Single Worm PCR: En metode til at udtrække og forstærke genomisk DNA

Overview

Denne video beskriver en teknik til hurtigt at screene en enkelt nematode for en genetisk markør ved PCR screening. I eksempelprotokollen screener vi for CRISPR-baseret genomredigering.

Protocol

Følgende protokol er et uddrag fra Prior et al, A Rapid og Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018).

Pcr og genotyping med en enkelt orm

1. Efter 1 - 2 dages æglægning overføres F_1'ernetil individuelle PCR-båndrørhætter, der indeholder 7 μL Worm Lysis Buffer ved hjælp af et ormeplukke (Tabel 1, Figur 1D, dag 4 - 5).
2. Centrifuge PCR-rør ved maksimal hastighed i 1 min ved stuetemperatur for at bringe dyr til rørbunden og fryserør ved -80 °C i 1 time.
   BEMÆRK: Orme kan opbevares ved -80 °C på ubestemt tid.
3. Lyse frosne orme i en termocykel ved hjælp af følgende program: 60 °C i 60 min, 95 °C i 15 min.
4. Opsætning af PCR-mastermix som vist i tabel 2.
5. Der tilsættes 21 μL PCR mastermix til rene PCR-rør, og derefter tilsættes 4 μL orme lysis fra trin 3. Bland godt ved hjælp af en pipette, og kør PCR-programmet i nedenstående retningslinjer (se materialetabel ).
6. Rense PCR-reaktioner ved hjælp af et DNA Clean and Concentrate-sæt ved at følge producentens anvisninger (se materialetabel ). Elute DNA ved at tilsætte 10 μL vand til spinkolonnen.
7. Set-up restriction enzyme mastermix som vist i tabel 3.
8. Der tilsættes 10 μL af restriktionsenzymmastermix til hver renset PCR-reaktion og inkuberes i 1 - 2 timer ved 37 °C.
9. Separate fordøjede PCR-produkter på en 1,5% agarose gel kører ved 120 V ved hjælp af 1x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffer.

Representative Results

Figur 1. CRISPR-Cas9 ingeniørarbejde afC. eleganssod-1 locus. (A) Skematisk illustration, der viser den exon-intron struktur af sod-1 locus i C. elegans. Den røde bjælke angiver placeringen af G93 i exon 3. Primerparsættet bemærkes af de røde pile (F1-R1). (B) Sekvensjustering af humane og C. elegans (orm) SOD-1 proteiner. Den målrettede G93-rest er fremhævet med rødt. (C) Top, en del af genomisk DNA omkring G93 codon er vist som en reference, og PAM (grøn) og sgRNA mål (blå) steder er fremhævet. Nederstvises den enkeltstrengede oligonukleotid (ssODN) homologi rettet reparationsskabelon (HDR), der indeholder: codon-redigeringen, der ændrer G93 til A93, en tavs ændring af PAM-motivet for at forhindre kavalergang af sgRNA-Cas9-komplekset, en tavs ændring for at introducere et unikt hindIII-begrænsningsenzymsted (gul boks) og flankerende 5' og 3' 50 bp homologiarme (sorte bjælker). Alle nukleotidændringer, der er designet i ssODN, fremhæves rødt. (D) Skematisk illustration af rørledningen til generering og identifikation af CRISPR-Cas9 RNP-baserede punktmutanter. På dag 0 injiceres 10 - 15 P₀ dyr med injektionsblanding. På dag 2 - 3 skal du med succes identificere injicerede P_0-dyr af dem, der indeholder fluorescerende F_1-afkom, og vælge tre P_0-plader med det mest fluorescerende afkom. Fra hver af de tre P₀ plader, enkelt 8 fluorescerende F₁ afkom. På dag 4 - 5, (a) trin 1, plukkes og placeres individuelle F_1'eri PCR-rør, der indeholder Lysis Buffer; b) Efter frysning ved -80 °C af trin 2 lyses PCR-rør, der indeholder F_1-orme, for at frigøre genomisk DNA, der anvendes som PCR-skabelon. PCR-produkterne rengøres og fordøjes derefter med det unikke restriktionsenzym; c) trin 3, enzymfordre fordøjede produkter løses på en agarosegel, hvor vilde dyr af typen (+/+), heterozygogous (m/+) og homozygogous (m/m) kan identificeres ved hjælp af begrænsningsforyndelsesbåndmønstre. Klik her for at se en større version af dette tal. 

Reagens	[Endelig]
KCl	50 mM
Tris-HCl pH 8,3	10 mM
MgCl2	2,5 mM
NP-40	0.45%
Mellem-20	0.45%
Proteinase K	1 mg/mL

Tabel 1. Worm Lysis Buffer Opskrift. Proteinase K bør tilsættes frisk før hver brug.

Reagens	1x	24x
2X Q5 Mastermix	12,5 μL	300 μL
Primer F1 (10 μM)	1,25 μL	30 μL
Primer R1 (10 μM)	1,25 μL	30 μL
Orm Lysis	4 μL	----
ddH2O	6 μL	144 μL
Sidste bind	25 μL	504 μL

Tabel 2. PCR Mastermix. PCR mastermix skal blandes godt ved pipettering, indtil opløsningen er homogen. Der bør tilsættes 21 μL pcr mastermix til rene PCR-rør, og derefter tilsættes 4 μL individuelt ormelysat til korrekt mærkede rør.

Reagens	1x	24x
10X enzymbuffer	2 μL	48 μL
Renset PCR-reaktion	10 μL	----
ddH2O	7 μL	168 μL
Restriktionsenzym (10 U/μL)	1 μL	24 μL
Sidste bind	20 μL	240 μL

Tabel 3 . Restriktion Enzym Mastermix. Restriktionsenzym mastermix bør blandes godt ved pipettering, indtil opløsningen er homogen. 10 μL af restriktionsenzymmastermix bør tilsættes 10 μL renset PCR-produkt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nuclease-free water	Synthego Inc.	provided with the sgRNA kit EZ kit
KCl	Sigma	P5405
DNA Clean & Concentrator	Zymo Research	D4004
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit	Zymo Research	D4002
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix	New England Biolabs	M0494L
Proteinase K	Sigma	P2308
MgCl2	Sigma	M2393
NP-40	Sigma	74385
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
RNaseZap Decontamination Solution	Fisher Scientific	AM9780