Overview
Este vídeo descreve uma técnica para testar rapidamente um único nematoide para um marcador genético por triagem PCR. No protocolo de exemplo, nós examinamos para edição de genoma baseada em CRISPR.
Protocol
O protocolo a seguir é um trecho de Prior et al, A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018).
PCR e Genotipagem de Worm Único
- Após 1 - 2 dias de colocação de ovos, transfira o F1s para tampas individuais de tubo de tira PCR contendo 7 μL de Worm Lysis Buffer usando uma picareta de worm(Tabela 1, Figura 1D, dia 4 - 5).
- Centrífuga tubos PCR em velocidade máxima de 1 minuto à temperatura ambiente para trazer animais para o fundo do tubo, e congelar tubos a -80 °C por 1 h.
NOTA: Os vermes podem ser armazenados a -80 °C indefinidamente. - Vermes congelados lyse em um termociclador usando o seguinte programa: 60 °C para 60 min, 95 °C para 15 min, 4 °C de espera.
- Configuração do mastermix pcr como mostrado na Tabela 2.
- Adicione 21 μL de PCR mastermix em tubos PCR limpos e, em seguida, adicione 4 μL de lise de vermes a partir da etapa 3. Misture bem usando uma pipeta e execute o programa PCR seguindo as diretrizes dos fabricantes (ver Tabela de Materiais).
- Purifique as reações do PCR usando um kit DE DNA Limpo e Concentrado, seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). DNA elute adicionando 10 μL de água à coluna de giro.
- Configuração de enzimas de restrição de configuração mastermix como mostrado na Tabela 3.
- Adicione 10 μL da enzima de restrição mastermix a cada reação pcr limpa e incubar por 1 - 2 h a 37 °C.
- Produtos PCR digeridos separados em um gel de 1,5% agarose executado a 120 V usando 1x Tris-acetato-EDTA (TAE).
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Representative Results
Figura 1. Engenharia CRISPR-Cas9 dolócus C. eleganssod-1. (A) Ilustração esquemática representando a estrutura exon-intron do lócus sod-1 em C. elegans. A barra vermelha denota a localização do G93 no exon 3. O conjunto de pares de primer é notado pelas setas vermelhas (F1-R1). (B) Alinhamento sequencial das proteínas humanas e C. elegans (verme) SOD-1. O resíduo G93 direcionado é destacado em vermelho. (C) Topo, uma seção de DNA genômico em torno do códon G93 é mostrada como referência, e os locais pam (verde) e sgRNA target (azul) são destacados. Na parte inferior, o modelo de oligonucleotídeo único de oligonucleotídeo (ssODN) é mostrado contendo: a edição do codon edit mudando G93 para A93, uma mudança silenciosa para o motivo PAM para evitar o decote pelo complexo sgRNA-Cas9, uma mudança silenciosa para introduzir um local de enzima de restrição hindiii único (caixa amarela) e flanqueamento de 5' e 3' 50 bp homologia (barras pretas). Todas as alterações de nucleotídeos projetadas no ssODN são destacadas em vermelho. (D) Ilustração esquemática do gasoduto para geração e identificação de mutantes de ponto baseados em CRISPR-Cas9 RNP. No dia 0, injete 10 - 15 P0 animais com mistura de injeção. No dia 2 - 3, identifique com sucesso animais P0 injetados por aqueles que contêm progênero F1 fluorescente, e selecione três placas P0 com a prole mais fluorescente. De cada uma das três placas P0, prole f1 fluorescente única 8. No dia 4 - 5, (a) passo 1, f1s individuais são colhidos e colocados em tubos PCR contendo Tampão de Lysis; b Etapa 2, após o congelamento a -80 °C, os tubos PCR contendo vermes F1 são líscidos para liberar DNA genômico, que é usado como modelo PCR. Os produtos PCR são então limpos e digeridos com a enzima de restrição única; c O passo 3, os produtos digeridos enzimados são resolvidos em um gel de agarose onde animais do tipo selvagem (+++), heterozigos (m/+) e homozigos (m/m) podem ser identificados por padrões de banda de digestão de restrição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Reagente | [Final] |
HCO | 50 mM |
Tris-HCl pH 8.3 | 10 mM |
MgCl2 | 2,5 mM |
NP-40 | 0.45% |
Tween-20 | 0.45% |
Proteinase K | 1 mg/mL |
Mesa 1. Receita tampão de lysis worm. Proteinase K deve ser adicionado fresco antes de cada uso.
Reagente | 1x | 24x |
2X Q5 Mastermix | 12,5 μL | 300 μL |
Primer F1 (10 μM) | 1,25 μL | 30 μL |
Primer R1 (10 μM) | 1,25 μL | 30 μL |
Lysis-de-verme | 4 μL | ---- |
ddH2O | 6 μL | 144 μL |
Final Volume | 25 μL | 504 μL |
Mesa 2. PCR Mastermix. O mastermix pcr deve ser bem misturado por pipetação até que a solução seja homogênea. 21 μL do maçodo PCR deve ser adicionado aos tubos PCR limpos e, em seguida, 4 μL de lysato de vermes individuais devem ser adicionados a tubos devidamente rotulados.
Reagente | 1x | 24x |
Tampão de enzima 10X | 2 μL | 48 μL |
Reação de PCR Limpo | 10 μL | ---- |
ddH2O | 7 μL | 168 μL |
Enzima de restrição (10 U/μL) | 1 μL | 24 μL |
Final Volume | 20 μL | 240 μL |
Mesa 3. Enzima de restrição Mastermix. A enzima de restrição mastermix deve ser bem misturada por pipetação até que a solução seja homogênea. 10 μL da enzima de restrição mastermix deve ser adicionado a 10 μL de produto PCR limpo.
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
KCl | Sigma | P5405 | |
DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
Proteinase K | Sigma | P2308 | |
MgCl2 | Sigma | M2393 | |
NP-40 | Sigma | 74385 | |
Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |