Overview
此视频描述了通过 PCR 筛查快速筛选单个线虫以获得遗传标记的技术。在示例协议中，我们筛选基于 CRISPR 的基因组编辑。
Protocol
以下协议是从Prior等人的摘录，一个快速和快速的管道产生基因组点突变体在C.埃莱甘使用CRISPR/Cas9核蛋白，J.Vis.Exp.(2018).
单蠕虫 PCR 和基因型
- 在1 - 2天的产卵后，使用蠕虫选择（表1，图1D，第4-5天）将F1转移到含有7μL蠕虫裂解缓冲器的单个PCR条状管帽中。
- 离心PCR管在室温下以最高速度1分钟，将动物带到管底，并在-80°C下冷冻管1小时。
注： 蠕虫可以无限期地储存在-80°C。 - 使用以下程序在恒温器中使用 Lyse 冷冻蠕虫：60 °C 60 分钟，95 °C 15 分钟，4 °C 保持。
- 设置 PCR 主混合，如表2所示。
- 将 21μL 的 PCR 主混合添加到干净的 PCR 管中，然后从步骤 3 中添加 4 μL 的蠕虫裂解。使用移液器混合好，按照制造商指南运行 PCR 程序（参见材料表）。
- 按照制造商的说明（参见材料表）使用脱氧核糖核酸清洁和浓缩工具包净化 PCR 反应。通过在旋转柱中加入 10 μL 水来稀释 DNA。
- 设置限制酶主混合如表3所示。
- 在每个清洁的 PCR 反应中加入 10 μL 的限制酶主混合，在 37 °C 下孵育 1 - 2 小时。
- 使用 1x 三酯-醋酸盐-EDTA （TAE） 缓冲器，在 120 V 的 1.5% agarose 凝胶上单独消化的 PCR 产品。
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Representative Results
图1。克里斯普 - 卡斯 9 工程的C. 埃莱甘索德 - 1 轨迹。（A） 描绘C.elegans中Sd-1轨迹的外因特龙结构的示意图图。红色条表示 G93 在 exon 3 中的位置。红色箭头 （F1-R1） 会注意到引物对集。（B） 人类和C. elegans （蠕虫） SOD-1 蛋白质的序列对齐。目标 G93 残留物以红色突出显示。（C）顶部，显示围绕 G93 科顿的基因组 DNA 部分作为参考，并突出显示 PAM（绿色）和 sgRNA 目标（蓝色）位点。底部，单搁浅的寡核苷酸（ ssODN ）同源定向修复（ HDR ）模板显示包含： codon 编辑更改 G93 到 A93 ，无声更改 PAM 图案以防止 sgRNA - Cas9 复合物的，无声更改引入独特的印地语限制酶站点（黄色框），侧翼 5 ' 和 3 ' 50 bp 同源臂（黑条）。ssODN 中设计的所有核苷酸变化均为红色突出显示。（D） 用于生成和识别CRISPR-Cas9 RNP点突变体的管道示意图图。在第 0 天，注射 10 - 15 P0动物与注射混合。在第 2 天 - 第 3 天，确定含有荧光 F1后代的动物成功注射 P0动物，并选择三个荧光后代最多的 P0板。从三个P0板，单8荧光F1后代。在第 4 - 5 天，（a） 步骤 1，单个 F1s 被拾取并放入包含裂解缓冲区的 PCR 管中：（b） 步骤 2，在 -80 °C 冻结后，含有 F1蠕虫的 PCR 管被解冻以释放基因组 DNA，用作 PCR 模板。然后用独特的限制酶清洗和消化PCR产品：（c） 第 3 步，酶消化产品在一种糖凝胶上解决，其中通过限制消化带状模式可以识别野生类型 （+/+）、异质 （m/+） 和同源（m/m） 动物。请单击此处查看此图的更大版本。
| 试剂 | [最终] |
| 氯化钾 | 50米 |
| 特里斯 - 赫克 ph 8.3 | 10米 |
| 毫克2 | 2.5 米 |
| NP-40 | 0.45% |
| 补间-20 | 0.45% |
| 蛋白酶 K | 1毫克/升 |
表1。蠕虫裂解缓冲器配方。每次使用前应新鲜添加蛋白酶 K。
| 试剂 | 1x | 24倍 |
| 2X 第 5 季度主混音 | 12.5 微升 | 300μL |
| 引物 F1 （10μM） | 1.25 微升 | 30 微升 |
| 引号 R1 （10μM） | 1.25 微升 | 30 微升 |
| 蠕虫裂解 | 4μL | ---- |
| 德赫2O | 6 微升 | 144 微升 |
| 最终卷 | 25 微升 | 504 微升 |
表2。PCR主混音。 PCR 主混合应通过管道混合良好，直到解决方案是均匀的。21 μL 的 PCR 主混合应添加到清洁的 PCR 管中，然后应将 4 μL 的单独蠕虫乳酸酯添加到正确标记的管中。
| 试剂 | 1x | 04: |
| 10X 酶缓冲区 | 2μL | 48 微升 |
| 清洁的 PCR 反应 | 10 微升 | ---- |
| 德赫2O | 7 微升 | 168 微升 |
| 限制酶 （10 U/μL） | 1μL | 24 微升 |
| 最终卷 | 20 微升 | 240 微升 |
表3。限制酶主混合。 限制酶主混合应通过管道很好地混合，直到溶液是均匀的。限制酶主混合的 10 μL 应添加到 10 μL 的清洁 PCR 产品中。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
