PCR à ver unique : une méthode pour extraire et amplifier l’ADN génomique

Overview

Cette vidéo décrit une technique pour dépister rapidement un nématode unique pour un marqueur génétique par dépistage PCR. Dans le protocole d’exemple, nous dépisterons l’édition du génome basée sur CRISPR.

Protocol

Le protocole suivant est un extrait de Prior et coll ., A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018).

PCR à ver unique et génotypage

1. Après 1 à 2 jours de ponte, transférer le F₁s dans des bouchons individuels de tubes à bande PCR contenant 7 μL de tampon de lyse de ver à l’aide d’un pic de ver(tableau 1, figure 1D, jour 4 - 5).
2. Centrifugeuses tubes PCR à vitesse maximale pendant 1 min à température ambiante pour amener les animaux au fond du tube, et congeler les tubes à -80 °C pendant 1 h.
   REMARQUE: Les vers peuvent être stockés à -80 °C indéfiniment.
3. Lyse vers congelés dans un thermocycleur en utilisant le programme suivant: 60 °C pendant 60 min, 95 °C pendant 15 min, 4 °C tenir.
4. Configurer le mastermix PCR tel qu’il est indiqué dans le tableau 2.
5. Ajouter 21 μL de mastermix PCR dans des tubes PCR propres, puis ajouter 4 μL de lyse de ver à partir de l’étape 3. Bien mélanger à l’aide d’une pipette et exécuter le programme PCR en suivant les lignes directrices des fabricants (voir tableau des matériaux).
6. Purifier les réactions PCR à l’aide d’un kit ADN Clean and Concentrate, en suivant les instructions du fabricant (voir tableau des matériaux). Elute ADN en ajoutant 10 μL d’eau à la colonne de spin.
7. Configurer l’enzyme de restriction mastermix comme le montre le tableau 3.
8. Ajouter 10 μL de l’enzyme de restriction mastermix à chaque réaction PCR nettoyée et incuber pendant 1 à 2 h à 37 °C.
9. Produits PCR digérés séparés sur un gel d’agarose de 1,5% exécuté à 120 V utilisant 1x Tris-acétate-EDTA (TAE) tampon.

Representative Results

Figure 1. CRISPR-Cas9 ingénierie dulocus C. eleganssod-1. (A) Illustration schématique représentant la structure exon-intron du locus sod-1 dans C. elegans. La barre rouge indique l’emplacement du G93 dans l’exon 3. L’ensemble de paire d’amorce est noté par les flèches rouges (F1-R1). (B) Alignement des séquences des protéines SOD-1 humaines et C. elegans (ver). Les résidus ciblés du G93 sont mis en évidence en rouge. (C) Haut, une section de l’ADN génomique entourant le codon du G93 est montrée comme référence, et les sites cibles PAM (vert) et sgRNA (bleu) sont mis en évidence. Enbas, l’oligonucléotide échoué unique (ssODN) modèle de réparation dirigée (HDR) est montré contenant: le codon modifier le G93 à A93, un changement silencieux au motif PAM pour prévenir le clivage par le complexe sgRNA-Cas9, un changement silencieux pour introduire un site unique d’enzymes de restriction HindIII (boîte jaune), et flanquant 5' et 3' 50 bp homologie bras (barres noires). Tous les changements nucléotides conçus dans le ssODN sont mis en évidence en rouge. (D) Illustration schématique du pipeline pour la génération et l’identification des mutants à base de RNP CRISPR-Cas9. Le jour 0, injecter 10 - 15 P_{0 animaux avec} mélange d’injection. Le jour 2 - 3, identifiez avec succès les animaux P₀ injectés avec succès par ceux qui contiennent la descendance fluorescente F_1, et sélectionnez trois plaques P₀ avec la progéniture la plus fluorescente. De chacune des trois plaques P_0, 8 descendance F₁ fluorescente. Le jour 4 - 5, a) étape 1, les F₁individuels sont ramassés et placés dans des tubes PCR contenant Lysis Buffer; b) l’étape 2, après congélation à -80 °C, les tubes PCR contenant des vers F₁ sont lysés pour libérer l’ADN génomique, qui est utilisé comme modèle PCR. Les produits PCR sont ensuite nettoyés et digérés avec l’enzyme de restriction unique; c) l’étape 3, les produits digérés enzymatiques sont résolus sur un gel d’agarose où les animaux sauvages (+/+), hétérozygotes (m/+) et homozygotes (m/m) peuvent être identifiés par des modèles de baguage de digestion de restriction. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 

Réactif	[Finale]
Kcl	50 mM
Tris-HCl pH 8,3	10 mM
MgCl2 (mgCl2)	2,5 mM
NP-40 (en)	0.45%
Préadolescent-20	0.45%
Proteinase K	1 mg/mL

Tableau 1. Recette tampon de lyse de ver. Proteinase K doit être ajouté frais avant chaque utilisation.

Réactif	1x (1x)	24x (24x)
Mastermix 2X Q5	12,5 μL	300 μL
Amorce F1 (10 μM)	1,25 μL	30 μL
Amorce R1 (10 μM)	1,25 μL	30 μL
Lyse de ver	4 μL	----
ddH2O (en)	6 μL	144 μL
Final Volume	25 μL	504 μL

Tableau 2. Mastermix PCR. Le mastermix PCR doit être bien mélangé par pipetage jusqu’à ce que la solution soit homogène. 21 μL du mastermix PCR doivent être ajoutés aux tubes PCR propres, puis 4 μL de lysate de ver individuel doivent être ajoutés à des tubes correctement étiquetés.

Réactif	1x (1x)	24x (24x)
Tampon enzymatique 10X	2 μL	48 μL
Réaction pcr nettoyée	10 μL	----
ddH2O (en)	7 μL	168 μL
Restriction Enzyme (10 U/μL)	1 μL	24 μL
Final Volume	20 μL	240 μL

Tableau 3. Restriction Enzyme Mastermix. L’enzyme de restriction mastermix doit être bien mélangée par pipetting jusqu’à ce que la solution soit homogène. 10 μL de l’enzyme de restriction mastermix doivent être ajoutés à 10 μL de produit PCR nettoyé.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nuclease-free water	Synthego Inc.	provided with the sgRNA kit EZ kit
KCl	Sigma	P5405
DNA Clean & Concentrator	Zymo Research	D4004
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit	Zymo Research	D4002
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix	New England Biolabs	M0494L
Proteinase K	Sigma	P2308
MgCl2	Sigma	M2393
NP-40	Sigma	74385
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
RNaseZap Decontamination Solution	Fisher Scientific	AM9780