Overview
וידאו זה מתאר טכניקה לסנן במהירות נמטודה אחת עבור סמן גנטי על ידי הקרנת PCR. בפרוטוקול לדוגמה, אנו מסננים לעריכת גנום מבוסס CRISPR.
Protocol
הפרוטוקול הבא הוא קטע מתוך Prior et al, צינור מהיר ומפואר ליצירת מוטנטים של נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR /Cas9 ריבונוקלאופרוטאינים, J. Vis. Exp. (2018).
PCR של תולעת יחידה וגנוטיפינג
- לאחר 1 - 2 ימים של הטלת ביצים, להעביר את F1 sלתוך כובעי צינור רצועת PCR בודדים המכילים 7 μL של מאגר תולעת תמוגה באמצעות בחירת תולעת(טבלה 1, איור 1D,יום 4 - 5).
- צינורות PCR צנטריפוגה במהירות מקסימלית במשך 1 דקות בטמפרטורת החדר להביא בעלי חיים לתחתית הצינור, ולהקפיא צינורות ב -80 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה.
שים לב: תולעים ניתן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס ללא הגבלת זמן. - Lyse תולעים קפואות בתרמוציקלר באמצעות התוכנית הבאה: 60 °C (60 °F) במשך 60 דקות, 95 °C (70 °F) במשך 15 דקות, 4 °C (60 °F).
- הגדרת PCR Mastermix כפי שמוצג בטבלה 2.
- הוסף 21 μL של PCR mastermix לתוך צינורות PCR נקיים, ולאחר מכן להוסיף 4 μL של תמוגה תולעת משלב 3. מערבבים היטב באמצעות פיפטה ולהפעיל תוכנית PCR בעקבות הנחיות היצרנים (ראה טבלת חומרים).
- לטהר תגובות PCR באמצעות ערכת DNA נקי ותרכיז, בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). דנ"א אלוט על ידי הוספת 10 מים μL לעמוד ספין.
- הגדרת אנזים אנזים מאסטרמיקס כפי שמוצג בטבלה 3.
- הוסף 10 μL של mastermix אנזים ההגבלה לכל תגובת PCR ניקה דגירה עבור 1 - 2 שעות ב 37 °C (69 °F).
- מוצרי PCR מעוכלים נפרדים על ג'ל agarose 1.5% לרוץ ב 120 V באמצעות 1x Tris-אצטט-EDTA (TAE) מאגר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1. הנדסת CRISPR-Cas9 של לוקוס C. eleganssod-1. (A) איור סכמטי המתאר את מבנה האקסון-אינטרונים של הלוקוס סוד-1 ב- C. elegans. הסרגל האדום מציין את המיקום של G93 באקסון 3. ערכת זוג פריימר מצוין על ידי החצים האדומים (F1-R1). (B) יישור רצף של חלבונים אנושיים ו- C. elegans (תולעת) SOD-1. שאריות G93 הממוקדות מודגשות באדום. (C) למעלה, קטע של DNA גנומי המקיף את קודון G93 מוצג כנקודת התייחסות, ואתרי יעד PAM (ירוק) ו sgRNA (כחול) מסומנים. תחתון, תבנית התיקון המכוונת היחידה של oligonucleotide (ssODN) מוצגת המכילה: עריכת קודון משנה G93 ל- A93, שינוי שקט במוטיב PAM כדי למנוע מחשוף על ידי קומפלקס sgRNA-Cas9, שינוי שקט כדי להציג אתר ייחודי אנזים הגבלה HindIII (תיבה צהובה), ואיגוף 5 ' ו 3 ' 50 bp זרועות הומאולוגיה (פסים שחורים). כל שינויי הנוקלאוטידים שעוצבו ב- ssODN מסומנים באדום. (D) איור סכמטי של הצבר לייצור וזיהוי מוטנטים מבוססי נקודה מבוססי CRISPR-Cas9 RNP. ביום 0, להזריק 10 - 15 P 0 בעלי חיים עםתערובת הזרקה. ביום 2 - 3, לזהות בהצלחה מוזרק P0 בעלי חיים על ידי אלה המכילים פלואורסצנט F1 צאצאים, ובחר שלוש צלחות P0 עם הצאצאים הפלואורסצנטיים ביותר. מכל אחת משלושצלחות P 0, יחיד 8 פלואורסצנט F1 צאצאים. ביום 4 - 5, (א) שלב 1, F1 sבודדים נבחרים ומוצבים לתוך צינורות PCR המכילים מאגר תמוגה; (ב) שלב 2, לאחר הקפאה ב -80 מעלות צלזיוס, צינורות PCR המכילים תולעי F1 הם lysed לשחרר DNA גנומי, אשר משמש כתבנית PCR. לאחר מכן, מוצרי PCR מנוקים ומתעכלים עם אנזים ההגבלה הייחודי; (ג) שלב 3, מוצרים מתעכלים אנזים נפתרים על ג'ל agarose שבו סוג פראי (+/+), הטרוזיגוס (m /+), ו homozygous (m /m) בעלי חיים ניתן לזהות על ידי הגבלה עיכול דפוסי רצועות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| מגיב | [סופי] |
| KCl | 50 מ"מ |
| טריס-HCl pH 8.3 | 10 מ"מ |
| מ"ג-קל2 | 2.5 מ"מ |
| NP-40 | 0.45% |
| טווין-20 | 0.45% |
| פרוטאין קיי | 1 מ"ג/מ"ל |
שולחן 1. מתכון מאגר תמוגה תולעת. יש להוסיף פרוטאין K טרי לפני כל שימוש.
| מגיב | פי 1 | 24x |
| 2X Q5 מאסטרמיקס | 12.5 מיקרו-ל | 300 μL |
| פריימר F1 (10 מיקרומטר) | 1.25 μL | 30 μL |
| פריימר R1 (10 מיקרומטר) | 1.25 μL | 30 μL |
| תולעת תמוגה | 4 μL | ---- |
| ddH2O | 6 מיקרומטר | 144 μL |
| עוצמת קול סופית | 25 μL | 504 מיקרו-ל |
שולחן 2. PCR מאסטרמיקס. MASTERMIX PCR צריך להיות מעורבב היטב על ידי pipetting עד הפתרון הוא הומוגני. 21 μL של MASTERMIX PCR יש להוסיף צינורות PCR נקיים, ולאחר מכן 4 μL של ליזל תולעת בודדים יש להוסיף צינורות שכותרתו כראוי.
| מגיב | פי 1 | 24x |
| מאגר אנזימים פי 10 | 2 מיקרומטר | 48 μL |
| תגובת PCR נקייה | 10 μL | ---- |
| ddH2O | 7 μL | 168 מיקרו-ל |
| אנזים הגבלה (10 U /μL) | μL אחד | 24 μL |
| עוצמת קול סופית | 20 μL | 240 μL |
שולחן 3. הגבלת אנזים מאסטרמיקס. אנזים ההגבלה mastermix צריך להיות מעורבב היטב על ידי pipetting עד הפתרון הוא הומוגני. 10 μL של mastermix אנזים ההגבלה יש להוסיף 10 μL של מוצר PCR ניקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
