200μL의 지질-RNA 혼합물(1.4단계에서)을 세포에 적하 방식으로 부드럽게 추가합니다.
참고: Opti-MEM 배지는 관심 세포주(Calu6 세포)를 transfection하는 데 사용되었습니다. 지질-RNA 혼합물을 배양 배지에 직접 첨가하고 혼합물을 플레이트 측면에 첨가하지 마십시오.
2. 형광 분석을 위해 다양한 시점에서 transfection된 세포 수확
- 형질주입된 세포를 37°C에서 7시간 동안 배양합니다.
참고: 두 miRNA(EV-miRNA 및 cell-miRNA)의 일관된 transfection을 검증하기 위해 transfection 3시간 후 하나의 웰에서 세포를 수집하여 유세포 분석기를 사용하여 형광을 분석합니다. - 7시간 배양 기간 후 웰에서 transfection complex를 제거하고 완전한 배지로 교체합니다.
- 7시간 시점을 평가하려면 세포를 수확하고 1x PBS로 세포를 세 번 세척합니다.
- 부착 세포로 작업하는 경우 200μL의 트립신을 하나의 웰에 추가하고 세포가 플레이트에서 분리될 때까지 기다립니다. 분리된 세포를 마이크로 원심분리 튜브와 펠릿으로 옮기고 200xg에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 세포 펠릿이 파괴되지 않도록 상층액을 조심스럽게 폐기하십시오. 첫 번째 PBS 세척의 경우 펠릿을 ~500μL의 1x PBS에 재현탁시키고 위의 원심분리 단계를 사용하여 펠릿화를 반복합니다. PBS 세척을 추가로 두 번 반복합니다.
- 200μL의 2% 파라포름알데히드(PFA) 용액에 세포 펠릿을 재현탁시키고 형광을 평가합니다.
참고: 2% PFA를 첨가한 후 셀 펠릿을 4°C에서 3-4일 동안 보관할 수 있습니다.
- 섹션 2.3의 단계에 따라 나머지 시점을 수집합니다. 저장된 모든 세포 펠릿을 수집하고 섹션 3의 단계를 진행합니다.
3. 세포 내 cell-miRNA 및 EV-miRNA 신호의 유세포 분석
- 유세포 분석을 위해 세포를 준비합니다. 형광단 분석을 방해할 수 있는 파편과 세포 응집체를 제거할 수 있도록 둥근 바닥 폴리스티렌 FACS 튜브의 일부인 섹션 2에서 35μm 스트레이너 캡까지 셀 현탁액을 여과합니다.
- 교정 지침에 따라 기기를 설정합니다. 유세포 분석기를 켜고 사용하기 전에 최소 30분 동안 예열하십시오. 피복 유체로 유체 시스템을 프라이밍하고 레이저 정렬을 확인하고 조정합니다.
- 기기 유체를 확인하기 위해 품질 관리를 실행합니다. 초순수 여과수를 유세포 분석기에 넣고 적절한 수집 시간 동안 적절한 유속으로 실행합니다.
참고: 적절한 유속과 수집 시간은 관심 세포 유형, 샘플 복잡성 및 원하는 데이터 품질에 따라 달라집니다. - 유세포 분석 데이터 분석 소프트웨어를 열고 검출기 및 레이저의 성능을 확인합니다. 관심 세포주와 선택한 형광단을 기반으로 검출을 위한 임계값 및 전압 파라미터를 설정합니다.
참고: 모든 다운스트림 실험에는 Calu6 셀이 사용되었습니다.- FSC 5000에서 Calu6 셀에 대한 신호를 캡처하기 위한 임계값을 설정합니다. 각 실험 반복에 대해 1 x 104 개 셀에 대한 분석을 수행합니다.
- 서로 다른 형광단 간의 스펙트럼 중첩을 설명하려면 형질주입되지 않은 세포와 형광단 중 하나로만 독립적으로 형질주입된 세포를 사용하여 보정 제어를 설정합니다.
- miRNA 내보내기 검출을 위해 Alexa-fluor 488에 접합된 후보 EV-miRNA(miR-451a 및 miR-150)와 Cy3에 접합된 대조 세포-miRNA(cel-miR-67)를 사용합니다.
- 각 EV-miRNA에 대해 형광단을 5p 가닥의 5′ 말단에 접합합니다. transfection하기 전에 형광단 접합 가닥을 100% 상보적인 3p 가닥으로 어닐링합니다.
- transfection된 세포의 발현 분석을 위해 각각 258, 192, 269 및 423 전압 단위로 설정된 FSC, SSC, FITC 및 PE 채널을 사용하여 샘플을 분석합니다(그림 1A, B).
- 음성 대조군 샘플을 유세포 분석기에 주입합니다. 사용자 지정 워크시트에서 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC) 강도를 정의한 후 세포 신호를 캡처합니다.
- 플롯에서 X축으로 FSC를 선택하고, Y축으로 SSC를 선택하고, 관심 있는 모집단으로 gate를 선택하여 그 주위에 다각형을 그립니다( 그림 1B, 하단 패널 참조).
- 게이트 모집단을 사용하여 새 플롯을 생성합니다.
- cell-miRNA 검출을 위해 X축을 형광 신호 1(FS1)로 설정하고 EV-miRNA 검출을 위해 Y축을 형광 신호 2(FS2)로 설정합니다. 형광 태깅된 각 miRNA로 독립적으로 transfection된 세포를 사용하여 개별 형광단에 대한 보상 파라미터를 설정합니다. 새 플롯에서 관심 있는 모집단에 대한 게이트입니다.
- EV-miRNA 검출을 위해 FITC 채널을 사용하십시오. cell-miRNA 신호의 평가에는 PE 채널을 사용합니다. 소프트웨어에서 X축으로 FITC를 선택하고 Y축으로 PE를 선택했을 때 이중 형광 모집단 주위에 다각형을 그려 FITC와 PE 모두에 대해 양성인 셀 주위에 게이트를 만듭니다.
- 제어된 모집단에 대한 통계를 기록합니다.
- 게이트 모집단에서 FITC 및 PE에 대해 양성인 세포와 FITC 또는 PE에 대해 양성인 세포의 비율을 기록합니다.
- 실험의 추가 샘플 또는 대조군에 대해 위의 단계를 반복합니다.
4. transfection된 세포에서 EV 분리
- 혈청 함유 배지에서 배양된 세포의 경우 교차 오염을 방지하기 위해 혈청에서 EV를 고갈시킵니다.
- EV 고갈 혈청을 생성하려면 세포 배양 배지에서 혈청을 50%로 희석하여 점도를 낮추고 생성된 50% 혈청을 110,000 x g 에서 18시간 동안 원심분리합니다.
- 상층액(EV-free 혈청)을 조심스럽게 수집하고 0.2μm 필터 어셈블리를 사용하여 여과합니다. 50% EV-free 세럼을 사용하여 완전한 배지(이 경우 RPMI와 10% 세럼)를 생성합니다.
- EV를 수집하려면 EV가 고갈된 전체 배지를 세포에 추가하고 배양 후 48시간 후에 EV를 수집합니다.
참고: 아래에 설명된 프로토콜은 Kowal et al.14에서 수정되었습니다.
- 15cm 조직 배양 접시에서 세포를 80% 밀도로 성장시킵니다. 프로토콜 섹션 1의 transfection 프로토콜에 따라 10mL의 Opti-MEM에서 cell-miRNA 및 EV-miRNA로 세포를 별도로 transfection합니다.
참고: 모든 transfection 프로토콜이 선형적으로 확장되는 것은 아닙니다. 먼저 15cm 플레이트에서 transfection 조건을 조정하고 평가하는 것이 필수적일 수 있습니다. - 7시간 후 transfection 배지를 흡인하고 EV 고갈된 배지(15mL)로 교체합니다. EV가 고갈된 배지에서 48시간 동안 세포를 성장시킵니다.
- 세포에서 조절된 배지를 제거하고 생물 안전 작업대 내부의 50mL 원심분리 튜브에 분주합니다. 조절된 배지를 2000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 죽은 세포와 세포 파편을 제거합니다. 생성된 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.
- 상층액을 10,000 x g 에서 4°C에서 40분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 0.2μm 필터 어셈블리를 사용하여 여과합니다.
- 여과된 세포 배양 배지를 생물안전 작업대 내부의 멸균 초원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브의 무게를 측정하고 균형을 맞춥니다. 샘플을 110,000 x g 에서 4°C에서 90분 동안 회전합니다. 상층액을 버리십시오.
- 펠릿을 적절한 부피의 1x PBS에 재현탁시켜 세척하고 110,000 x g 에서 90분 4°C 동안 원심분리합니다.
참고: EV 펠릿은 이 연구에 사용된 고정각 로터 튜브에 허용되는 최대 부피를 기준으로 60mL의 1x PBS에 재현탁되었습니다. - PBS를 흡입하고 EV 펠릿을 적절한 부피(50-100μL)의 신선한 1x PBS 및 와류에 현탁시킵니다. 나중에 사용할 수 있도록 EV를 -80°C에서 보관하십시오.
5. EV에서 cell-miRNA 및 EV-miRNA 신호의 유세포 분석
- 유세포 분석을 위한 EV 현탁액을 준비하려면 EV를 한외여과된 1x PBS의 적절한 부피로 희석합니다.
참고: EV의 유세포 분석을 위한 로딩 부피는 샘플의 EV 수를 기준으로 결정해야 합니다. 대략적으로 EV 현탁액에 ~30,000개의 입자가 있는 경우 최종 부피는 500x PBS에서 ~600-1μL여야 합니다. 깨끗한 샘플에는 약 35-50개의 입자/μL가 있습니다. - 나노 유세포 분석기 또는 나노 크기의 입자를 분석할 수 있을 만큼 강력한 대체 장비를 사용하십시오.
참고: 여기서는 Attune NxT 나노 유세포 분석기를 사용했습니다. - 소프트웨어를 열고 권장 교정 지침에 따라 기기를 설정합니다. 성능 nano-beads를 이용하여 성능 테스트를 수행한다. 나노 비드가 표준 크기 범위에서 검출되면 성능이 최적입니다. EV 입자 검출에 적합한 유량을 결정합니다.
- 초순수 여과수를 사용하여 품질 관리를 실행하여 기기 유체 및 검출기 및 레이저의 성능을 확인합니다.
- 실험에 적합한 보정 비드를 사용하여 다양한 크기의 비드를 정확하게 검출하고 형광 신호를 측정하도록 유세포 분석기를 설정합니다.
참고: 유세포 분석에 의한 EV 분석 설정을 위해 ApogeeMix 비드가 사용되었습니다. 이 비드에는 80nm에서 1300nm 크기의 비형광 실리카 비드와 형광 폴리스티렌 비드의 혼합물이 포함되어 있습니다.- 제조업체의 프로토콜에 따라 비드 혼합물에서 다양한 모집단의 민감도와 분리능을 평가하기 위해 파라미터를 설정합니다. 적절한 게이팅을 사용하여 기기 노이즈에서 비드 모집단을 해결합니다.
- 분석을 위해 로드하기 전에 EV가 고르게 분포되도록 샘플을 완전히 소용돌이칩니다.
- 유세포 분석 데이터 분석 소프트웨어를 열고 초미세 여과 PBS를 도입하십시오. 한외 여과된 PBS를 사용하여 EV 입자에 대한 게이팅을 설정하고 게이팅이 5.5단계의 비드를 기반으로 적절한 입자 크기에 해당하는지 확인합니다.
- 음성 대조군 샘플을 로드하여 EV가 유세포 분석기를 통과할 때 EV를 분석합니다. X축에 FSC를 플로팅하고 Y축에 SSC를 플로팅하면서 EV 신호를 캡처합니다.
참고: EV 캡처를 위한 SSC 임계값은 300으로 설정되었습니다. 획득 부피는 총 145μL의 인출 부피에서 95μL로 설정되었습니다. 유속은 12.5μL/min으로 설정되었습니다. 분석은 1 x 106 EV 입자로 수행되었습니다. EV 개체군은 이질적이며 EV와 함께 일부 파편이 고립됩니다. FSC 대 SSC 플롯의 전체 입자 검출은 다양한 범위의 입자를 강조하며, 이는 조잡한 EV 제제를 사용할 때 예상됩니다. - 게이트 모집단을 사용하여 새 플롯을 생성합니다.
- 이번에는 X축에서 cell-miRNA 검출을 위해 형광 신호 1(FS1)을 선택하고 Y축에서 EV-miRNA 검출을 위해 형광 신호 2(FS2)를 선택합니다.
- 단일 miRNA로 transfection된 세포에서 분리한 EV 샘플을 사용하여 형광단에 대한 보정 파라미터를 설정합니다. 새 플롯에서 관심 있는 EV 모집단에 대한 게이트입니다.
- transfection된 세포에서 분리된 EV에서 형광단 접합 miRNA의 발현 분석을 위해 각각 370, 370, 400 및 400 전압 단위로 설정된 FSC, SSC, BL1 및 YL1 채널을 사용하여 EV 샘플을 분석합니다(그림 2A, B).
- 제어된 모집단에 대한 통계량을 기록하고 히스토그램과 점도표를 사용하여 시각화합니다.
- 실험의 추가 샘플 또는 대조군에 대해 위의 단계를 반복합니다.
6. qRT-PCR을 통한 EV의 miRNA 방출 검증
- 제조업체의 지침에 따라 miRVana RNA 분리 키트를 사용하여 EV 및 모세포에서 RNA를 추출합니다.
참고: EV에서 분리된 RNA의 총량이 일반적으로 표준 나노 드롭의 최소 수량 임계값을 초과하지 않기 때문에 EV에서 분리된 RNA의 정량화는 불가능합니다. 이는 EV 샘플에서 리보솜 RNA가 고갈되기 때문이며, 이는 애질런트 바이오분석기를 사용하여 검증할 수 있습니다. 따라서 EV-RNA 정량화에 대한 무결성 점수는 일반적으로 신뢰할 수 없으며 EV-RNA 양의 실제 표현이 아닙니다. 따라서 EV-RNA 및 cell-RNA의 qRT-PCR 정량화를 위해 동일한 수의 세포에서 분리한 후 동일한 부피의 RNA 분리물을 사용했습니다. qRT-PCR의 정규화를 위해 이전에 획득한 RNA 염기서열 분석 데이터에서 결정된 여러 샘플에 걸쳐 유비쿼터스로 존재하는 miRNA가 사용되었습니다. - small RNA에 특이적인 역전사 효소 키트를 사용하여 추출된 RNA를 cDNA로 변환합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 cDNA 템플릿과 miRNA 특이적 프라이머를 사용하여 qRT-PCR 반응을 설정합니다.
참고: 검증 실험을 위해 miRCURY LNA qRT PCR 키트와 제조업체의 해당 프라이머를 사용하여 cell-miRNA 및 EV-miRNA의 발현을 평가했습니다.
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Representative Results
여기서는 세포에서 EV로의 miRNA 방출을 조사하기 위한 강력한 도구로 유세포 분석을 활용합니다. 이 프로토콜을 사용하여 cell-miRNA 및 EV-miRNA로 transfection된 세포의 유세포 분석 분석은 EV-miRNA에 해당하는 형광 신호의 순차적 감소를 나타내는 반면 cell-miRNA에 해당하는 신호는 세포에 유지되는 것으로 나타났습니다. 형광단 접합이 EV로의 miRNA 방출을 방해하지 않도록 하기 위해 miR-451a를 두 개의 개별 형광단(즉, Alexa fluor 488 및 Alexa fluor 750)에 접합하고 세포 머무름을 평가했습니다. 결과는 transfection 후 개별 형광단 신호 검출 간의 변동성이 최소화되었음을 나타내며 이 접근법의 신뢰성을 검증합니다(그림 3A,B).
RNA 분해를 포함하여 세포에서 형광 표지된 miR-451a의 손실을 설명할 수 있는 여러 가지 이유가 있기 때문에 세포 손실이 EV 풍부도와 일치하는지 확인하는 것이 중요했습니다. 유세포 분석을 사용하여 EV에서 Alexa fluor-488에 접합된 miR-451a의 축적을 시간 의존적 방식으로 관찰하여 miRNA를 EV로 효율적으로 패키징하고 궁극적으로 방출한다는 증거를 제공했습니다. 대조적으로, 세포 보유 miRNA에 해당하는 형광 신호인 cel-miR-67은 EV에서 검출되지 않았습니다(그림 4). 이 새로운 접근법을 사용한 이러한 발견은 qRT-PCR을 사용하여 검증되었으며, 이는 cell-miRNA, cel-miR-67과 비교할 때 추가 EV-miRNA인 miR-150에 대해 훨씬 더 높은 EV/세포 발현 비율을 나타냈습니다(그림 5).
그림 1: 세포의 신호 검출을 위한 유세포 분석기 파라미터 설정. (A) 세포 형광 분석을 위해 소프트웨어를 사용하여 표시된 매개변수에 대해 강조 표시된 전압을 설정했습니다. 이 기기는 샘플당 10,000개의 세포를 기록하도록 설정되었습니다. 인스펙터 뷰 는 탐지 및 분석을 위해 설정된 파라미터를 확인합니다. (B) 세포 형광 분석을 위해 FSC 파라미터의 임계값 은 소프트웨어의 유세포 분석기 설정 탭에서 5,000으로 설정되었습니다. 오른쪽 상단 패널에는 데이터 캡처를 위한 레이저 설정이 표시됩니다. 아래쪽 패널에는 세포 감지가 진행되는 동안 활성 전역 워크시트가 표시됩니다. 샘플은 중간 흐름에서 실행되었으며 FSC-A 및 SSC-A를 각각 x축 및 y축 매개변수로 설정하면서 캡처되었습니다. 게이팅은 관심 있는 인구 주위에 그리기 다각형 도구를 사용하여 설정되었습니다. 게이팅은 세포 집단의 다양성에 따라 다른 관심 세포주에 대해 다를 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: EV의 신호 검출을 위한 유세포 분석 파라미터 설정. (A) EV의 검출 및 다운스트림 분석을 위해 획득 부피는 95μL로 설정되었으며 유속은 12.5μL/min으로 설정되었습니다. EV 감지를 위해 선택한 임계값은 사용된 교정 비드를 기반으로 하는 소프트웨어의 기기 설정 탭에서 0.3 x1000이었습니다. FSC, SSC, BL1 및 YL1의 전압은 각각 370, 370, 400 및 400이었습니다. (B) 이기종 EV 모집단을 캡처하고 EV를 기기의 배경 소음과 구별하기 위한 게이팅 설정. 빈 PBS 샘플(상단)은 EV 모집단의 배경 소음을 해결하기 위한 음성 대조군으로 사용되었습니다. EV 샘플(아래)은 샘플이 크기 범위에서 입자가 겹치는 이질적이기 때문에 관심 모집단이 전체 모집단의 1.8%에 불과하다는 것을 보여줍니다. 그러나 관심 있는 EV 모집단을 감지하기 위해 엄격한 게이팅이 선택되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 유세포 분석을 통한 세포의 신호 검출. (A) EV-miRNA 및 cell-miRNA에 해당하는 형광은 transfection 후 7시간에서 72시간 사이에 표시된 시간에 세포에서 검출되었습니다. EV-miR-451a(Alexa fluor-488)에 해당하는 신호는 세포 보유 miRNA, cel-miR-67의 신호에 비해 시간이 지남에 따라 감소했습니다. (B) Alexa fluor-750으로 표지된 EV-miR-451a에 해당하는 형광은 miR-451a로 표지된 Alexa Fluro-488과 동일한 경향을 보였으며, 이는 형광단이 세포에 의한 miRNA의 머무름에 영향을 미치지 않음을 나타냅니다. 전반적으로, 대표적인 결과는 transfection된 miRNA가 miRNA를 EV로 내보내는 것을 기반으로 내인성 miRNA와 유사하게 행동한다는 것을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 유세포 분석을 통한 EV의 신호 검출. EV-miR-451a 및 cell-cel-miR-67에 해당하는 형광은 transfection 후 24시간 및 48시간 EV에서 검출되었습니다. EV-miR-451a(Alexa fluor-488)에 해당하는 신호는 형질주입 후 48시간 후에 EV에서 캡처되었습니다. 대조적으로, cel-miR-67에 대한 신호는 EV에서 감지되지 않았습니다. 그림 2B와 같이 빈 PBS 샘플을 사용하여 이 실험에 대한 게이팅을 설정했습니다. 비형광 스크램블 RNA로 transfection된 세포에서 분리한 EV 샘플을 음성 대조군으로 사용했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: qRT-PCR을 사용한 세포 및 EV의 EV-miRNA 및 cell-miRNA 정량화. Calu6 세포는 각각 2nM의 miR-150 및 cel-miR-67로 형질주입되었습니다. EV는 형질주입 후 48시간 후에 수집되었습니다. EV 농축은 miR-150 및 cel-miR-67에 대해 형질주입된 Calu6 세포에서 EV 발현을 세포 발현으로 나눈 비율로 계산되었습니다. Calu6 세포에서 miRNA의 발현과 해당 EV를 비교하는 RNA 염기서열 분석 결과를 기반으로 miR-30c는 접힘 변화 계산을 위한 내인성 대조군 및 정규화기로 사용되었습니다. 제시된 데이터는 하나의 생물학적 복제물에서 얻은 것이며, 각 데이터 포인트는 3개의 qRT-PCR 반응을 나타냅니다. 데이터는 평균± SD로 표현되며, p-값은 Welch의 수정(**p < 0.01)과 함께 쌍을 이루지 않은 t-검정을 사용하여 계산되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 강점 | 약점 |
| 세포 및 각 EV에서 여러 miRNA의 선택적 내보내기를 동시에 평가할 수 있습니다. | 능동적 수출 현상과 수동적 수출 현상을 구별하기 위한 추가 절차 필요 |
| 조잡한 이질적인 집단에 대한 평가가 가능하며 EV 집단의 사전 분리가 필요하지 않습니다. 다양한 유형의 EV를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 알림: 다양한 유형의 입자 검출 임계값은 다를 수 있습니다 |
감도가 낮으면 세포 또는 EV에서 제한된 농도의 miRNA를 검출할 수 없습니다. 이는 EV에서 RNA 분리 후 다운스트림 qRT-PCR 분석을 통합하여 극복할 수 있습니다 |
| miRNA 정량화에 사용되는 표준 분석법에 비해 설정 및 분석에 짧은 시간이 필요합니다. | 다양한 유형의 장비, 세포주 및 다양한 형광단에 대한 표준화 프로토콜이 부족합니다. |
표 1: 프로토콜의 주요 강점과 약점.
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Discussion
새로 확립된 프로토콜은 EV-miRNA의 transfection 후 EV로 miRNA 방출의 역학을 캡처할 수 있습니다. 이 접근법을 사용하면 세포분석기의 기능에 따라 여러 EV-miRNA 및 cell-miRNA를 동시에 분석할 수 있습니다. 또한 유세포 분석 분석은 EV miRNA 생물학에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있지만 한계가 없는 것은 아닙니다. 그러나 보다 포괄적인 이해를 위해 다른 기술과 함께 사용할 때 일부 제한 사항을 극복할 수 있습니다.
EV 생물학에서 새롭게 떠오르는 관심 분야는 miRNA를 EV로 선택적으로 내보내는 것을 이해하는 것입니다15,16. 이 프로토콜은 miRNA의 선택적 내보내기를 연구할 수 있는 강력한 도구를 제공하지만, 중요한 과제 중 하나는 능동 내보내기와 수동 내보내기를 구별하는 것입니다. 충분히 높은 농도에서 miRNA를 과발현하면 miRNA의 내보내기가 변경되어 잠재적으로 부적절한 수동 로딩이 발생할 수 있으므로 주의해야 합니다. 따라서 miRNA의 최적 transfection 농도를 결정하기 위한 실험은 선택적 내보내기를 연구하는 동안 매우 중요합니다.
또한, 이 프로토콜은 나노 입자 추적 분석(NTA)과 같은 보완 기술과 결합될 때 연구자가 miRNA 방출을 평가하는 동시에 EV 입자 수를 평가할 수 있도록 하며 EV 생물 발생 경로와 miRNA 내보내기 메커니즘의 변경을 구별할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이것은 이러한 과정들(17)의 중첩되는 매개자들 때문에 특히 중요하다. miRNA가 EV 생물 발생에 관여하는 일부를 포함하여 다양한 표현형에 영향을 미칠 수 있다는 점을 고려할 때, miRNA의 transfection 후 입자 수를 평가하는 것이 현명할 것입니다18. 이 장애물을 극복하기 위한 또 다른 옵션은 실험 조건에서 변경되지 않은 상태로 유지되는 EV-miRNA를 통합하여 EV-miRNA 내보내기와 관련된 경로를 강조하면서 EV 생물 발생과 관련된 요인을 배제하는 것입니다.
여러 연구에서 내인성 miRNA 정량을 위한 표준 방법인 qRT-PCR을 사용하여 miRNA를 정량화했습니다 10,11,16. 그러나 miRNA를 EV로 방출하는 것을 동적으로 포착할 수 있는 기능이 부족합니다. 유세포 분석과 qRT-PCR을 비교할 때 분석 감도와 설계에 따라 크게 다릅니다. qRT-PCR은 매우 민감한 기술이며 이론적으로 최소 miRNA 복제 수를 정량화할 수 있지만, 두 샘플을 구별하려면 관심 miRNA의 복제 수에 최소 2배(100%) 차이가 필요합니다. 반면, 유세포 분석은 형광 표지된 miRNA의 풍부함을 기반으로 신호 기반 차이를 포착하고 신호의 작은 백분율 변화를 구별할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 낮은 감도는 제한된 복제 수를 가진 miRNA의 검출을 제한합니다. 두 기술은 프로토콜에 표시된 대로 함께 사용할 때 시너지 효과를 발휘하여 서로를 보완합니다.
요약하면, 이 프로토콜은 선택적 miRNA 내보내기 역학을 조사하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 앞서 언급한 어려움에도 불구하고 이 프로토콜의 강점은 여러 miRNA를 동시에 분석할 수 있는 능력에 있으며, miRNA 생물학, 수출 및 EV 생물학에서의 역할에 대한 더 나은 이해에 기여합니다. 고려해야 할 프로토콜의 주요 강점과 약점은 표 1에 나열되어 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
Purdue University의 유세포 분석 핵심 시설 책임자인 Jill Hutchcroft 박사의 지원과 조언에 감사드립니다. 이 연구는 R01CA226259 및 A.L.K.의 R01CA205420, A.L.K.에 대한 미국 폐 협회 혁신상(ANALA2023) IA-1059916, 퍼듀 공유 자원 시설 보조금 P30CA023168, 미국 국무부가 H.H.에 수여하는 플래그십 풀브라이트 박사 장학금의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
References
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